专利名称：光合作用相关蛋白atctpa2的应用的制作方法光合作用即绿色植物、藻类和光合细菌利用太阳能把二氧化碳和水合成为富能的有机化合物的过程。叶绿体是绿色植物和藻类进行光合作用的细胞器。高等植物中的叶绿体进化出的基质和基粒片层结构是光合作用发生的主要位点。在这类片层膜上集聚了进行光合作用电子传递的四大复合体，即光系统I、光系统II、细胞色素b6f和ATP酶复合体。在这四大复合体中，光系统II是电子传递链中的第一个起作用的复合体，而在该复合体中， 组成该复合体的由PsbA基因编码的核心蛋白Dl又是一种非常重要的直接与反应中心色素即叶绿素a相互作用的蛋白。Dl蛋白在植物遭受光抑制的过程中存在一个快速的修复再生机制，可在一定程度上保护植物体免受强光的损伤。已知Dl蛋白是以前体形式合成的，即光合生物先合成前体D1，然后再通过蛋白酶的剪切使得前体Dl的C端的9-16个氨基酸序列被切下，Dl蛋白随即成为成熟的蛋白参与光合电子传递等一系列过程。加工Dl前体的蛋白酶被称为C末端加工蛋白酶，简称CtpA。该酶在高等植物如菠菜和大豆中都已经被成功克隆，但是到目前为止却并没有见到拟南芥中真正的CtpA酶的相关报道。然而，作为一种模式生物，研究拟南芥中的CtpA无疑会让我们更好地理解高等植物体中的光合作用，同时也为提高光合产率、研发优质的生物能源材料起到潜在的不容忽视的作用。
本发明的一个目的是提供ATCTPA2蛋白或其编码基因在改善和/或保护植物光系统II光合功能中的应用。本发明提供了 ATCTPA2蛋白或其编码基因在改善和/或保护植物光系统II光合功能中的应用；所述ATCTPA2蛋白是如下I)或2)蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白质。所述应用为将所述AtctpA2蛋白的编码基因导入由于ATCTPA2表达降低而表现为黄化苗的植物突变体，得到表现为绿化苗的植物。所述表现为绿化苗的植物的反应光系统II功能的PAM曲线(图10)以及反应光系统I功能的P700曲线(图11)都恢复正常，类似于野生型的。上述应用中，所述表现为绿化苗的植物的叶绿素的含量高于所述表现为黄化苗的植物突变体； 上述应用中,所述叶绿素具体为叶绿素a和/或叶绿素b。上述应用中，所述ATCTPA2蛋白的编码基因为(1)-(4)中任意一种DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)序列表中序列I自5’末端第1-1545位核苷酸； (3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的 DNA分子；(4)与(I)或⑵限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。上述应用中，所述ATCTPA2蛋白的编码基因通过重组表达载体导入所述植物突变体中。上述重组表达载体为将ATCTPA2蛋白的编码基因插入pCAMbial301载体Nco I和 BglII酶切位点间得到的载体。上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。上述应用中，所述双子叶植物为拟南芥。上述应用中，所述植物突变体为纯合株系，为salk_056011。上述ATCTPA2蛋白或其编码基因在将表现为黄化苗的植物突变体恢复为表现为绿化苗的植物中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述恢复为表现为绿化苗的植物具体体现在其叶绿素的含量高于所述表现为黄化苗的植物突变体；所述叶绿素进一步具体为叶绿素a和/或叶绿素b ;所述植物突变体进一步具体为纯合拟南芥株系，为salk_056011。上述ATCTPA2蛋白或其编码基因在提高表现为黄化苗的植物突变体叶绿素a和/ 或叶绿素b含量中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述表现为黄化苗的植物突变体是由于ATCTPA2表达降低引起的； 所述植物突变体进一步具体为纯合拟南芥株系，为salk_056011。本发明的实验证明，本发明在拟南芥中发现了一种与光合作用相关的蛋白 ATCTPA2，其可以使ATCTPA2表达降低的拟南芥突变体的黄化苗恢复为绿苗，且光系统II和光系统I的功能都恢复到了正常的水平。
