专利名称：焦谷氨酰肽酶及其基因的制作方法 霉菌中，特别是含有米曲霉(Aspergillus oryzae、黄曲霉)等的曲霉是制造清酒、酱、酱油、和甜料酒等、我国酿造产业以前所利用的可直接食用的菌类，被视为美国FDA(食品及药品管理局)GRAS(一般认为安全)目录中的安全基因源。因此从安全性的方面考虑，霉菌、特别是曲霉菌可以说是利用价值极高的基因宝库。蛋白质水解物可以用酸水解含蛋白质的原料来制造，但从将蛋白质水解物作为天然调味料使用的观点来看，正在研究通过酶分解制造蛋白质水解物的方法以及通过酸分解的制造方法。作为通过酶分解制造的蛋白质水解物有下述报道，酶分解蛋白的酶解产物(特开昭48-68773)、酶解脱脂大豆的酶解产物(特开昭51-70852)、以干酪乳清为原料的酶解产物(特开昭62-151155)、玉米谷胶粉的酶解产物(特公平2-295437)等。但由于蛋白质的特性和用于降解蛋白质的酶使所形成的肽有苦味，因此其并非感官上优选的。因此，需要具有水解率高且感官特性优良的水解产物。作为提高分解率的技术，正在考虑涉及来源于曲霉的谷氨酰胺酶等多种酶的技术(WO 99/60104、特开2000-166547、特表2002-511746)。由酱油和酱的酿造可知，利用现有的曲霉培养物时，尽管蛋白质水解需要很多的劳力和时间，但氨基酸释放率低，特别是大豆蛋白中大量的且对味觉重要的谷氨酸的释放率低。同时，有大量的N末端存在受L-焦谷氨酸残基保护的蛋白质或肽。此外，蛋白质或肽水解时，多数情况下新生成的氨基末端的谷氨酰胺或谷氨酸形成非酶解的闭环焦谷氨酸残基，从食品中也可以检测出来。其中，为了使N末端受L-焦谷氨酸残基保护的蛋白质和肽不直接进行的氨酞酶水解，需要去除该L-焦谷氨酸残基的操作。焦谷氨酸肽酶是使这些蛋白质或肽的氨基末端的L-焦谷氨酸残基特异地释放出来的酶，已知其在多种动物的脑、肺、血清或脑垂体以及植物或微生物中广泛存在。已有关于对经蛋白质水解酶作用所得的蛋白质水解产物进一步用焦谷氨酸肽酶作用，制造味觉优良的蛋白质水解物的报道(特开平8-252075)。作为来自微生物的焦谷氨酸肽酶，已知有来自淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的酶[J.Biochem.，84，467(1978)]，该酶的基因已被分离出来并有其制造方法的报道(特开平5-137572)。此外还分离出了耐热性高的激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的酶的相关基因(特开平7-298881)。还有已知的来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的酶(特开平8-252075)。但是尚未分离出来自霉菌的焦谷氨酸肽酶及其相关基因。再有，将焦谷氨酸肽酶与作为蛋白水解酶来源的曲霉培养物一起使用制造蛋白质水解物时，由于要使用来自枯草芽孢杆菌等曲霉之外的异种生物的焦谷氨酸肽酶，所以提高了价格且味感差。
本发明提供可用于制造与现有的酶分解型蛋白质水解物相比，氨基酸的释放率、特别是谷氨酸的释放率高的蛋白质水解物的、来自曲霉的新型焦谷氨酸肽酶，以及可用于制造该焦谷氨酸肽酶的焦谷氨酸肽酶基因。也就是说，本发明涉及以下所示的各种肽、以及编码所述多肽的相关DNA。本发明的多肽和DNA中，从安全性和经济性的角度考虑，来自列于美国FDA的GRAS目录中的微生物米曲霉(Aspergillus oryzea)的多肽和DNA具有极高实用价值。
本发明提供下述的(1)～(23)。
(1)选自以下(a)～(c)中任意一项所述的多肽(a)含有序列号2所示氨基酸序列的多肽，(b)含有与序列号2所示氨基酸序列实际上同一的氨基酸序列、且具有焦谷氨酸肽酶活性的多肽，以及(c)含有在序列号2所示氨基酸序列中通过一个以上的氨基酸缺失、取代或添加所得的氨基酸序列、且具有焦谷氨酸肽酶活性的多肽。
序列号2所示的氨基酸序列是米曲霉的焦谷氨酸肽酶的氨基酸序列。
术语“与序列号2所示氨基酸序列实际上同一的氨基酸序列”是指与序列号2所示氨基酸序列在全部氨基酸序列范围内进行比对时，全部平均约30％以上、优选约50％以上、更优选约80％以上、特别优选约90％以上氨基酸同一的氨基酸序列。
术语“在序列号2所示氨基酸序列中通过一个以上的氨基酸缺失、取代或添加所得的氨基酸序列”是指，优选1～20个为限、更优选1～10个为限、更优选几个氨基酸缺失、取代或添加所得的氨基酸序列，或其组合形成的氨基酸序列。
多肽的焦谷氨酸肽酶活性可按如下方式测定。配制50mmol/l含5mmol/l焦谷氨酸-对硝基酰基苯胺的磷酸缓冲液(pH7.5)作为基质溶液。配制含多肽的样品溶液，向每100μl基质溶液中添加20μl样品溶液，37℃下反应10分钟后用分光光度计测定405nm下的吸光度。根据对硝基酰基苯胺的摩尔吸光系数(10500)计算每1分钟反应时间的对硝基酰基苯胺释放量，以37℃下使1μ摩尔对硝基酰基苯胺游离的活性作为1个单位。
上述序列号2所示的氨基酸序列实际上同一的氨基酸序列或含有在序列号2所示氨基酸序列中通过一个或一个以上的氨基酸缺失、取代或添加所得的氨基酸序列的多肽可以通过例如，导入位点特异性的变异法、基因同源重组法、引物延伸法和PCR法等本领域技术人员公知方法的适当组合容易地制成。
再有，在上述范围内，为了具有实质上相同的功能，构成所述多肽的氨基酸中可以考虑同族氨基酸(极性、非极性氨基酸，疏水性、亲水性氨基酸，带正电荷、负电荷的氨基酸，芳香族氨基酸等)之间的取代。此外，为了保持功能实质上相同，最好保持本发明的各多肽中包含的功能结构域内的氨基酸不变。
含有序列号2所示氨基酸序列中一个或一个以上的氨基酸残基缺失、取代或添加所得的氨基酸序列、且具有焦谷氨酸肽酶活性的多肽，例如在序列号2所示氨基酸序列的N末端添加41个氨基酸的含有序列号10所示的氨基酸序列的多肽。
(2)含有编码(1)中所述多肽的核苷酸序列的DNA。
(3)以下(a)～(c)中任意一项的DNA(a)含有如序列号1所示核苷酸序列的DNA。
(b)含有如序列号5所示核苷酸序列的DNA。
(c)含有与序列号1或5所示核苷酸序列的互补核苷酸序列在严紧条件下杂交的、且编码具有焦谷氨酸肽酶活性的多肽的核苷酸序列的DNA。
(2)或(3)的DNA是具有编码有焦谷氨酸肽酶活性的多肽的区域的功能的序列。序列号2所示的是上述DNA编码的氨基酸序列的一个例子。序列号2所示的氨基酸序列是基于米曲霉菌株RIB40(FERMP-18273(后转为FERM BP-7935))的基因组核苷酸序列、从特别确定基因区域(基因位置)的各种信息(ORF、外显子/内含子区域、以及表达序列标签(EST)等)所确定的序列。序列号1所示的核苷酸序列是含有米曲霉菌株RIB40的焦谷氨酸肽酶基因及其启动子区域的基因组DNA的核苷酸序列。序列号5所示的核苷酸序列是由序列号1的核苷酸序列中去除了5’和3’非翻译区以及内含子的核苷酸序列，与米曲霉菌株RIB40菌株的焦谷氨酸肽酶cDNA的编码焦谷氨酸肽酶区域的核苷酸序列一致。
本说明书中所述的“严紧条件下”是指各核苷酸序列之间的同源性程度，在例如全部序列平均约80％以上、更优选约90％以上、更优选约95％或更高，仅在具有高同源性的核苷酸序列之间形成特异杂交的条件。具体说来，这样的严紧的条件可以是，例如温度60～68℃，钠盐浓度150～900mmol/l，优选600～900mmol/l，pH6～8的条件。
杂交可以利用例如Current Protocols in MolecularBiology，John wiley&Sons(1987)中所记载的方法等本领域公知的方法，或基于这些方法的方法进行。此外，使用可商购的文库时可以按照其附加的说明书中所述的方法进行。可与含有序列号1或5所示氨基酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严紧条件下杂交的、且含编码具有焦谷氨酸肽酶活性多肽的核苷酸序列的DNA的实例包括，例如来源于米曲霉以外的曲霉的编码焦谷氨酸肽酶的基因组DNA、cDNA。
(4)选自以下(a)～(c)的DNA(a)含有序列号3所示核苷酸序列的DNA，(b)含有序列号3所示核苷酸序列100个碱基以上长度的部分序列，起启动子功能的DNA。
(c)与含有序列号3所示核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严紧条件下杂交的，起启动子功能的DNA。
