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专利名称
一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法
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发明者
柳建银, 胡伶俐, 陈晓炜
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公开日
2012年8月1日
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申请日期
2011年1月28日
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优先权日
2011年1月28日
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申请人
湖北国力生物技术开发有限公司
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文档编号
C12R1/125GK102618522SQ20111003465
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关键字
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权利要求
1.ー种采用鹰嘴豆エ业化生产纳豆激酶的方法，其特征在于采用鹰嘴豆为原料代替大豆并加以营养浸泡液生产纳豆激酶其过程包括粉碎、浸泡、灭菌、接种、发酵、后熟、提取分离、冻干2.根据权利要求I所述的鹰嘴豆，其特征于鹰嘴豆(Cicerarietinum, Chickpea)产于新疆，包含两个品种卡布里和迪西3.根据权利要求I所述粉碎，其特征在于精选除成熟饱满的鹰嘴豆，清洗干净后用机械粉碎成5-10目的颗粒4.根据权利要求I所述的营养浸泡液，其特征在于营养浸泡液的成分为0.1-0. 2g/mL葡萄糖和O. 1-0. 2g/mL乳糖，比例为鹰嘴豆营养浸泡液=I I. 0-1. 5，pH值为7. 1-7.5浸泡温度为36-45 °C，浸泡时间为12-24h5.根据权利要求I所述的灭菌，其特征在于通入高温蒸汽进行灭菌，控制温度在100-110°c，灭菌时间为 20-30min6.根据权利要求I所述的固体发酵，其特征在干固体发酵池中的鹰嘴豆粉厚度在10-20cm,接入8-16%纳豆激酶高产菌株，起始含水量50% -60%,起始pH为7. 1-7. 5，培养温度为36-42 °C，相対湿度为60% -75%，发酵时间为18_24h7.根据权利要求I所述的后熟，其特征在于后熟的温度为4°C，时间为12-24h8.根据权利要求I所述的提取分离，其特征在于包括浸提、板框过滤、错流纳滤、醇沉等步骤其中浸提时间为l_24h，醇沉步骤中加入冷こ醇至饱和度到75% -80%9.根据权利要求6的所述的高产菌株，其特征在于所用菌株为纳豆固体发酵高产菌株H-13,该菌株属枯草芽孢杆菌属纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)
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技术领域
本发明涉及采用鹰嘴豆为原料生产纳豆激酶固体发酵、提取分离的工艺以及发酵浸泡营养液的配方，属于生物技术领域背景 技术鹰嘴豆(Cicer arietinum,Chickpea)维吾尔族名为奴乎特、诺胡提,别名鸡豆、脑豆子和桃豆等属野豌豆族，是豆科植物中的稀有品种，因其外形独特，类似鹰嘴而被称为鹰嘴豆，是维吾尔医常用的中药材鹰嘴豆起源于亚洲西部和近东地区，在世界豆类作物中居第3位，种植于40多个国家是世界上栽培面积较大的食用豆类作物之一鹰嘴豆富含人体所需的18种氨基酸(其中人体必需的8种氨基酸的含量与人体需求比例极为相似)及蛋白质、膳食纤维、微量元素和维生素等营养物质，被誉为“营养之花、豆子之王”鹰嘴豆的蛋白质含量与大豆蛋白质的含量相近；脂类含量低于大豆；粗纤维含是大豆的13. 