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专利名称
一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用制作方法
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发明者
史劲松, 张旦旦, 许正宏, 郭鸿飞
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公开日
2012年9月19日
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申请日期
2012年1月20日
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优先权日
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申请人
江南大学, 江苏博立生物制品有限公司
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文档编号
C12N9/62GK102676395SQ20121002049
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关键字
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权利要求
1.一株宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp. )M1223,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5335，保藏日期为2011年10月12日2.利用宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillussp. )M1223制备酸性蛋白的方法,其特征在于将菌株经斜面活化、液体种子培养、5L发酵罐深层液态发酵，发酵液经离心去菌体得到粗酶液；以酪蛋白为底物，上述粗酶液的最适作用温度为40°C，最适作用pH为3. O ;上述粗酶液在最适作用条件下能有效降解玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、细胞角蛋白
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技术领域
本发明涉及一株宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp. )M1223及其在制备酸性蛋白酶中的应用，属于微生物技术领域
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背景技术
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具体实施方式
实施例I 产酶菌株的筛选与诱变选育初筛在乳制品加工厂周围取土样Ig溶于50ml无菌水中，摇匀制成土壤悬液，将土壤悬液稀释不同倍数后取200 u I涂布于上述筛选培养基的固体平板中，培养2 3天后，挑取水解圈/直径大的几株单菌落进行划线分离，并保存于种子斜面培养基复筛将初筛得到的几株菌进行摇瓶复筛，摇瓶培养基为上述的发酵培养基，在30°C，200r/min，培养3 4天后测发酵液中酶活，得到产酶最高的一株菌命名为M12等离子束诱变以上述菌株为出发菌株，进行8个剂量的N+离子束诱变，诱变剂量分别为(20，40，60，80，100，150，200，300) *1014，经过平板初筛、摇瓶复筛得到产酶最高的一株突变株，命名为M1223实施例2 菌种鉴定取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌丝，按基因组抽提试剂盒提取基因组DNA并以真菌26S rDNA通用引物扩增得到约550bp产物，送上海生工生物技术工程有限公司测序，得26S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其属黑曲霉群(Aspergillusniger)，该菌在坂口氏培养基(NaNO2 15g/L，K2HPO41 g/L, KCl 0. 5g/L，MgSO4 0. 5g/L，FeSO40.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L)上生长，说明具有同化亚硝酸作用，显微镜下观察分生孢子头为黑色，根据黑曲霉群检索表确定其为黑曲霉群的宇佐美曲霉(Aspergillus sp.)M1223该菌现保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCC No. 5335，保藏日期为2011年10月12日实施例3 蛋白酶活性的测定蛋白酶酶活的测定采用国标工业用蛋白酶制剂测定方法(QB1805. 3-93)酶活单位的定义1ml液体酶，于40°C、pH3. 0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生I微克酪氨酸，即为I个酶活力单位，以U/ml表示实施例4 酸性蛋白酶酶学性质(I)温度对酶活性的影响相同反应体系，于30 100°C下分别测定该蛋白酶酶活力，得该酶最适作用温度为40°C(2)pH对酶活性的影响相同反应体系,在pH2_9下分别测该酶酶活,得该酶最适作用pH为3.0(3)蛋白酶分子量大小的测定将发酵得到的粗酶液通过SDS-PAGE电泳分析蛋白分子量，此酶分子量在45KD左右
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发明内容