这些DNA序列对应于在霉菌基因组DNA中，编码本发明的多肽的区域，例如位于序列号1所示的核苷酸序列1001～1111位核苷酸相对应的5’上游的区域。
在这些序列中，位于3’下游区域的编码区域中实际确认了EST(表达条件用含2％葡萄糖的完全液体培养基培养、用含2％麦芽糖的完全液体培养基培养、用不含碳源的合成液体培养基培养、用含2％葡萄糖的完全液体培养基在高温(37℃，其他没有特别限定时指30℃)培养、固体培养(小麦糠)、用含2％葡萄糖的碱性(pH10)合成培养基培养、马铃薯葡萄糖琼脂培养基28℃下将胞子培养8天萌发后培养、或大豆、小麦混合培养基培养34小时后25℃下进行3天固体培养中的任意一种)。从以上可以清楚的看出，上述序列中某些含有启动子区域(如核心启动子或基本启动子、以及上游启动子元件等的、与各种聚合酶、基本转录因子或转录因子相互作用的序列)。
因此，作为可能含有上述启动子区域的部分序列，例如每一个从上述各序列的3’侧起，优选200个碱基对或更多、更优选500个碱基对或更多、更优选800个碱基对或更多、特别优选900个碱基对或更多的序列是适宜的。或者也可以使用上述各序列每一个中适当的中间部分中具有上述长度的碱基对的部分序列。
DNA序列是否具有启动子的功能举例来说可以通过下述的方法确认。在编码作为报道子的多肽的DNA的上游连接了试验DNA以制备新DNA，将获得的DNA插入含有如米曲霉的乙酰胺酶基因或硝酸还原酶基因等转化标记基因的适当的载体[J.Ferment.Bioeng.，74，389(1992)、Mol.Gen.Genet.，218，99-104(1989)]以制备重组载体。利用所得的重组载体，依照文献[J.Ferment.Bioeng.，74，389(1992)、MOL.Gen.Genet.，218，99-104(1989)]中记载的方法转化米曲霉，在获得的转化体中测定作为报道分子的多肽水平。能检测出所述多肽时，可确定连接于编码作为报道分子的多肽的DNA上游的DNA具有启动子的功能。可作为报道分子的多肽的例子包括大肠杆菌的β-葡糖醛酸苷酶、绿荧光蛋白、大肠杆菌的β-半乳糖苷酶等。转化子或其培养物上清中的β-葡糖醛酸苷酶、绿荧光蛋白、β-半乳糖苷酶可按照文献[Appl.Environ.Microbiol.61，2482(1995)、Eur.J.Biochem.266，252(1999)、Mol.Microbiol.8，211(1993)]中记载的方法检测。
(4)中的DNA还可以用于作为例如，使外源基因等插入并表达的区域。
(5)以下(a)～(c)的DNA。
(a)具有与序列号4所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA(b)具有与序列号4所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的、10个或10个以上碱基长度的部分序列的DNA，以及(c)与含有序列号4所示的核苷酸序列的DNA在严紧条件下杂交的DNA。
这种DNA是米曲霉菌株RIB40的基因组DNA中具有序列号1所示的核苷酸序列的1902～2201位核苷酸序列的3’非翻译区域的DNA。具体说来，当DNA与从含有序列号1所示核苷酸序列的焦谷氨酸肽酶基因转录而来的mRNA杂交时，检测mRNA，该DNA可用作检测的探针。在所述的mRNA中与序列号5所示的核苷酸序列对应的编码焦谷氨酸肽酶的区域常常含有与其编码的多肽功能相关的其它mRNA具有高同源性的序列。与之相反，该区域的核苷酸序列含有与序列号5无任何关联的高任意性序列。因此，用(5)中的DNA作探针可以从自细胞中抽提出的RNA团中以极高的特异性分别检出及定量焦谷氨酸肽酶的mRNA。此外，通过制备具有这一区域的序列的PCR引物可通过PCR分别检出及定量。
这种作为探针使用的本发明的DNA或作为与其部分序列相对应的区域，适宜的是从上述序列的5’侧起优选300个碱基的范围、更优选200个碱基对的范围、特别优选约100个碱基对的范围。再者，根据使用目的本领域的技术人员可以适当地选择部分序列的长度，从检出及定量灵敏度的角度考虑，在上述范围中一般长一些为宜。
(6)(2)～(5)中任意一项中所记载的DNA，其中的DNA是基因组DNA。
(7)含有(2)～(6)中任意一项中所记载的DNA的核苷酸序列或与该核苷酸序列互补的、由15个碱基或以上的核苷酸序列组成的寡核苷酸。
(8)含有(2)或(3)中所记载的DNA的重组DNA。
(9)含有(8)中所记载的重组DNA的转化子。
(10)一种生产如(1)所述的多肽的方法，其特征在于，在培养基中培养具有生产所述的多肽的能力的微生物，在培养物中积累所生成的多肽，从培养物中收集所述的多肽。
(11)如(10)所述的制造方法，其中，所述的微生物是(9)中所记载的转化子。
(12)如(10)所述的制造方法，其中，所述的微生物是霉菌。
(13)如(12)中所述的制造方法，其中的霉菌是选自曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属、毛霉属和镰刀菌属中的一个属的霉菌。
(14)如(13)中所述的制造方法，其中属于曲霉属的霉菌是选自米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、川地曲霉、寄生曲霉、黄色曲霉、Aspergillus nomius、烟曲霉和构巢曲霉中的一种的曲霉。
(15)蛋白质水解物的制造方法，包括向含蛋白质的原料中添加(1)中所述的多肽和蛋白质水解酶、降解蛋白质。
(16)蛋白质水解物的制造方法，包括向含蛋白质的原料中添加在培养基中培养具有生产(1)中所述多肽的能力的微生物所得的、含(1)中所述的多肽的培养物或所述培养物的处理物、以及蛋白质水解酶，并降解蛋白质。
(17)如(16)所述的方法，其中，所述的微生物是(9)中所述的转化子。
(18)如(18)所述的蛋白质水解物制造方法，其中，所述的微生物是霉菌。
(19)如(16)所述的蛋白质水解物制造方法，其中所述的霉菌是选自曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属、毛霉属和镰刀菌属中的一个属的霉菌。
(20)如(19)所述的方法，其中，所述的霉菌是选自米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、川地曲霉、寄生曲霉、黄色曲霉、Aspergillus nomius、烟曲霉和构巢曲霉中的一种的曲霉。
(21)利用(15)～(20)中任意一项所述的方法制造的蛋白质水解物。
(22)与(1)中所记载的多肽特异结合的抗体。
(23)包括用(22)中所述的抗体检出或定量(1)中所述多肽的方法。

以下就本发明的实施方式作详细说明。
(1)本发明的DNA的制备作为本发明的DNA，例如含序列号1所示的核苷酸序列的DNA，可用米曲霉的基因组作为起始材料，例如按实施例中所述的基因枪克隆法制备。其中将片段化的各染色体DNA根据其长度与合适的质粒载体或噬菌体等适当的克隆载体连接，将其通过电穿孔法等适当的方法转化大肠杆菌等适当的宿主细胞，制备用于克隆片段化的各染色体DNA的克隆文库。
此外，利用化学分解法(Maxam-Gilbert法)及双脱氧法等公知的方法可以确定上述克隆文库所得的片段化的各染色体DNA的核苷酸序列。
另外，也可以用含序列号1或5所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列的由连续15个碱基或更多的核苷酸组成的寡DNA作为引物，通过PCR扩增制备本发明的DNA。例如用含有序列号8和9所示的核苷酸序列的寡DNA作为引物对，以米曲霉cDNA为模板，通过PCR扩增并分离含序列号5所示核苷酸序列的DNA。