图I为T-DNA插入的突变纯合体的表型图2为DNA水平上鉴定T-DNA插入突变体图3为T-DNA插入位点示意4为突变体RNA水平的鉴定图5为77K荧光光谱6为快速叶绿素荧光动力学分析图7为免疫印迹结果分析图8为Dl的免疫印迹检测图9为互补转基因拟南芥的表型及蛋白研究图10为互补转基因拟南芥的叶绿素荧光慢诱导曲线图
图11为互补转基因拟南芥的P·图

I、突变体材料的鉴定从美国ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购买了定位于叶绿体的核编码基因At4gl7740的T-DNA插入的突变纯合体(salk_056011)，据蛋白结构域及序列比对发现，该基因可能就是拟南芥中编码CtpA的基因，命名为AtctpA2，编码的蛋白命名为ATCTPA2。T-DNA插入的突变纯合体和野生型拟南芥(ABRC库中订购的，Col-O型)在MS培养基上生长，生长光强为40±5μπιΟ1 · m_2 · s—1，结果如图I所示，左为野生型拟南芥(WT)，右为T-DNA插入的突变纯合体(AtctpA2)，发现与野生型拟南芥相比，T-DNA插入的突变纯合体的子叶泛黄，真叶浅绿色，植株矮小。2周后将T-DNA插入的突变纯合体移至营养土中继续培养，发现其致死。说明T-DNA插入的突变纯合体是无法光合自养的。分别检测T-DNA插入的突变纯合体和野生型拟南芥中叶绿素含量，结果如表I所示，从表I看出，与野生型拟南芥相比，T-DNA插入的突变纯合体无论是叶绿素a还是叶绿素b的含量均有不同程度的下降(表I)。表I野生型和突变体中的叶绿素含量分析
Chl (Hg/g FW) Chl b (Hg/g FW) Chl a+b (Hg/g FW) Chl a/b (Hg/g FW)
T-DNAiiA288. 04±19. 83 121. 49 + 15. 62 409. 53±22. 312. 37±0. 02
的突变纯
合体 ____
_ 野生型拟1566. 40 + 72. 41518. 78 + 20. 87 2085. 18 + 75. 453. 02 + 0. 04
南芥2、RNA水平及蛋白水平上的鉴定分析T-DNA插入的突变纯合体的插入位点发现，T-DNA插在了该基因编码序列的启动子ATG上游的-39到-40之间(图2，图3)。图2为编号1、2和3为随机选定的几颗有表型的T-DNA插入的突变纯合体的苗子，WT为野生型拟南芥，图3为T-DNA插入位点示意图。RNA水平上的分析结果表明，该插入造成了 RNA转录的下调(图4，a为22个循环，b为25个循环，c为30个循环，d为38个循环。AtctpA2为T-DNA插入的突变纯合体，WT为野生型拟南芥)。另外，根据该基因产物的一段多肽设计了抗体，并用该抗体对其进行了检测，发现在突变体中几乎检测不到该蛋白的表达(图9c)，这表明该蛋白的表达在很大程度上被抑制了。
3、叶绿素荧光参数的分析77K检测结果如图5所示，表明突变体的峰型没有多大变化，但是峰高均发生了蓝移(图5)，这表明突变体的光系统I和光系统II都受到了不同程度的损伤。进一步对叶绿素荧光诱导动力学分析后发现，在Qa之前的电子传递受到了损伤， 即在光系统II氧化侧的电子传递出现了问题(图6，其中DCMU阻断Qa到Qb的电子传递)。4、免疫印迹检测结果为了更深入地了解光系统I和光系统II具体的蛋白表达的变化，进行了免疫印迹检测。检测后发现，光系统II的核心蛋白含量均有非常严重的下降(图7)。更为重要的是，与野生型相比，突变体中的前体Dl明显比野生型中有多得多的累积(图8)，这表明在突变体中Dl蛋白的加工过程很可能出现了问题。5、结论通过对拟南芥突变体的生理生化功能进行研究，现核基因atctpa2编码的 ATCTPA2是参与光合作用的重要蛋白分子，该蛋白很可能参与了 Dl前体的加工剪切，而Dl 前体的加工是光合作用正常运转所必需的，因此，该基因可能具有重要的应用价值。