本发明的目的是提供一株高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillus sp.)M1223，以其为生产菌株，利用深层液态发酵技术制备酸性蛋白酶，并初步探讨其对不同蛋白质的降解作用本发明提供的产酸性蛋白酶的菌株是从乳制品加工厂污泥中筛选得到，通过26S rDNA鉴定为黑曲霉菌群，结合生理生化鉴定确定为宇佐美曲霉，该菌种经等离子束诱变得到一株高产酸性蛋白的突变株，命名为(Aspergillus sp. )M1223,现保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 5335，保藏日期为2011年10月12日对该菌株的相关研究得到如下结论I.培养基筛选培养基(g/L)干酪素3，磷酸氢二钾I，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，蔗糖30，琼脂20g，PH自然种子培养基(g/L)硝酸钠3，磷酸氢二钾1，硫酸镁0. 5，氯化钾0. 5，硫酸亚铁0.01，蔗糖30，PH自然发酵培养基(g/L)豆饼粉30 100，玉米粉5 15，磷酸氢二钠2 5，氯化铵10 15，氯化钙2 5，PH自然2.培养条件种子培养条件以孢子接种，在含有30ml种子培养基的250ml摇瓶中，接种量105 6个孢子/ml，200r/min、30°C发酵培养2 3天摇瓶培养条件在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，接种量5% (V/V)，200r/min、30°C发酵培养3 4天5L罐发酵条件在含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量5% (V/V)，500r/min、通气量0. 8 lvvm, 30°C发酵培养3 4天3.粗酶性质(I)以酪蛋白为作用底物,该酶最适作用温度为40°C,最适作用pH为3. O(2)最适作用条件下,酶活性达到5600U/ml(3)该酶分子量在45KD左右本发明公开的宇佐美曲霉(Aspergil lus sp. )M1223通过液态深层发酵技术高产酸性蛋白酶，该酶可以在酸性条件下有效降解玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、细胞角蛋白等，在食品、酿造、皮毛处理等方面具有较好的应用潜力
专利名称：一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用的制作方法一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用宇佐美曲霉是黑曲霉的一种，工业上广泛用于酸性蛋白酶、木聚糖酶、糖化酶等的生产。蛋白酶是一类水解蛋白质的肽键、生成氨基酸及多肽的酶，根据作用条件的不同，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。酸性蛋白酶是酶制剂工业的重要酶种，广泛应用于医药、饲料、纺织和酿造工业中，具有较大的市场潜力。微生物源酸性蛋白酶的研制始于20世纪60年代，目前，国内外已发现能分泌酸性蛋白酶的主要是各种霉菌，如黑曲霉、米 曲霉、斋藤曲霉、根霉以及它们的变异株、突变株等，应用于工业化生产的主要菌种是黑曲 霉。
实施例5M1223菌株5L罐发酵试验孢子培养在含有50ml固体种子培养基的茄子瓶中，以孢子或菌丝划线接种，置于30°C恒温培养箱培养3 5天，至孢子成熟。用生理盐水将孢子洗下，制成107 8个/ml的孢子悬液。种子培养在含有30ml种子培养基的250ml摇瓶中，接入上述孢子悬液300 U L，置于旋转式摇床，30°C、200r/min发酵培养2 3天，至对数中后期。5L罐发酵在含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接入上述种子150ml，500r/min、通气量0. 8 lvvm，30°C发酵培养3 4天，至酶活不再增加为止。发酵液酶活检测发酵48h后每4h取发酵液，根据实施例3的方法测其粗酶液酶活，88h时达到最高酶活5600U/ml。 实施例6粗酶液对不同蛋白质水解能力的初步检测以10%的玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、细胞角蛋白作为底物，在pH3.0，40°C条件下，检测上述粗酶液对不同蛋白质的水解作用，以三氯乙酸沉淀未水解蛋白质，冷冻干燥测其含量作为考察指标，得到宇佐美曲霉(Aspergillus sp. )M1223产生的酸性蛋白酶对以上三种蛋白质均有一定的水解作用，30min的水解率为10 30%不等，水解效果为麦谷蛋白>玉米醇溶蛋白 > 细胞角蛋白。本发明涉及一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开了一株宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp.)M1223及该菌株制备酸性蛋白酶的方法，该菌现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5335，保藏日期为2011年10月12日。本发明公开的宇佐美曲霉通过液态深层发酵技术高产酸性蛋白酶，该酶可以在酸性条件下有效降解玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、细胞角蛋白等，在食品、酿造、皮毛处理等方面具有较好的应用潜力。
2012年9月19日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日 公开号201210020497.