此外，用含有本发明的DNA的核苷酸序列的连续15个碱基或更多的核苷酸序列的寡DNA，和含与由本发明的DNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的连续15个碱基或更多的核苷酸序列组成的寡DNA作为引物对，扩增、检出或分离本发明的DNA片段。引物用下述DNA制备，即选择扩增区域，优选在3’端含有扩增区域的5’端的15～50个碱基的序列的DNA、和在3’端含有扩增区域的3’端的15～50个碱基的序列互补的DNA。作为模板可以用例如，微生物，优选霉菌的染色体DNA或cDNA。作为霉菌优选选自曲霉属、青霉属(Penicillium)、腐质菌属(Humicola)、木霉(Trichoderma)属、毛霉属(Mucor)和(Fusarium)属中任意一属的微生物，特别优选曲霉属的霉菌。曲霉属的霉菌例如米曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、寄生曲霉(Aspergillusparaciticus)、Aspergillus nomius、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、川地曲霉(Aspergillus kawachii)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，其中优选例如属于黄色组的霉菌。属于黄色组的曲霉属霉菌例如米曲霉、酱油曲霉、寄生曲霉、黄曲霉、Aspergillus nomius。其中例如米曲霉菌株RIB40(ATCC42149)于2001年3月28日(平成13年3月28日)交付独立行政法人工业技术研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1-1中央第6)保藏，保藏号FERM P-18273，于2002年3月4日(平成14年3月4日)转为国际保藏保藏号为FERM BP-7935。
含序列号3或4所示核苷酸序列的DNA是含序列号1所示核苷酸序列的DNA的部分片段、可用米曲霉基因组DNA为模板，以基于序列号3或4所示的核苷酸序列的引物对通过PCR扩增、分离。
PCR可以利用本领域技术人员公知的条件和方法进行，PCR反应的条件，例如94℃反应2分钟后，以94℃下10秒、55℃下20秒、72℃下2分钟的反应循环进行30个循环，最后在72℃下5分钟的反应条件、94℃反应5分钟后、进行30个下述反应循环，即94℃下2秒、56℃下30秒、72℃下1分钟30秒的循环。另外，作为热循环仪可以用PerkinElmer公司制造的9600、AstecAstec公司制造的程序温度控制系统PC-700等普通的热循环仪。作为耐热的DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶(宝酒造社制)、ExTaq DNA聚合酶(宝酒造社制)等普通的市售商品，反应液的组成可按照随聚合酶附带的说明书进行。
上述用于DNA扩增用的引物对中各引物的长度没有特别的限定，根据使用目的本领域的技术人员可以进行适当地选择。通常是15～50个碱基、优选20～30个碱基的长度。引物的数量可根据与含有扩增对象DNA的菌种与曲霉的关系以及混合程度确定其最小限度的数量，引物的数量是至少一组(2条)、优选2～4组。设计引物时要考虑扩增对象的序列长度、特征。寡DNA可以利用本领域技术人员所公知的化学合成，例如用应用生物系统公司制造的DNA合成仪制备。
将含有本发明的DNA的部分片段、或与本发明的DNA的核苷酸序列或本发明的DNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的连续15个碱基或更多核苷酸序列的寡DNA用同位素、地高辛、生物素等标记作为探针，通过杂交可以检出本发明的DNA、编码本发明的多肽的mRNA。本发明的DNA的部分片段可通过上述的PCR方法制备。寡DNA可由与用作引物的寡DNA同样的化学合成或利用DNA合成仪制备。探针的长度，本领域的技术人员可根据检出对象适当的选择，通常的长度是15～3000个碱基，优选20～1000个碱基。
杂交时，例如将来自凝胶电泳或菌落的DNA或mRNA转移到硝酸纤维素或尼龙膜上，通过真空中80℃反应2小时、或用紫外线照射处理将DNA固定到膜上。此时，必要时用含0.5mol/l NaOH、1.5mol/l NaCl的碱性溶液变性，用0.5mol/l Tris-HCl(pH7.5)、3mol/l NaCl的溶液中和。将所述的膜用50％甲酰胺、4×SSC、50mM HEPES-NaOH(pH7.0)、10×Denhardt’s溶液、100μg/ml鲑鱼精子DNA的杂交溶液在42℃下预杂交一昼夜。将上述的膜在室温下用含0.1％SDS的2×SSC溶液洗3次每次2分钟后，在42℃下用含0.1％SDS的0.1×SSC溶液洗3次每次2分钟。将洗净后的膜风干后于-70℃下暴露于X光胶片，时间从2小时到一昼夜显影至可见。此外，也可以将寡DNA或DNA片段固定在基板上，与经标记的mRNA或DNA杂交后作为点检出的DNA芯片[GenomeRes.，6，639(1996)]，由此检出本发明的DNA或编码本发明的多肽的mRNA。
(2)本发明的多肽的制备本发明的多肽可通过例如下述的方法制备，将含有编码本发明的多肽的DNA的重组DNA导入宿主细胞制备转化子，培养所述的转化子制备本发明的多肽。具体的基因操作方法可按照分子克隆实验手册，第3版，冷泉港实验室编(2001)，或John Wiley&Sons等的现代分子生物学方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)或Current Protocolsin Molecular Biology John Wiley&Sons(1987))中所记载的方法进行。
由(1)中所得的本发明的DNA制备含有编码本发明多肽的部分的适当长度的DNA。此外必要时制备对编码本发明的多肽的部分核苷酸序列进行取代的DNA，以便于形成最适于在宿主细胞中表达的密码子。
将上述的DNA插入到适当的表达载体的启动子下游，制备重组载体。
将该重组载体导入适合于该表达载体表达的宿主细胞中。
作为宿主细胞，只要是能表达目的基因的细菌、酵母、霉菌、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等任意一种均可以使用。
作为表达载体，可以使用能在宿主细胞中自我复制或能够重组到染色体中，在可使编码本发明的多肽的DNA转录的位置含有启动子的载体。
当使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，在含有编码本发明的多肽的DNA的重组载体能在宿主细胞中自主复制的同时，优选含有连接有启动子、核糖体结合序列、编码本发明多肽的DNA和转录终止序列的构建体的载体。也可以含有控制启动子的基因。
作为表达载体的例子例如pGEMEX-1(promega公司制)pQE-30(Qiagen公司制)pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.C.hem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pGEX-5X-3(Amersham生命科学公司制)pET14(Novagen公司制)、pPROTet.E(Clontech公司制)、pRSET C(Invitrogen公司制)等。
作为启动子只要能在宿主细胞中发挥功能的都可以使用。例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等等的启动子。此外也可以使用将两个Ptrp启动子串联所得的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子之类认为设计改变的启动子。
优选使用作为将核糖体结合序列SD的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间的间隔被适当调节(例如6～18个碱基)的质粒。
在本发明的重组载体中，虽然对于本发明的DNA的表达而言转录终止序列并非是必需的，但优选在结构基因的下游设置转录终止序列。
作为宿主细胞的可以是埃希氏属、沙雷氏属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属等微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌GI698、大肠杆菌TB1、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)、淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Corynebacterium ammoniaphilum)ATCC15354、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌D-0110等。