实施例2、转基因互补实验一、atctpa2基因的犹得atctpa2基因的核苷酸序列为序列表中的序列1，根据l_1545bp之间的序列设计引物，从拟南芥(Col-O生态型，购自拟南芥生物资源中心)基因组中扩出基因。所用引物如下Former :5，CATGCCATGGAGGTCCTTGCGAGCT 3，，Reverse :5，GAAGATCTTCATCTAGAAAAAAG TAGGCCTTGA 3’。扩增产物经切胶纯化后连接到pEASY_T3载体上，转入大肠杆菌DH5CI，筛选阳性克隆，进行PCR、酶切、测序鉴定。测序结果表明其核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第1-1545位核苷酸，命名为atctpa2，可编码序列2 中所示的蛋白，将该蛋白命名为ATCTPA2，将含有该片段的载体命名为pEASY-T3-atctpa2。二、重组载体、重组农杆菌的构建将pEASY-T3_atctpa2经Nco I和BglII酶切后克隆到经过同样酶切的 pCAMbial301(Cambia研究机构,也可购自上海希匹吉生物技术有限公司，)载体中，转入大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒，用基因扩增引物进行PCR扩增及Nco I和BglII双酶切鉴定为阳性克隆的质粒命名为pCAMbial301_atctpa2(得到1550bp为阳性)。将上述pCAMbial301_atctpa2 转入农杆菌菌株 GV3101 (Biovector Co. , LTD), 得到重组菌，用基因扩增引物进行PCR鉴定，将含有阳性质粒的重组菌命名为GV3101/ pCAMbial301_atctpa2。三、转基因互补实验1、转基因互补拟南芥的获得突变体纯合体不能自养，采用花粉浸染法将构建好的含有重组载体的农杆菌转化到T-DNA插入的杂合体植株(salk_056011)中，具体步骤如下将上述GV3101/pCAMbial301_atctpa2活化以后，用转化缓冲液(5%蔗糖，0. 02% 的Silwet L-77,无菌水定容)充分悬浮菌体后,将准备好的拟南芥杂合体植株剪去已经开放的花，浸入转化缓冲液中50s，取出保湿侧放，暗培养24h后，弱光下培养至种子成熟，收集种子进行纯合系的筛选，得到Ttl转基因互补拟南芥种子。收 集Ttl转基因互补拟南芥种子经表面灭菌后均匀地播洒于含40 μ g/ml潮霉素的MS固体培养板上，230C，100 μ mol · m_2 · s—1光强下生长2周后得到Ttl转基因互补拟南芥植株。以未转基因的T-DNA插入杂合体植株(salk_056011)为对照。观察Ttl转基因互补拟南芥幼苗，结果如图9a所示，Ttl转基因互补拟南芥幼苗明显较大，较绿的为阳性Ttl转基因互补拟南芥幼苗。采用同样的方法将空载体pCAMbial301导入T-DNA插入的杂合体植株(salk_056011)中，得到Ttl转pCAMbial301拟南芥幼苗，按照上述方法观察，T0转pCAMbial301拟南芥幼苗和未转基因的T-DNA插入杂合体植株(salk_056011)结果无显著差异，从而进一步证明了 AtctpA2蛋白可以改善和/或保护植物光系统II光合功能。2、转基因互补拟南芥的表型观察将上述2周大小的阳性Ttl转基因互补拟南芥幼苗(AtctpA2c0m)和野生型拟南芥(WT) —并移入土中生长，经鉴定背景为插入纯合体的互补苗与野生型表型基本无异，结果如图9b所示，这表明正是atctpa2单基因的突变造就了 salk_056011中纯合突变体的表型，说明该基因导入突变体后可以是黄化苗变绿，恢复突变前性状，从而说明蛋白ATCTPA2能够保护光系统II的正常光合功能。3、转基因互补拟南芥的蛋白水平研究分别提取阳性Ttl转基因互补拟南芥幼苗(com)、野生型拟南芥(WT)和T-DNA插入纯合体植株(AtctpA2)的全蛋白，统一定量到3.5 μ g/ul，上样量90 μ g，跑15%的SDS-Urea-PAGE，待溴酚蓝到达电泳前沿后，180mA电转膜I. 5h。室温封闭Ih后以I : 1000的比例加入制备的ATCTPA2—抗(氨基酸序列为序列2)，4°C摇床过夜。