专利名称：一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法小麦是人类赖以生存的重要禾谷类作物之一，在世界范围内种植面积及总产量均超过了其它农作物，它的遗传改良始终是人们努力的重要目标。传统的小麦育种技术存在着育种周期偏长、增产潜力有限等局限性，随着生物技术的发展，利用基因工程技术对小麦进行品种改良越来越受到重视。在植物基因转化系统的研究方面，小麦相对于其它禾谷类作物如水稻、玉米等，表现出滞后性和困难性。小麦遗传转化研究始于20世纪80年代末期，由于小麦不是农杆菌的天然宿主，且小麦原生质体再生又相对困难，所以直到1992年 Vasi 1等人成功地将GUS和Bar基因通过基因枪法导入小麦胚性愈伤组织，并获得转基因植株以后，有关小麦转基因的报道才开始增多。目前，转基因水稻已经进入中间试验和安全性评价阶段，而小麦转基因的研究明显落后，还处于转化体系的建立和完善阶段。植物基因工程中，利用农杆菌介导的基因转移是目前研究的最多、转化机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。与基因枪转化法相比，农杆菌转化法具有很多的优势，如可以导入大片段目的基因，且目的基因多为单拷贝或低拷贝；容易排除冗余的质粒 DNA序列；插入边界多为T-DNA的边界序列，重排率低等。能否将这一方法用于小麦等单子叶植物的基因转移成为90年代前后研究的热点。当时，一种倾向性的观点是认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌介导转化单子叶植物几乎不可能或没有可能性。这种观点的代表人物是曾在小麦等禾谷类作物组织培养与基因枪转化方面卓有建树的瑞士科学家Potrykus，他在国际权威杂志Bio/Technology和Nature上发表了他的悲观论点。 随着农杆菌介导的石刁柏转基因植株的获得，特别是农杆菌介导的转基因水稻和转基因玉米植株的获得，不仅改变了单子叶植物不是农杆菌天然寄主的观点，而且证明农杆菌介导法完全可以用于禾本科作物的遗传转化。然而，迄今为止小麦的农杆菌转化仍然是世界上的一道难题。近年来，国内外很多的研究小组从小麦基因型、农杆菌菌株、共培养条件、外植体类型等多角度进行了大量的研究和探索，提出了很多套遗传转化体系，但都没有任何一套能被广泛的使用。目前，用于农杆菌介导转化的小麦外植体多为幼胚和成熟胚所形成的胚性愈伤组织，它们均需经过离体组织培养再生出转基因植株。然而，小麦的不同基因型对于植株的再生有着很大的影响，这进一步限制了通过组织培养途径获得转基因小麦。
本发明的目的是提供一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法，该方法不经过愈伤组织形成的步骤，具有适应性广、操作简单、转化周期短的优点。本发明所提供的方法是通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞，包括如下步骤CN 102533845 A1)将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，然后将接种后的所述小麦幼胚进行共培养使所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合；2)将经过步骤1)共培养的所述小麦幼胚直接接种于长苗培养基中培养，即得到具有根、茎和叶的幼苗。在上述方法中，为了防止小麦幼胚经农杆菌侵染后易褐化死亡，在步骤1)所述将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚之前，所述小麦幼胚还经过12- 小时、如M 小时的预培养；所述预培养具体可按照包括如下步骤的方法进行将所述小麦幼胚用预培养培养基在25°C下暗培养12-M小时、如M小时；所述预培养培养基的基础培养基可为MS培养基。在上述方法中，所述农杆菌可为发根农杆菌，如发根农杆菌R1000。在上述方法中，所述小麦幼胚为开花后13-15天的所述小麦幼胚。在上述方法中，步骤1)所述将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，按照包括如下步骤的方法进行将所述小麦幼胚浸泡于所述重组农杆菌的菌液中5 10分钟， 如5分钟；所述重组农杆菌菌液的OD6tltl为0. 5 0. 6，如0. 6。在上述方法中，在所述浸泡期间用超声波处理含有所述小麦幼胚的所述菌液 20 30s，如20s，所述超声波的频率为27kHz、功率为80w。在上述方法中，步骤1)所述共培养具体可按照包括如下步骤的方法进行将步骤 1)所述接种后的所述小麦幼胚用共培养培养基进行培养，为了防止所述接种后的所述小麦幼胚褐化，在所述共培养的培养基中可添加抗氧化剂，所述抗氧化剂具体可为二硫苏糖醇； 为了促进所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合，在所述共培养的培养基中还可添加乙酰丁香酮。在上述方法中，步骤1)所述共培养的时间为2-3天，如3天。在上述方法中，为了去除非转化细胞，在步骤幻所述的长苗培养基中可含有筛选转化体的选择压力，为了抑制农杆菌的生长，在步骤幻所述的长苗培养基中还可添加抑制农杆菌生长的抗生素。在上述方法中，所述预培养培养基具体可为含水解酪蛋白1.0g/L和2，4_D 2mg/ L的MS培养基，pH5. 8 ；所述共培养的培养基具体可为含乙酰丁香酮150 μ mol/L和二硫苏糖醇lg/L的MS培养基，pH5. 2 ；所述长苗培养基具体可为含头孢霉素200mg/L和潮霉素 100mg/L 的 MS 培养基，pH5. 8。本发明所述的方法中不包括形成愈伤组织的步骤。本发明的方法可应用于所有小麦，尤其适合于普通小麦。本发明的方法具有以下优点适应性广，适合于多个小麦品种的转化；操作简单， 不经过愈伤组织诱导和植株再生的步骤即可得到转基因植株；转化周期短，从侵染至获得具有根茎叶的转基因小麦幼苗仅需11-14天。本发明对于小麦品种的遗传改良、获得转基因小麦的新种质具有十分重要的意义。图1为Ttl代转基因小麦植株的PCR检测。其中，1为分子量标准DL2000 (从上到下依次为2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp和IOObp)，2_4分别为空白对照、阳性对照、 阴性对照，5-9分别为各品种的Ttl代转基因植株东农7742-24、Hite-17、龙麦9814-41、龙麦沈-5、龙辐麦10-32。图2为Ttl代转基因小麦植株的Southern杂交检测。其中，1_3分别为阳性对照、 阴性对照、分子量标准pBR3^/BamH I+Bg I+Hinf I (从上到下依次为4907bp、2176bp、 1766bp、1230bp、1033bp和653bp) ；4-8分别为各品种的Ttl代转基因阳性单株东农 7742-24、Hite-17、龙麦 9814-41、龙麦洸_5 和龙辐麦 10-32。


本发明公开了一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法。该方法包括以下步骤1)将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，然后将接种后的所述小麦幼胚进行共培养使所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合；2)将经过步骤1)共培养的所述小麦幼胚直接接种于长苗培养基中培养，即得到具有根、茎和叶的转基因小麦幼苗。本发明的方法具有以下优点适应性广，适合于多个小麦品种的转化；操作简单，不经过愈伤组织诱导和植株再生的步骤即可得到转基因植株；转化周期短，从侵染至获得具有根茎叶的转基因小麦幼苗仅需11-14天。本发明对于小麦品种的遗传改良、获得转基因小麦的新种质具有十分重要的意义。