将重组载体导入细胞的方法可以使用任意一种将DNA导入细胞的方法，例如钙离子法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-2483942)、或Gene，17，107(1982)、Molecular&General Genetics，168，111(1979)等记载的方法。
在用酵母作为宿主细胞时，用作表达载体的例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子只要其可以在酵母中发挥功能的均可使用，例如己糖激酶等糖酵解类的基因的启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等。
作为宿主细胞可以列举的有糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或假丝酵母属(Candida)的微生物，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克鲁维氏酵母属(Kluyveromyceslactis)、茁芽丝孢酵母属(Trichosporon pullulans)、河岸许旺氏酵母属(Schwanniomyces alluvius)和产朊假丝酵母属(Candidautilis)。
作为重组载体的导入方法，只要是能将DNA导入酵母的方法均可使用，例如电穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、醋酸锂法[J.Bacteriology，153，163(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]等。
在以霉菌作为宿主细胞时，可举出的表达载体的例子如pPTRI(白鹤酿酒公司制)、pPTRII(白鹤酿酒公司制)、pAUR316(宝酿酒公司制)等。
作为启动子只要其能在霉菌中行使功能即可使用，例如amyB启动子、enoA启动子、gpd启动子、mel0启动子等。
作为宿主细胞可列举出的如，曲霉属、青霉属、木霉属、镰刀菌属、腐质霉属和毛霉属等。
作为重组载体的导入方法，能将DNA导入霉菌的任何方法均可使用，例如原生质体法[GENETICS of ASPERGILLUS NIDULANSEMBOPractical Course Mannual，8(1988)]等。
用动物细胞作为宿主细胞时，可使用的表达载体例如，pEGFP-C2(Clontech公司制)、pAGE107(特开平3-22979；Cytotechnol.，3，1331990)、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8[Nature，329，840(1987)]、pCMV-Tag1(Stratagene公司制)、pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pMSG(Amersham生命科学公司制)、pAMo[J.Biol.Chem.，268，22782(1993)]等。
作为启动子，只要其能在动物细胞中发挥功能的均可使用，例如巨细胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热激启动子、SRα启动子等。此外也可以将启动子与人CMV的IE基因的增强子一起使用。
作为宿主细胞，可举出如人Namalwa细胞、猴COS细胞、中国仓鼠的CHO细胞、HBT5637(特开昭63-299)等。
作为重组载体的导入动物细胞的方法，能将DNA导入动物细胞的任何方法均可使用，例如电穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙法(特开平2-227075)、ripofection法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]、Virology，52，456(1973)等。
用昆虫细胞作为宿主细胞时，可利用例如Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons(1987)、Baculovirus ExpressionVectorsA Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company(1992)、Bio/Technology，6，47(1988)表达多肽。
即，将含有重组基因和杆状病毒的载体共转染昆虫细胞，在昆虫细胞培养物上清液中收获重组病毒，再用重组病毒感染昆虫细胞，由此可以使细胞表达多肽。
该方法中所用的基因导入载体可以是例如pVL1392、pVL1393、pBlueBac4.5(以上均是由Invitrogen公司制)、pBacPAK9(Clontech公司制)。
作为杆状病毒可以使用例如，感染Rhyacia baja科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)。
作为昆虫细胞，可以使用，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞Sf9、Sf21[杆状病毒表达载体实验手册，W.H.Freemanand Company(1992)]、银纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞High5(Invitrogen公司制)。
为制备重组病毒，将上述重组基因导入载体和上述的杆状病毒一起导入昆虫细胞的方法可以是例如，磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质体感染法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)]。
使用植物细胞作为宿主细胞时，可使用表达载体例如，Ti质粒和烟草花叶病毒载体等。
作为启动子，只要能在植物细胞中行使功能的均可使用，例如菜花花叶病毒(CaMV)35S启动子、稻肌动蛋白1启动子等。
作为宿主细胞可以是例如，烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麦、大麦等的植物细胞等。
作为重组载体的导入方法，任何能将DNA导入植物细胞的方法均可以使用，例如土壤杆菌(Agrobacterium)(特开昭59-140885、特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(特开昭60-251887)、颗粒枪(基因枪)法(专利公报2606856号、专利公报2517813号)等。
将以上所得的本发明的转化子在培养基中培养，在培养物中生成并积累本发明的多肽、再从培养物中收集出来，由此制备本发明的多肽。
在培养基中培养本发明的多肽的方法可以利用常规的宿主培养方法。
当本发明的转化子是使用大肠杆菌等原核生物或酵母或霉菌等真核生物作为宿主的转化子时，作为培养所述转化子的培养基可以是任何天然培养基、合成培养基，只要它含有能被转化子吸收的碳源或氮源无机盐等，并且能有效培养该转化子。
只要能被转化子吸收的碳源均可使用，如葡萄糖、果糖、蔗糖，含有上述碳水化合物的糖蜜、淀粉或淀粉水解物、醋酸或丙酸等有机酸、乙醇或1-丙醇等的醇类。
作为氮源，氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他的含氮化合物、胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸液、酪蛋白水解物、小麦蛋白和小麦蛋白水解物、大豆饼、大豆饼提取物、各种发酵菌体及其消化产物都可以使用。
作为无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
所述的培养在振荡培养或深层通气搅拌培养等好气条件下进行。培养温度在15～40℃为宜，培养时间通常为16小时到7天。培养过程中优选将pH保持在3.0～9.0。pH的调整用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
