抑制Nix蛋白表达的siRNA及其应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种抑制Nix蛋白表达的siRNA及其应用。[0002]背景资料[0003]心衰由于其发病率高(0.9%)，死亡率高(50%)，目前已成为严重危害健康的世界性难题。心脏重塑是心衰发病和死亡的重要原因，高血压、肾上腺素受体激动是促进心脏重塑发生发展的重要因素。心脏重塑的细胞病理学特征为心肌细胞肥大与死亡，心脏成纤维细胞增殖与基质蛋白合成分泌的增加。以往研究的焦点主要集中于心肌细胞肥大和凋亡的预防和逆转，近年来，对心脏纤维化的研究越来越受到人们的关注。已经表明抑制纤维化可以有效地控制心脏功能的下降，起到控制和延缓心衰的作用。[0004]1998年发现的Nix蛋白由于其在压力超负荷导致的心脏肥厚中转录上调而引起广泛关注，在高血压致心肌肥厚的研究中，靶向心肌细胞转基因过表达和基因敲除Nix实验表明其在高血压导致的心功能障碍、心衰的进程中具有重要的作用。而在对其机制的相关探讨中，发现它主要通过两条通路调控心肌细胞的死亡，从而参与了高血压致心功能障碍的发生发展。但在心脏细胞中，心肌细胞数目不足三分之一，而非心肌细胞中百分之九十以上为成纤维细胞，心脏成纤维细胞增殖与基质蛋白合成分泌的增加是心脏重塑、心衰发生发展的主要病理学特征。在高血压致心衰进程中，以往研究仅关注了 Nix对心肌细胞死亡的影响，而Nix与心脏成纤维细胞的关系及其在心脏成纤维细胞中的作用还未见报道。此外，目前也并没有发现针对Nix对抗心脏重塑的相关技术。[0005]基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺病毒载体是基因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点。以腺病毒为载体的药物大部分应用于治疗恶性肿瘤，也将可能应用于各种疾病的治疗。
[0006]本发明的第一个目的在于提供一种抑制Nix蛋白表达的siRNA。[0007]本发明的第二个目的在于提供一种表达载体，其含有上述siRNA。[0008]本发明的第三个目的在于提供上述siRNA和表达载体在制备抗心肌纤维化的药物中的应用。
[0009]实现本发明的技术方案如下:
[0010]一种抑制Nix蛋白表达的siRNA，其正义链序列为序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其反义链序列为序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0011]正义链:5’to3’ GGCCUAGACAUACAUGAAATT (SEQ ID N0.1)；
[0012]反义链:5’to3’ UUUCAUGUAUGUCUAGGCCTT (SEQ ID N0.2)。
[0013]上述siRNA在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。
[0014]一种表达载体,其包含上述siRNA。
[0015]所述表达载体为腺病毒载体。[0016]上述的表达载体在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。
[0017]本发明的抑制Nix蛋白表达的siRNA可以通过人工合成的方法制备。
[0018]本发明的优点或有益效果:本发明的siRNA能明显特异性抑制心脏成纤维细胞内Nix的表达，转染siRNA腺病毒后，明显抑制细胞周期的进程，来抑制心脏成纤维细胞的增殖，同时明显抑制细胞外基质蛋白的表达；进一步的siRNA腺病毒可以明显抑制NE诱导的Nix的表达，抑制NE诱导的心脏成纤维细胞增殖、细胞周期的进程和细胞外基质蛋白的表达，从而起到抗病理性纤维化的作用。



[0019]图1为siRNA抑制Nix的表达的结果；其中各标号代表:1:对照组；2:阴性对照的siRNA; 3 ；GAPDH-siRNA;4:393 位点的 siRNA ；5:545 位点的 siRNA ；6:1496 位点的 siRNA。
[0020]图2为荧光显微镜下Nix-siRNA腺病毒转染心脏成纤维细胞的结果。
[0021]图3为Nix-siRNA腺病毒对Nix表达的影响(*p〈0.05与对照组相比较)。
[0022]图4为Nix-siRNA腺病毒对细胞增殖的影响(*p〈0.05与对照组相比较)。
[0023]图5为Nix-siRNA腺病毒对细胞周期的影响。
[0024]图6为Nix-siRNA腺病毒对纤维连接蛋白和胶原蛋白表达的影响(*p〈0.05与对照组相比较)。
[0025]图7为高血压状态下Nix的表达及去甲肾上腺素的变化(*p〈0.05与对照组相比较)。
[0026]图8为Nix-siRNA腺病毒对NE诱导的Nix表达的影响(*p〈0.05与对照组相比较，#p〈0.05与NE组相比较)。
[0027]图9为Nix-siRNA腺病毒对NE诱导的细胞周期的影响。
[0028]图10为Nix-siRNA腺病毒NE诱导的纤维连接蛋白和胶原蛋白表达的影响(*ρ〈0.05与对照组相比较，#ρ<0.05与NE组相比较)。
图11为Nix-siRNA腺病毒NE诱导的纤维连接蛋白和胶原蛋白表达的影响(*ρ〈0.05与对照组相比较，#Ρ<0.05与NE组相比较)。

[0029]以下通过实施例对本发明进一步说明。
[0030]以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。
[0031]实施例1本发明的抑制Nix蛋白表达的siRNA的来源
[0032](I) Nix-siRNA 设计
[0033]从Nix蛋白的转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有义链I位为G或C，19位为A或U，有义链15~19至 少有3个A或U，或着13~19至少有5个A或U。
[0034]根据以下原则:GC含量在30% — 50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效；将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列及EST同源的序列。最后将靶点定位为393、545、1496三个位点进行化学合成siRNA。并合成阴性对照的 siRNA。
[0035]393 位点的 siRNA:正义链:5’ to3’ GGCAGAUCAUGUUUGAUGUTT ；
[0036]反义链:5’to3’ ACAUCAAACAUGAUCUGCCTT ；
[0037]545 位点的 siRNA:正义链:5’ to3’ CCCAAAGAGUUCCAUUUCATT ；
[0038]反义链:5，to3，UGAAAUGGAACYCYYYGGGTT；
[0039]1496 位点的 siRNA:正义链:5’ to3’ GGCCUAGACAUACAUGAAATT ；
[0040]反义链:5’to3’ UUUCAUGUAUGUCUAGGCCTT。
[0041]上述siRNA委托上海吉玛制药技术有限公司直接合成。