3倍；总酸度低于大豆，不过酸或过碱，其调节人体的酸碱平衡的能力较优于其他豆类，可一定程度上减轻脏器的负担；鹰嘴豆的蛋白及多肽具有天然抗氧化的特点鹰嘴豆对糖尿病、高血脂、高血压、心脑血管疾病、肺病、消化不良、皮肤疾病等均有良好的药膳和食疗作用，可用于日常食品及营养强化剂，对增强人体免疫力、延缓衰老、美容养颜以及儿童智力发育都大有裨益，因此鹰嘴豆又被誉为“长寿豆”纳豆激酶(Nattokinase, NK)是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,能显著溶解体内外血栓,具有很强的纤溶活性，不但能直接作用于纤溶蛋白，而且还能激活体内纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用其具有安全性好，作用迅速，成本低，可由细菌发酵生产等优点，可用于开发新一代溶栓剂或保健食品，是一种很有潜力的新型口服溶栓药物，具有极为广阔的前景由于纳豆激酶具有目前市场上正在使用的溶栓药物所不具有的优点，那么提高纳豆激酶的单位产物的酶活力和生产效率对纳豆激酶的推广具有重要的意义在发酵的方式上，纳豆激酶现在的生产方式主要是以发酵为主目前还暂无利用鹰嘴豆发酵生产纳豆激酶的专利，只有一篇题为《鹰嘴豆发酵生产纳豆初探》的文章，其报道的鹰嘴豆发酵粗酶液的纳豆激酶酶活为915IU/g ;在其他关于利用大豆固体发酵生产纳豆激酶的专利中，专利号为20081023117. 2的专利，其冻干粉的酶活为5500IU/g左右；专利号为200710164632. I的专利，其冻干粉的酶活为5000IU/g ;文章《纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究》中纳豆激酶粗酶液的酶活为2250IU/g这些专利或文章中报道的纳豆激酶的活性均不高，且多以大豆作为发酵原料的传统发酵方式生产纳豆和纳豆激酶这种方式的特点是操作比较简便、工艺简单但以大豆为原料生产纳豆激酶存在着酶活不高以及纳豆发酵氨臭味等缺点本发明采用鹰嘴豆为原料代替大豆进行发酵，不仅生产的纳豆激酶酶活高、发酵周期短，而且减少了发酵产生的氨臭味，提高了口感，更宜被人们所接受此外，本发明生产工艺中的豆渣可利用于生产鹰嘴豆小肽，其营养成分优于大豆小肽，而且还有天然抗氧化的特点，具有提高人体免疫力、延缓衰老等功效充分利用了生产纳豆激酶时的“废弃物”，提高了原料的利用率，为本工艺增加了一定的经济附加值同时本发明采用错流纳滤和醇沉的方法提取分离纳豆激酶，避免了盐析方法中的高渗作用，减少了酶蛋白的损失，更适宜纳豆激酶的工业化生产
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具体实施例方式
实施案例I I、固体发酵取Ikg的葡萄糖和Ikg的乳糖，加入到1000L的蒸馏水，配制成营养浸泡液现将500kg的鹰嘴豆机械磨成5目的颗粒，按I I的比例加入营养浸泡液，调pH值到7.2，37°C下浸泡24h，然后通入110°C高温蒸汽灭菌20min温度降低至40°C左右，接入8%纳豆芽孢杆菌，固体发酵池中鹰嘴豆粉厚度在10cm，起始含水量控制在50%，起始pH为7. 2，培养温度为37°C，相对湿度为75%，发酵时间为24h发酵后，4°C后熟12h2、提取分离发酵后的产物按I 10的比例加入0. 9%的生理盐水中混匀，浸提12h，经板框过滤，得到的即为固体发酵粗酶液经错流纳滤进行浓缩，在压力推动下把膜面上的滞留物带走，收集滞留物将其转移至沉淀罐，加入乙醇至75%饱和度，4°C下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀3、冷冻干燥将上述物质于_40°C冷冻干燥24h，即得纳豆激酶冻干粉实施案例2 I、固体发酵取Ikg的葡萄糖和Ikg的乳糖，加入到1000L的蒸馏水，配制成营养浸泡液现将500kg的鹰嘴豆机械磨成8目的颗粒，按I 1.2的比例加入营养浸泡液，调pH值到7.2，40°C下浸泡18h，然后通入110°C高温蒸汽灭菌20min温度降低至40°C左右，接入10%纳豆芽孢杆菌，固体发酵池中鹰嘴豆粉厚度在15cm，起始含水量控制在55%，起始pH为7. 2，培养温度为37°C，相对湿度为75%，发酵时间为24h发酵后，4°C后熟12h2、提取分离发酵后的产物按I 10的比例加入0. 9%的生理盐水中混匀，浸提12h，经板框过滤，得到的即为固体发酵粗酶液经错流纳滤进行浓缩，在压力推动下把膜面上的滞留物带走，收集滞留物将其转移至沉淀罐，加入乙醇至75%饱和度，4°C下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀3、冷冻干燥将上述物质于-40°C冷冻干燥24h，即得纳豆激酶冻干粉实施案例3 I、固体发酵取Ikg的葡萄糖和Ikg的乳糖，加入到1000L的蒸馏水，配制成营养浸泡液现将500kg的鹰嘴豆机械磨成10目的颗粒，按I I. 5的比例加入营养浸泡液，调pH直到7. 2，45°C下浸泡12h，然后通入110°C高温蒸汽灭菌20min温度降低至40°C左右，接入12%纳豆芽孢杆菌，固体发酵池中鹰嘴豆粉厚度在20cm，起始含水量控制在60%，起始pH为7. 2，培养温度为37°C，相对湿度为75%，发酵时间为24h发酵后，4°C后熟12h2、提取分离
专利名称：一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法