此外，在培养过程中根据需要可添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。
作为启动子，培养使用诱导型启动子的重组载体转化的微生物时，根据需要可以向培养基中添加诱导物。例如培养使用lac启动子的重组载体转化的微生物时可向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，培养使用trp启动子的重组载体转化的微生物时，可向培养基中添加丙烯酸吲哚等。
作为培养以动物细胞为宿主细胞所得的转化子的培养基可以使用常用的RPIM1640培养基[J.Am.Med.Assoc.，199，519(1967)]、Eagle的MEM(最低限度基本培养基)[Science，122，501(1952)]、Dalbecco改良培养基[Virology，8，396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73，1(1950)]，或向上述培养基中添加胎牛血清后所得的培养基等。
所述培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在的条件下进行1到7天。
此外，在培养过程中根据需要可添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为培养以昆虫细胞为宿主细胞所得的转化子的培养基可以使用常用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制)、Sf-900II SFM培养基(Invitrogen公司制)、ExCell400、ExCell405(均由JRH生命科学公司制)、Grace昆虫培养基[Nature，195，788(1962)]。
所述培养通常在pH6～7、25～30℃的条件下进行1到5天。
此外，在培养过程中根据需要可添加庆大霉素等抗生素。
作为培养以植物细胞为宿主细胞所得的转化子，可以作为细胞培养，或通过培养使其分化为植物的细胞或器官。作为培养所述转化子的培养基可以使用常用的Murashige和Skoog(MS)培养基、怀德氏(White)培养基、或向所述培养基中添加生长素、胞质分裂素等植物激素。
所述培养通常在pH5～9、20～40℃条件下进行3到60天。
此外，在培养过程中根据需要可添加卡钠霉素、潮霉素等抗生素。
如上所述，来自带有整合了编码本发明多肽的DNA的重组载体的微生物、动物细胞或植物细胞的转化子，通过常规的培养方法培养，生成并积累所述的多肽，从培养物中收集所述多肽，由此制备所述多肽。
通过酵母、霉菌、动物细胞或昆虫细胞或植物细胞表达时可以得到添加了糖或糖链的多肽。
作为本发明的多肽的制备方法有在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法或在宿主细胞外膜上生产的方法，根据所使用的宿主细胞或对所生产的多肽的构造的改变来选择上述的方法。
当在宿主细胞内或宿主细胞的外膜上生产本发明的多肽时，可以利用Paulson等的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)]、GenesDevelop.，4，1288(1990)、或特开平5-336963、WO94/23021等记载的方法进行、所述的多肽可主动地分泌到细胞外。
即，利用遗传重组的方法，通过表达在含有本发明多肽活性部位的多肽前添加了信号肽的形式表达的本发明的多肽可主动地分泌到宿主细胞外。
此外，按照特开平2-227075中所记载的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因等基因扩增系可以使产量提高。
此外可利用公知的方法[J.Biomol.NMR，6，129(1998)]、Scinece，242，1162(1988)、J.Biochem.，110，166(1991)通过体外转录翻译系统生产本发明的多肽。即，将编码本发明多肽的DNA串连到SP6、T7或T3等启动子下游，通过与特异于不同启动子的RNA聚合酶反应，大量体外合成编码本发明多肽的RNA后，应用利用例如兔网织红细胞或小麦胚芽提取物无细胞系的翻译体系生产本发明的多肽。
为了分离纯化用本发明的转化子生产的多肽，可以利用常规的酶的分离纯化方法。例如本发明的多肽以细胞内溶解状态表达时，培养完成后，离心分离回收细胞，用水性缓冲液悬浮后，用超声波粉碎机(French press，Mantn Gaulin homogenizer)或Dyno粉碎机破碎细胞得到无细胞抽提液。从离心分离该无细胞抽提液所得的上清液，利用常规的酶分离纯化方法，即溶剂抽提法、硫胺等盐析法、脱盐法、有机溶剂沉淀法、应用二乙胺基乙基(DEAE)-纤维素、DIAION HPA-75(三菱化成公司制)等树脂的阴离子交换色谱法、应用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换色谱法、应用丁基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶等树脂的疏水性层析法、利用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电电泳等电泳方法单独或组合使用来纯化样品。向pRSET系列的载体(Invitrogen公司制)、pGEX系列的载体(Amersham生命科学公司制)等、本发明的多肽上附加标记来表达时，可以利用镍树脂、谷胱甘肽等适当的载体进行亲和纯化。
此外，当所述多肽在细胞内以不溶物的形式表达时，同样地收集细胞后，破碎，离心分离回收作为沉淀组分的多肽不溶物。将回收的多肽不溶物用多肽变性剂溶解。将该可溶液体稀释或透析，降低该可溶液体中多肽变性剂的浓度，恢复所述多肽的正常立体构造。在该操作后，利用与上述同样的分离纯化方法可以得到该多肽的纯化样品。
当本发明的多肽，或在该多肽上附加了糖链的多肽等的衍生物分泌到细胞外时，可以在培养物上清液中回收该多肽或该多肽的衍生物。即，利用与上述同样的离心分离方法处理该培养物得到培养物上清液，从所述的上清液中用与上述同样的分离纯化方法可以得到纯化样品。
作为由上述方法得到的本发明的多肽，例如含有序列号2所示的氨基酸序列的多肽、含有序列号10所示的氨基酸序列的多肽。
另外，本发明的多肽可以使用Fmoc法(芴基甲氧基羰基)、tBoc法(丁基羰基)等化学合成方法制备。另外也可以利用应用生物系统公司、Advanced ChemTech公司、岛津公司等的多肽合成仪通过化学合成制备。
再有，本发明的多肽也可以通过培养具有生产本发明的多肽的能力的微生物获得。所述的微生物，可以是具有生产本发明的多肽的能力的任何一种微生物，优选霉菌、特别是曲霉属、青霉属、腐质霉属、木霉属、毛霉属和镰刀菌属中的一个属的霉菌。
特别优选的是可以使用属于曲霉属的霉菌的选自米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、川地曲霉、寄生曲霉、黄色曲霉、Aspergillusnomius、烟曲霉和构巢曲霉中的一种的曲霉。此外，具有生产本发明的多肽的能力的微生物可以是野生菌株、转化子、突变株中的任意一种，但优选通过转化、突变处理使生产本发明的多肽的能力得以提高的微生物。作为突变处理方法例如可以紫外线照射、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等诱变剂处理，微生物的培养和多肽的纯化可利用与上述的微生物转化子的培养和多肽纯化方法相同的方法进行。
(3)蛋白质水解物的制备方法向含蛋白质的原料中添加具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性的多肽和蛋白质水解酶，混合，通常在20℃～60℃、优选在30℃～50℃反应24～264小时，优选48～240小时，可以制备蛋白质水解物。此外，也可以通过向含蛋白质的原料中先添加蛋白质水解酶混合通常在20℃～60℃、优选在30℃～50℃反应24～264小时，优选48～240小时进行蛋白质水解反应后，再添加具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性的多肽混合，通常在20℃～60℃、优选在30℃～50℃反应5～96小时，优选12～72小时进行制备。在后者的情况下，在添加具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性的多肽时也可以添加其他的蛋白水解酶进行反应。只要能使具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性的多肽和蛋白质水解酶发挥作用，任何pH都可，但优选调节至pH5～8。