[0042](2) Nix-siRNA 的筛选
[0043]将上述合成的siRNA 用 Lipofectamine2000 (invitrogen)转入 NIH/3T3 细胞中，并选用GAPDH-siRNA作为阳性对照。具体操作步骤详见Lipofectamine2000( invitrogen)说明书。
[0044]将转染的细胞消化收集后提取细胞蛋白，进行Western blot检测Nix与GAPDH的表达。结果如图1所示，1496位点的siRNA可以明显抑制Nix的表达。
[0045]实施例2将1496位点的siRNA进行腺病毒包装
[0046]一、siRNA腺病毒载体的制备`
[0047]首先采用化学合成法合成含干扰序列的单链DNA oligo。然后于90°C水浴15min退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点(Age I与EcoR I )直接连入酶切后的RNAi腺病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证，测序结果经比对确认正确。阳性克隆即为构建成功的目的基因RNAi腺病毒载体。
[0048]具体操作如下:
[0049]1、采用化学合成法合成以下单链DNA oligo(上海吉凯基因有限公司合成):5， to3，
[0050]ccggcaGGCCTAGACATACATGAAActcgagTTTCATGTATGTCTAGGCCTGtttttg。
[0051]2、把上述合成的DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90°C水浴15min，然后自然冷却至室温，产生双链。
[0052]3、连接
[0053]通过T4DNA连接酶将双酶切(Age I与EcoR I)线性化的RNAi腺病毒载体GVl 19(上海吉凯基因有限公司)和上述DNA片段进行连接反应，连接后的产物进行转化实验。连接反应体系如下，于16°C连接过夜，连接产物(连接液)进行转化实验。
[0054]
镇劍体$〖(μ1)
线性化的载体DNA lOOng/μΙI
DNA oligo lOOng/μΙI
10*T4噬菌体DNA连接酶缓冲液2
了41俊菌体DNA连接酶I
ddH:015[0055]4、转化
[0056]感受态细胞的制备:
[0057]配置下述溶液:
[0058]I) 0.1M CaCl2 溶液，以 0.45 μ m 过滤除菌；
[0059]2)250mM KC12 溶液；
[0060]3) 2M MgCl2溶液，高压灭菌；
[0061]4) S0B:lml250mM KC12 溶液加入 100ml LB，以 5M NaOH 调 PH 值至 7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml2M MgCl2溶液。
[0062]用氯化钙制备新鲜的DH5a大肠杆菌感受态细胞:
[0063]I)从于37°C培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml SOB培养基的IL烧瓶中。于37°C剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300rpm)。
[0064]2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0°c。
[0065]3)于4°C，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
[0066]4)倒出培养液，将管倒置I分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
[0067]5)以IOml用冰预冷的0.1mol / L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
[0068]6)于4°C，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
[0069]7)倒出培养液，将管倒置I分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
[0070]8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.lmol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。
[0071]9)将细胞分装成小份，放于-70°C。
[0072]转化过程:
[0073]配置下述溶液:
[0074]l)250mM KC12 溶液；
[0075]2) 2M MgCl2溶液，高压灭菌；
[0076]3) SOB 培养基:lml250mM KC12 溶液加入 100ml LB,以 5M NaOH 调 PH 值至 7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml2M MgCl2溶液；
[0077]4) SOB 琼脂培养基:0.49396g MgS04.7H20 溶于 100mLSOB 培养基，加入 1.5g 琼脂粉，高压灭菌，冷至温度低于60°C，加入Amp至终浓度到100 μ g/ml，混匀铺板，一般90_直径平皿需要30-50ml培养基；
[0078]5) IM葡萄糖溶液，过滤除菌；
[0079]6) SOC培养基:2ml IM葡萄糖溶液加入100ml SOB培养基；
[0080]转化步骤:
[0081]I)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ I转移到无菌的微量离心管中，每管加2 μ I连接液,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30分钟。
[0082]2)将管放到预加温到42°C的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管，再快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。
[0083]3)每管加800μ1 SOC培养基。用水浴将培养基加温至37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育45分钟 使细菌复苏；将150 μ I已转化的感受态细胞转移到含20mmol /L MgS04和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。[0084]4)将平板置于室温直至液体被吸收，再倒置平皿，于37°C培养，16小时；
[0085]5)进行阳性克隆PCR。
[0086]5、阳性克隆的PCR鉴定
[0087]挑取转化子重悬于10 μ I LB溶液，混匀取I μ I作为模板；使用GVl 19通用引物(上海吉凯基因有限公司)，进行菌落PCR鉴定实验。
[0088]PCR鉴定体系和PCR程序:
[0089]