本发明的目的在于提供一 种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法，选用鹰嘴豆代替传统大豆发酵生产纳豆激酶，提供一种产酶活高、发酵周期短、氨味低、营养全面、口感好的生产工艺。采用纳豆激酶的固体发酵高产菌株H-13，接入鹰嘴豆和营养液中经发酵、后熟、提取分离、冻干而成。本发明的技术方案为I、固体发酵(I)种子培养液及培养条件以1%葡萄糖、2%大豆蛋白胨、0.3% KH2PO4^O. 1%K2HP04、0. 04% MgSO4^O. 02% CaCl2 为种子培养基，培养温度为 35-38°C，初始pH为 7. 2-7. 4，装液量为20-25mL/100mL三角瓶，接种量为2_3%，摇床转速为120_150r/min，发酵周期为18-24h。(2)粉碎精选成熟饱满的鹰嘴豆，清洗干净后用机械粉碎成5-10目的颗粒。(3)浸泡配制营养浸泡液,其成分为0. 1-0. 2g/mL的葡萄糖和0. 1-0. 2g/mL的乳糖。鹰嘴豆与营养浸泡液的比例为I : I. 0-1. 5，用NaOH调pH值为7. 1-7. 5，在36-45°C下浸泡12-24h。然后通入100-110°C高温蒸汽灭菌20min。(4)固体发酵待温度降到40°C左右，接入菌种，接种量为8-16%，在固体发酵池中将鹰嘴豆粉厚度铺在10-20cm，起始含水量为50% -60%，起始pH为7. 1-7. 5，培养温度为36-42°C，相对湿度为60% -75%，发酵时间为18_24h。发酵后，4°C后熟12_24h。2、提取分离(I)浸提发酵后的产物按I : 5-10的比例加入0. 9%的生理盐水中混匀，浸提l-24h。再经板框过滤，得到的即为固体发酵粗酶液。采用4所述的方法检测酶活，并记录。(2)错流纳滤用错流纳滤法对其进行浓缩，在压力推动下把膜面上的滞留物带走，并收集滞留物。(3)醇沉将上述滞留物，转移至沉淀罐，加入冷乙醇至75% -80%饱和度，4°C下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀。3、冷冻干燥收集上述的沉淀于_40°C真空冷冻干燥24h，即得纳豆激酶冻干粉。采用4所述的方法检测酶活，并记录。4、纳豆激酶活性的测定参照Astrup法并加以改进制备纤维蛋白平板。将不同浓度的尿激酶(UK)标准品(100、80、60、40、20、10IU/mL)点样于新配制的平板上，置于37°C培养箱培养18h。测定溶圈的垂直直径，计算溶圈面积，制作标准曲线。取用等量纳豆制备的粗酶液1(^1点平板，置371保温1811。取出后测量溶圈面积，用以表示纤溶活性。根据所测样品的垂直直径计算的面积，利用标准曲线求得相应的酶活性。测得粗酶液酶活稳定在3270IU/g左右，测得提取分离后的酶活稳定在35000IU/g左右。酶活比现有的专利所报道的酶活高，而且氨臭味低，提高了口感，更宜被人们所接受。此外，本生产工艺中的豆渣可利用于生产鹰嘴豆小肽，其营养成分不仅优于大豆小肽，而且还有天然抗氧化的特点，具有 提高人体免疫力、延缓衰老等功效。充分利用了生产纳豆激酶时的“废弃物”，提高了原料的利用率，为本工艺增加了一定的经济附加值。同时本发明工艺简单，减少了酶蛋白的损失，更适宜纳豆激酶的工业化生产。发酵后的产物按1: 10的比例加入0. 9%的生理盐水中混匀，浸提12h，经板框过滤，得到的即为固体发酵粗酶液。经错流纳滤进行浓缩，在压力推动下把膜面上的滞留物带走，收集滞留物。将其转移至沉淀罐，加入乙醇至75%饱和度，4°C下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀。3、冷冻干燥将上述物质于_40°C冷冻干燥24h，即得纳豆激酶冻干粉。上述实施例，只是本发明的较适实施例，并非用来限制本发明的实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及其原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求之内。一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法。属于生物领域。本发明公开了一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法。本发明选用纳豆激酶固体发酵的高产菌株，将其接入鹰嘴豆和营养液中发酵生产纳豆激酶，包括粉碎、浸泡、灭菌、接种、发酵、后熟、提取分离、冻干等工艺。本发明选用鹰嘴豆发酵生产纳豆激酶，粗酶液的酶活达3270IU/g，提取分离后的酶活达35000IU/g，比以大豆为原料的传统发酵方法生产的纳豆激酶的酶活高、发酵周期短、氨味低、口感好。本发明采用错流纳滤和醇沉的方法提取分离纳豆激酶，生产工艺简单，利于工业化生产，同时又保留了鹰嘴豆比大豆营养更丰富和天然抗氧化的优势。