利用此种制备方法，具有焦谷氨酸肽酶活性的多肽既可以使用由上述(2)中的方法纯化所得的多肽，也可以使用未经纯化的多肽、由上述(2)中的含编码具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性多肽的DNA的重组DNA的上述转化子、或在培养基中培养的能生产具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性多肽的微生物所得的、含具有本发明的焦谷氨酸肽酶活性的多肽的培养物或该培养物的处理物。
蛋白质水解酶的例子可以使用香料酶(flavorzyme)(ノボノルテイスク公司制)、曲霉的培养物。作为曲霉在酿造领域中所用的任意一种曲霉均可使用，可举出的有米曲霉、酱油曲霉等。本发明的制造方法中的原料中所含的蛋白质没有特别的限定，但谷氨酸含量高是优选的。此外，含蛋白质的原料只要蛋白质含量高即可，不必是纯化的蛋白质。例如，小麦面筋、脱脂大豆、经纯化的大豆蛋白质等。反应终了后，去除未反应的原料蛋白和菌体后，根据需要通过浓缩、干燥可以获得水解率高的蛋白质水解物。
(4)能特异识别本发明的多肽的抗体的制备(a)多克隆抗体的制备将由上述(2)中所记载的方法获得的本发明的多肽的全长或部分片段的纯化样品，或由本发明的多肽的一部分的氨基酸序列组成的肽作为抗原免疫动物，即可以制备可与本发明的多肽特异结合的多克隆抗体。作为免疫方法，可以是将抗原的完整片段施用于动物的皮下、静脉内或腹腔内，但优选将抗原性高的载体蛋白质与抗原结合来施用、或将适当的佐剂与抗原一起施用。
作为抗原的肽可以使用Fmoc法(芴基甲氧基羰基)、tBoc法(丁基羰基)等化学合成方法制备。另外也可以利用应用生物系统公司、Advanced ChemTech公司、岛津公司等的多肽合成仪通过化学合成制备。
载体蛋白质的例子如匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin)、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白，作为佐剂，例如弗氏完全佐剂、氢氧化铝和百日咳菌的疫苗等。
作为被免疫的动物，例如兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠等非人哺乳动物。
对于抗原的施用，是在第一次施用后每隔1～2周施用3～10次。每次施用后第3～7天从眼底静脉丛采血制备血清，用和免疫用抗原反应的酶免疫测定法(ELISA)[酶免疫测定法(第3版)、医学书院(1987)、抗体实验手册，冷泉港实验室出版社(1988)]确定上述的血清与抗原之间的反应。抗原的施用量优选每只动物每次施用50～200μg。
针对免疫用抗原，从充分显示抗体滴度数的动物的全血清中获得血清，通过对该血清进行分离纯化可以得到针对本发明多肽的抗体。作为分离纯化的方法例如，离心分离、40～50％的饱和硫酸铵盐析、辛酸沉淀[抗体实验手册，冷泉港实验室出版社(1988)]、或DEAE-琼脂糖凝胶柱、阴离子交换柱、蛋白A或G柱或凝胶过滤柱的层析方法等，单独或组合使用上述处理方法。
(b)单克隆抗体的制备(i)抗体—产生细胞的制备在上述的(a)中，针对免疫用抗原，其血清充分显示抗体滴度数的小鼠或大鼠作为抗体—产生细胞的供给源。
在最后一次给小鼠或大鼠使用抗原物质后3～7天，摘除显示充足的抗体滴度的小鼠或大鼠的脾脏。将该脾脏在MEM(最低限度基本培养基)中磨碎、用镊子理开，1200rpm离心分离5分钟后，弃上清。所得沉淀组分的脾细胞在Tris-NH4Cl缓冲液(pH7.65)中处理1～2分钟去除红细胞后用MEM洗3次，将所得的脾细胞作为抗体—产生细胞。
(ii)骨髓瘤细胞的制备骨髓瘤细胞使用由小鼠或大鼠取得的细胞株。可以利用例如来自耐8-氮鸟嘌呤的小鼠(BALB/c)的骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1[Curr.Topics Microbiol.Immol.，81，1(1978)、Eur.J.Immunol.，6，511(1976)]、SP2/0-Ag14[Nature，276，269(1978)]、P3-X63-Ag8653[J.Immunol.，123，1548(1979)]、P3-X63-Ag8[Nature，256，495(1975)]等。所述的细胞株用8-氮鸟嘌呤培养基[向RPMI1640培养基中添加1.5mmol/L谷氨酰胺、50μmol/L2-巯基乙醇、10μg/mL庆大霉素和10％胎牛血清的培养基(以下称正常培养基)、此外添加15μg/mL8-氮鸟嘌呤所得的培养基]传代，细胞融合的3～4天前用正常培养基培养，用2×107个或更多上述细胞进行融合。
(iii)杂交瘤的制备将由(i)中制备的抗体—产生细胞和(ii)中制备的骨髓瘤细胞用MEM或PBS(1.83g/L磷酸二钠、0.21g/L磷酸钾、7.65g/L NaCl，pH7.2)充分洗净、以细胞数为抗体—产生细胞∶骨髓瘤细胞＝5～10∶1混合，1200rpm离心分离5分钟后，弃上清。
将所得沉淀部分的细胞群充分疏松，在37℃下一边搅拌该细胞群一边以每108抗体—产生细胞添加由PEG-1000 2g、MEM 2mL和二甲基亚砜0.7mL混合后所得的溶液0.2～1mL，再每1～2分钟添加MEM1～2mL。添加后用MEM调节至总体积50mL。将上述配制的溶液900rpm离心分离5分钟后，弃上清。
将所得的沉淀细胞组分缓缓理开后，用带刻度的移液管吸入，再缓慢地吹出到100ml HAT培养基[向正常培养基中加入0.4mmol/L次黄嘌呤、15μmol/L胸苷和0.4μmol/L氨基喋呤]悬浮。将该悬浮液以100μL每孔注入到96孔培养板在含5％CO2的孵育箱中于37℃下培养7～14天。
培养后，取部分培养液上清通过ELISA检测培养液上清中与本发明的多肽特异结合的抗体，由此筛选生产与本发明的多肽特异结合的抗体的杂交瘤。
ELISA的具体例子，如可按下述方法进行。免疫时，将用做抗原的多肽或肽适当地铺板，用杂交瘤培养物上清或下述(iv)中所得的纯化抗体作为第一抗体反应后，与用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体(抗体—产生细胞来自大鼠时是抗大鼠免疫球蛋白抗体)反应。根据标记酶添加发色基质，进行反应，检测与抗原结合的第一抗体。
用该杂交瘤通过有限稀释法反复两次克隆[第一次用HT培养基(由HAT培养基中去除氨基喋呤所得的培养基)、第二次用正常培养基]具有稳定、高抗体滴度的确定为生产可与本发明的多肽特异结合的单克隆抗体的杂交瘤株。
(iv)单克隆抗体的制备向已经被腹腔内施用0.5ml二苯哌酮(2，6，10，14-四甲基十五烷)的8～10周龄的小鼠或裸鼠的腹腔内注射(iii)中得到的产生可与本发明的多肽特异结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，剂量为5～20×106细胞/只，然后生长2周。在10～21天使杂交瘤腹水癌化。从腹水癌化的小鼠中采集腹水，3000rpm离心5分钟去除固形物。可从所得的上清液中利用与上述多克隆抗体的纯化方法同样的方法纯化单克隆抗体。
抗体亚型的确定用小鼠单克隆抗体分型试剂盒或大鼠单克隆抗体分型试剂盒进行。蛋白质的量用罗利法或通过测定280nm下的吸光度进行测定。
(5)用能与本发明的多肽特异结合的抗体检测本发明的多肽及其定量法用(4)中所得的与本发明的多肽特异结合的抗体进行抗原抗体反应，可对本发明的多肽进行免疫学地检测和定量。作为测试样品可以用细胞抽提液或培养物上清液。
作为免疫学检测和定量方法，例如荧光抗体法、ELISA、放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、免疫组织染色法或免疫细胞染色法、免疫印迹法、点印迹法、免疫沉淀法、夹心ELISA[单克隆抗体实验手册(论坛社サイインテイフイツク)(1987)、继续生物化学实验讲座5，免疫生物化学研究法(东京化学有限公司)(1986)]等。