次日上午洗掉未结合的一抗，再加入I : 10000的山羊抗兔的二抗(购自中杉金桥生物公司)室温摇床结合2h，然后洗掉未结合的二抗，发光。结果如图9c所示，1/2WT、1/4WT、WT分别代表22. 5 μ g的野生型蛋白、45 μ g的野生型蛋白以及90 μ g的野生型蛋白上样量，AtctpA2代表90 μ g的纯合突变体蛋白上样量，可以看出，虽然RNA水平检测为knock-down表型，但是突变体中该蛋白的表达在如此大的上样量时仍不可见。图9d为互补后的蛋白水平的检测，上样量为135μ8，1/2ΙΤ、1/4ΙΤ、WT分别代表33. 75 Ug野生型蛋白、67. 5 μ g野生型蛋白以及135 μ g野生型蛋白的上样量，AtctpA2代表135μ g纯合突变体的上样量，AtctpA2c0m代表135 μ g互补阳性苗的上样量。具体的方法同9c。可以看出，互补后的株系中该蛋白的表达量与WT中的基本相同。4、光系统II功能的研究利用PAM-2100 (Walz)对阳性Ttl转基因互补拟南芥幼苗(AtctpA2com)、野生型拟南芥(WT)和T-DNA插入纯合体植株(AtctpA2)进行了 PAM曲线的测定。4周大小的叶片经暗适应30min后，先给一个照射测量光(避免进行光化学反应)，经过2min，荧光水平稳定后得到荧光参数Fo。再给一个脉冲饱和光，单脉冲结束后即得到荧光参数Fm，即光系统II的最大光化学效率。结果如图10所示，由图可知，互补之后的阳性苗Fv/Fm达到了 0. 83，与野生型基本无差异，而互补之前的T-DNA插入纯合体植株的光系统II的功能严重受阻，因为Fv/Fm只有0. 34。这说明纯合突变体中光系统II功能的损伤的确是由该基因的突变造成的。
5、光系统I的功能的研究在光合电子传递链中，光系统I位于光系统II的下游。为了进一步确定该基因的突变是直接造成了光系统II功能的缺失，对光系统I的功能也进行了测定。反应光系统I功能的光合参数之一便是P7Citi的还原态。P■的还原态使用PAM 101及其附件 ED-800T (Walz)测定。将阳性Ttl转基因互补拟南芥幼苗(AtctpA2c0m)、野生型拟南芥(WT) 和T-DNA插入纯合体植株(AtctpA2)的4周大小的等叶面积的叶片先暗适应30min,然后给一个30s的可以氧化P700的远红外(720nm, 0. 66 u mo I mH ,导致P700在820nm处的吸收值上升。上升的幅度反应的便是光系统I功能的正常与否。结果如图11所示，由图可以看出，纯合突变体中的光系统I的功能也受到了很大程度的损伤，而互补后的株系的光系统I的功能与野生型基本无异。
6、叶绿素的含量的检测取阳性Ttl转基因互补拟南芥幼苗(AtctpA2com)和T-DNA插入纯合体植株 (AtctpA2)的新鲜叶片各80mg，浸没于装有8ml 80%丙酮的试管中，室温避光放置IOh以上，至叶片脱色至白色。离心取上清，用分光光度计DU-800 (Beckman)测定663. 2和664. 8nm 处的吸光值。含量按照以下公式计算，单位为Ug/g FW叶绿素a 浓度(u g/g Fff) = 12. 21 X OD663.2-2 . 81 XOD64a8叶绿素b 浓度(U g/g Fff) = 20. 13 X OD646.2-5 . 03 X OD663.8叶绿素a+b 浓度(U g/g Fff) = 7. 18X0D663 2+17 . 32 X OD646 8实验重复三次，结果取平均值土标准差。结果如表2所示表2互补型和突变体中的叶绿素含量分析


本发明公开了一种光合作用相关蛋白ATCTPA2的应用。本发明提供了ATCTPA2蛋白的编码基因在保护植物光系统II光合功能中的应用。所述ATCTPA2蛋白是如下1)或2)蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与1)活性相同的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明在拟南芥中发现了一种与光合作用相关的蛋白ATCTPA2，其可以使ATCTPA2表达降低的拟南芥突变体的黄化苗恢复为绿色苗。