荧光抗体法是将测定样品与能和本发明的多肽特异结合的抗体反应、再与用异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光物质标记的抗体结合的抗体(例如与本发明的抗体特异结合的抗体是小鼠抗体时抗小鼠IgG抗体或其片段)反应后，用流式细胞仪对荧光素进行测定，由此检测本发明的多肽的方法。
ELISA是将测定样品与能和本发明的多肽特异结合的抗体反应、再将用过氧化物酶标记的该抗体和结合抗体反应后，根据标记的酶添加发色基质反应后，用分光光度计测定发色色素，由此检测本发明的多肽的方法。
RIA法是将测定样品与能和本发明的多肽特异结合的抗体反应、再将施用了放射性标记的该抗体和结合抗体反应后，用闪烁计数管等测定放射能量，由此检测本发明的多肽的方法。
免疫细胞化学或免疫组织化学是将细胞或组织切片的测定样品和本发明的多肽特异结合的抗体反应、再与施用了FITC等荧光物质、过氧化物酶、生物素的抗体与结合抗体反应后，用显微镜观察，由此检测本发明的多肽的方法。
免疫印迹法(Western blot)法是将测试样品经SDS-PAGE[抗体实验手册，冷泉港实验室(1988)]分离后，将该凝胶印迹到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，将该膜与能和本发明的多肽特异结合的抗体反应，再与施用了FITC等荧光物质、过氧化物酶、生物素的抗体与结合抗体反应后，根据标记物质进行反应，由此检测本发明的多肽的方法。
点印迹法是将测定样品印迹到硝酸纤维素膜上，将该膜与能和本发明的多肽特异结合的抗体反应，再与施用了FITC等荧光物质、过氧化物酶、生物素的抗体与结合抗体反应后，根据标记物质进行反应，由此检测本发明的多肽的方法。
免疫沉淀法是将测定样品与能和本发明的多肽特异结合的抗体反应，添加具有与蛋白A-纤维素等免疫球蛋白特异结合能的载体形成抗原抗体复合物，通过分离检测本发明的多肽的方法。
夹心ELISA法是将能和本发明的多肽特异结合的抗体吸附于板上，测定样品反应后，与用过氧化物酶标记的本发明的多肽特异结合，与和上述抗体的抗原识别部位不同的抗体反应，根据标记酶添加发色基质反应，用分光光度计检测发色色素由此检测本发明的多肽的方法。
用(2)中记载的方法可制备一定浓度纯化的本发明的多肽样品溶液，用上述测定方法检测该分级稀释物。由各浓度样品的测定值制成检测线，通过与测定样品的测定值相比较可对本发明的多肽进行定量。
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。此外，实施例中的各种基因操作按照CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987)所记载的方法进行。
本发明的最佳实施方案实施例1完整基因组基因枪文库的制备1.插入DNA的制备(1)染色体DNA的获得将曲霉菌株RIB40(ATCC 42149)的胞子接菌到YPD(0.5％酵母提取物、1％蛋白胨、2％葡萄糖)培养基中，30℃下振荡过夜。然后利用飯村的方法[Agric.Biol.Chem.，51，323(1987)]抽提基因组DNA。用Watson等的方法[Methods Enzymol.，118，57(1986)]将与基因组混合在一起的线粒体DNA通过通过氯化铯超速离心纯化为单纯的染色体DNA。
(2)染色体DNA的片段化将所得的纯粹的染色体DNA用随机DNA片段化装置HydroS hear(トミ一精工)装置断裂，使染色体DNA成为1～2kb大小的片段。
(3)片段化DNA的末端处理将片段化的染色体DNA用BAL核酸酶(宝酒造)处理，然后用Klenow片段(宝酒造)处理，使末端钝化。
(4)在末端添加适配子在末端钝化化的染色体DNA片段的两端，以含有5’末端磷酸化的如序列号6和7所示的核苷酸序列的DNA作为适配子，由T4 DNA连接酶(宝酒造)连接。
2.载体中插入DNA的插入及转化将pUC19用限制酶SalI(宝酒造)切断后，用TaqDNA聚合酶(罗氏诊断试剂)将胸苷残基插入到SalI切断部分。由此制得的质粒用碱性磷酸酶(宝酒造)处理作为脱磷酸化的载体以备利用。将载体和上述制备的染色体DNA片段用T4 DNA连接酶连接，通过电穿孔法转化大肠杆菌DH10B(Gibco)。
3.核苷酸序列将大肠杆菌转化子在2×YP培养基中37℃下培养10小时，收集菌体，于无菌水中99℃加热处理10分钟。将上清作为模板DNA水溶液通过98℃20秒、68℃2分钟的30个PCR循环扩增包含测序用引物退火部位的插入片段全长。所得的DNA片段用作Sanger法的模板，以M13通用引物或M13反向引物，用Perkin Elmer公司的PRISM Dye-Terminator测序试剂盒，根据试剂盒中所附的说明书进行测序反应。通过凝胶过滤从测序反应的产物中去除未反应的Dye-Terminator用Perkin Elmer公司的3700DNA测序仪解读DNA片段的核苷酸序列。3700 DNA测序仪输出的波形数据用Phred(Phil Green)再解析，去除载体和适配子序列后用SPS Phrap(Southwest Parallel Software公司)装配，构建米曲霉菌株RIB-40基因组DNA的重叠群。
实施例2基因的鉴定来自基因组DNA核苷酸序列的基因的鉴定是考虑到已经取得的EST序列信息、已知的蛋白质氨基酸序列数据库的同源性信息的同时，将根据浅井潔等的算法[Pacific Symposium on Biocomputing，98，228(1998)]基因区域预测系统GeneDecoder和基于後藤修等的算法的[Bioinformatics，16，190-202(2000)]的基因区域预测系统ALN组合起来，由以下(1)～(7)的方法对基因组DNA核苷酸序列重叠群进行的。
(1)BLAST同源性基因候补区域的提取从基因组DNA核苷酸序列的重叠群中将与已知蛋白质氨基酸序列具有高同源性的区域提取出来。氨基酸序列的同源性可根据Karlin和Altschul的算法利用BLAST[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264(1990)]确定。根据此种算法，开发了称作BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403-410(1990)]、可以直接检索出由基因组DNA核苷酸序列翻译成氨基酸序列时同源性高的区域。这种解析方法的具体方式是公知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。利用该方式对基因组DNA核苷酸序列的重叠群进行查询序列、通过SWISSOPROT39版[Nucleic AcidsRes.，28，45(2000)]和NRaa数据库进行BLASTX检索，提取BLAST算法中同源性指标E-值(E值低表示同源性高)10-30以下的区域。从这些区域中将同源性更高的部分优先提取出来，将相互不重叠的基因候补区作为BLAST同源性基因候补区。
(2)ALN基因候补区的提取BLAST同源性基因候补区中，与成为同源性对象的蛋白质的氨基酸序列的全长的90％或更多的区域具有同源性的序列为核心，应用针对重叠群序列的基因区域预测系统ALN提取出的基因候补区作为ALN基因候补区。ALN在成为相同性对象的蛋白质氨基酸序列的全长中，通过对重叠群进行排列的同时特别规定拼接部位，预测基因区域。
(3)GD同源基因候补区域的提取BLAST同源性基因候补区中，与成为同源性对象的蛋白质的氨基酸序列的全长的20％以上90％以下的区域具有同源性的序列为核心，应用针对重叠群序列的基因区域预测系统GeneDecoder提取出的基因候补区作为GD基因候补区。GeneDecoder综合BLASTX的E值和蛋白质编码区域的指向性指标2连密码子统计量，考虑连接部位的位置依存一元Markov模型得分预测基因区域。
(4)EST-GD基因候补区的提取就利用对应于重叠群序列的EST确定的基因表达的区域而言、其附近的重叠群序列应用GeneDecoder，不仅由EST确定的基因区域，预测的全部基因区域抽提出的基因候补区域作为EST-GD基因候补区。
(5)一般GD基因候补区的提取对于不包含在(1)到(4)的基因候补区中的重叠群序列应用GeneDecoder，预测基因区域抽提出的基因候补区作为一般GD基因候补区。
(6)tRNA基因候补区的提取在全部的重叠区应用tRNA-scan，提取出的tRNA基因候补作为tRNA基因候补区。
(7)基因候补区的合并按照下述的顺序，合并(2)到(6)的基因候补区。首先在(2)到(6)的基因候补区中，将与由EST确定的拼接部位相矛盾的基因区域预测物去除。剩下的基因候补区域中，去除相互重叠的区域后，合并。此时，优先按tRNA基因候补区、ALN同源性基因候补区、GD同源性基因候补区、GD-EST基因候补区、一般GD基因候补区的顺序合并。合并所得的基因候补区作为预测基因组。序列号1所示的核苷酸序列是由此所得的预测基因中的一个的核苷酸序列。
按照或更多的顺序，由相同的观点，与已知蛋白质的全长具有同源性的基因、与已知蛋白质的部分具有同源性的基因、与已知蛋白质不具有同源性的基因，根据这一顺序由可信性鉴定保证。此外，从表达确认的观点，按照可利用EST确认表达的基因、不能利用EST确认表达的基因的顺序的可信性鉴定，此外，可以保证全部的候补基因不与由EST特别规定的拼接部位相矛盾。
所用的方法采用不允许在蛋白质编码区域中包含起始终止密码子的算法、将假基因预测为目的基因可能性小。
关于功能的确定，对于所预测的基因区域，以NRaa为数据库，用BLAST进行同源性检索，为特别指定功能，以充分的同源性(E-值10-30)作为阈值确定功能。
此外为了从所预测的基因中提取出高纯度的焦谷氨酸肽酶，公知的焦谷氨酸肽酶基因的核苷酸序列为查询序列，上述预测的基因序列为数据库进行BLASTX的检索结果确定了，序列号1所示的核苷酸序列组成的预测基因和人的焦谷氨酸肽酶I(GenBank登录号AJ278828)具有E值6.1×10-5同源性。因此认为序列号1所示的核苷酸序列组成的DNA是编码来自米曲霉的焦谷氨酸肽酶。再有，在序列号1所示的核苷酸序列编码序列号2所示的氨基酸序列，并且其中有一个内含子。在序列号1所示的核苷酸序列中，含有作为功能区域的启动子区域，5’非翻译区的核苷酸序列如序列号3所示，3’非翻译区的核苷酸序列如序列号4所示，去除了内含子和非翻译区的编码区域的核苷酸序列如序列号5所示。
实施例3米曲霉焦谷氨酸肽酶cDNA的克隆(1)米曲霉菌株RIB 40 cDNA的制备在下述条件下培养米曲霉菌株RIB 40。向60ml YPD培养基(2％葡萄糖、2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％的磷酸钾、0.05％的7水硫酸镁)中接种该菌，用固定到板上的300ml三角瓶在30℃下150rpm振荡培养2天。将培养物过滤得1g湿菌体，移入放入了液氮的乳钵中用液氮冻结，用乳棒磨成微细的粉末。
由所述粉末用RNeasy Midi试剂盒(RNeasy Midi KitQiagen公司制)抽提总RNA。
由所得的总RNA用OligotexTM-dT30 super mRNA纯化试剂盒(OligotexTM-dT30 super mRNA Kit宝酒造公司制)制备0.6μg/ml的mRNA溶液100μl。向所述溶液中添加10μl的3mol/l的醋酸钠溶液(pH5.2)和250μl 99.5％的乙醇，剧烈搅拌后，在20℃下静置2小时。12000rpm离心20分钟后，将沉淀用200μl 70％的乙醇洗过后，用6μl二乙基焦碳酸盐处理水溶解。
回收的mRNA用作进行第一链和第二链cDNA合成的PCR的模板，所述的合成是利用用于cDNA合成和克隆的应用GATEWAY技术的SUPERSCRIPT质粒合成系统(SUPERSCRIPT Plasmid System withGATEWAYTMTechnology for cDNA System)进行的。
(2)通过PCR进行米曲霉的焦谷氨酸肽酶cDNA的克隆以及焦谷氨酸肽酶表达质粒的构建设计并合成由序列号1所示的核苷酸序列设计的含有序列号8和序列号9所示的核苷酸序列的引物。
PCR是利用上述作为引物和模板的(1)制备的米曲霉cDNA和Premix Taq(Premix Taq宝酒造公司制)、程序温度控制系统(ProgramTemp Control System)PC-700(Astec公司制)进行的。首先在94℃加热5分钟使模板DNA变性后，94℃2分钟、56℃30秒、72℃1分钟30秒的反应进行30个循环。反应液经0.8％琼脂糖凝胶电泳的结果检测出约850bp的DNA片段。
将上述DNA片段用GENECLEAN试剂盒(GENECLEAN Kit、Q-Biogene公司制)纯化后，用限制酶PstI和EcoRI切断，与同样经PstI和EcoRI切断的原核生物表达用质粒pRSET C(Invitrogen公司制)连接。所述的连接是用连接试剂盒2型(宝酒造公司制)进行的。用所得的质粒混合液通过氯化钙法[J.Mol.Biol.，53，159(1970)]转化大肠杆菌DH5α(宝酒造公司制)，用含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1％蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)选择转化子。
在上述培养基上的繁殖菌株(转化子)进行常规地液体培养、用常规的方法抽提质粒DNA，将该质粒DNA用PstI和EcoRI切断，通过琼脂糖凝胶电泳确认插入片段。结果检出了向质粒pRSET C的2.9kbp的DNA片段中添加的约850bp的插入片段。将该质粒命名为pPGP。pPGP是在T7启动子控制下的，表达具有序列号10所示氨基酸序列的米曲霉的焦谷氨酸肽酶的N末端添加含聚组氨酸标签的41个氨基酸残基的多肽的质粒。
实施例4利用大肠杆菌生产焦谷氨酸肽酶用在实施例3(2)中构建的焦谷氨酸肽酶表达用质粒pPGP通过钙法[J.Mol.Biol.，53，159(1970)]转化大肠杆菌BL21，用含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基(1％蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)选择转化子。
将所得的转化子接种到60ml的LB液体培养基(1％蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.5％NaCl)，然后25℃培养到对数生长后，添加终浓度1mmol/l的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(以下简称为IPTG)，在25℃下再培养3小时。
培养后收集菌体，将菌体悬浮于1ml的磷酸缓冲液中(50mmol/l Na2HPO4、0.5mol/l NaCl、pH8)，超声破碎、离心去除不溶性组分得到组蛋白提取液。将1ml粗蛋白提取液与平衡后的50％浓度的Ni-NTA树脂(Invitrogen公司制)混合，在4℃下孵育30分钟后，装入柱中。将Ni-NTA树脂用8ml含0.02mol/l咪唑的磷酸缓冲液洗2次后，用1ml含0.25mol/l咪唑的磷酸缓冲液溶出的约35kDa的蛋白质，用SDS-PAGE纯化为几乎单一的蛋白质。然后，用蛋白质测定试剂盒(Biorad公司制)测定回收的蛋白质的质量，为91.8μg。
焦谷氨酸对硝基酰苯胺(以下简称PCA-pNA)作为基质测定焦谷氨酸肽酶的活性。将PCA-pNA溶解于50mmol/l磷酸缓冲液中(pH7.5)中至终浓度5mmol/l制备基质溶液。向100μl基质溶液中添加20μl酶液，37℃下反应10分钟后，测定405nm的吸光值。计算摩尔吸光系数10500下对硝基苯胺的游离量，以37℃下1分钟使1μmol的对硝基苯胺游离的量为1单位(U)。测定由上述方法纯化的蛋白质溶液的活性，结果是具有6.6mU/ml的活性。另一方面，对不添加IPTG的菌体进行同样的纯化操作所得的溶液的活性在五十分之一以下，焦谷氨酰肽酶的活性依赖IPTG的诱导表达。因此，在pPGP中插入的DNA片段编码焦谷氨酰肽酶，可以用其制备焦谷氨酰肽酶，序列号10所示的氨基酸序列(序列号2所示的氨基酸序列的N末端添加了41个氨基酸残基所形成的氨基酸序列)组成的多肽可确定具有焦谷氨酰肽酶活性。
实施例5由焦谷氨酰肽酶作用制备蛋白质水解物向200ml