专利名称：人巨细胞病毒潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠及建立方法 AD(A1zheimer’s病)是一种进行性的中枢神经系统衰退的疾病，又称老年性痴呆。在老年人中，AD的发病率很高，世界上65岁以上人群中AD的发病率为5％～10％，在美国，AD病已成为第四大死亡原因，，随着我国人口平均寿命的延长，老年人口不断增加，AD患者不断增多，1989年和1990年的两次流行病调查表明我国60岁以上人群AD患病率为3.46％-6.41％，且呈上升趋势，该病已成为危害老年人身体健康，给家庭和社会带来沉重负担的严重疾病。但是，由于AD病因复杂，呈现“多因异质性”，使得对该病的研究进展一直十分缓慢，目前AD的病因学和发病机制尚不清楚，也没有客观的特异的早期诊断AD的生物学标志及有效的预防和治疗措施，因此，AD的防治仍为世界性的难题。也一直是20年来研究的热点。AD临床表现为慢性进行性的病变过程，发病早期出现短期记忆力丧失，随后，发展为进行性痴呆，主要表现为记忆力丧失，定向障碍，判断和推理能力受到损害等，发病晚期患者通常生活不能自理。其神经病理学特征为神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)、神经细胞外老年斑(senile plaque，SP)和神经细胞丢失、突触数减少。这些病理改变的生化基础是细胞外的淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)沉积和细胞内的微管相关蛋白——Tau蛋白的过度磷酸化。在防治AD过程中困难之一是缺乏相应的理想动物模型。理想的模型应该再现AD的行为学异常、神经病理学特征和神经生化的改变，尽管已有很多AD模型用于现有实验中，但他们都是依据不同的理论建立，大多采用单一因素造模，不能全面反映AD病理变化，如胆碱能损伤模型、异常代谢模型、天然老化模型、铝中毒模型。目前，研究衰老和痴呆较理想模型当属快速老化小鼠亚系8(SAMP8)和转基因模型，但这些模型除其价格昂贵，难以普及应用外，还不能很好地揭示AD发生发展的本质，一个能较全面模拟AD疾病的神经病理学的动物模型尚未见报道。
本发明的目的是提供一种人巨细胞病毒(HCMV)潜伏感染所导致的Alzheimer’sdisease(AD)病Balb/c模型小鼠。本发明的另一个目的是提供一种新的人巨细胞病毒(HCMV)先天性潜伏感染所导致的Alzheimer’s disease(AD)病Balb/c模型小鼠。本发明技术方案如下人巨细胞病毒HCMV潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠，其特征在于是通过HCMVAD169株感染Balb/c SPF级幼雌、雄鼠，饲养成年后得到。上述所述的模型鼠，其特征在于通过HCMVAD169株感染Balb/c SPF级幼雌、雄鼠，配对后待其生子鼠，其子鼠为HCMV先天潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠模型鼠。
人巨细胞病毒HCMV潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠的建立方法，其特征在于通过以下步骤建立而成(1)、建立HCMV潜伏感染小鼠模型并鉴定模型以1×105 PFU的HCMV AD169株感染8周龄Balb/c SPF级雌雄鼠，并设置DMEM对照组，饲养一年后，随机选取小鼠病毒感染组20只，相应20只对照小鼠，确定病毒感染组小鼠感染状态为潜伏感染；(2)、HCMV潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠的鉴定确定小鼠感染状态后，随机选取病毒感染组10只小鼠及对照组小鼠10只，做小鼠行为学实验，初步确定小鼠为老年性痴呆鼠，行为学实验后处死小鼠，进行脑组织神经病理学检测，确定小鼠脑组织神经细胞内神经元纤维缠(neurofibrillarytangles，NFTs)、神经细胞外老年斑(senile plaque，SP)和神经细胞丢失、突触数减少。
本发明通过以下步骤建立HCMV先天潜伏感染小鼠模型(1)、建立HCMV先天潜伏感染小鼠模型并鉴定模型以1×105 PFU的HCMV AD169株感染8周龄Balb/c SPF级雌雄鼠，并设置DMEM对照组，配对后待其生子鼠，饲养一年后，随机选取子代小鼠病毒感染组20只，相应20只对照小鼠，确定病毒感染组子代小鼠感染状态为先天潜伏感染；(2)、HCMV先天潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠的鉴定确定子代小鼠感染状态后，随机选取病毒感染组10只子代小鼠及对照组小鼠10只，做小鼠行为学实验，初步确定子代小鼠为老年性痴呆鼠，行为学实验后处死小鼠。进行脑组织神经病理学检测，确定子代小鼠脑组织神经细胞内神经元纤维缠(neurofibrillary tangles，NFTs)、神经细胞外老年斑(senile plaque，SP)和神经细胞丢失、突触数减少。
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)属于人类疱疹病毒β亚科病毒，全球有70％-90％成人感染HCMV，在AIDS类患者中感染率高达100％。人类感染HCMV后，终生潜伏于体内腺体的细胞和免疫细胞系等，在一定的条件下，如免疫力低下，病毒被激活，这种细胞经过激活可转变为增殖性感染和隐性感染。HCMV的激活与再激活随着机体免疫力的变化反复进行着，成为人类先天性感染的最常见病原体之一，先天性感染可导致胎儿畸形、流产、早产及迟发性中枢神经系统缺陷等发性中枢神经系统缺陷等。表现为小头畸形、脑瘫和癫痫。在模型中已发现神经元细胞和内皮细胞对HCMV有易感性，感染后神经元细胞减少和囊性变，引起脑萎缩。HCMV主要感染发育中的脑细胞，而很少感染成熟的脑细胞，平均1％的胎儿先天感染了HCMV，感染的胎儿约5％-10％出现急性脑部损伤，另外将近10％的感染胎儿出现亚临床先天感染，并随后出现中枢神经系统功能失调，亚临床感染或中枢神经系统功能失调发生在先天感染后很长时间。
潜伏的病毒可随髓系细胞而转入脑中。在激活时HCMV可经小胶质细胞感染神经元，引起细胞内钙或钙信号系统平衡而导致神经元凋亡，潜伏的病毒反复激活可导致细胞因子分泌增加，引起细胞凋亡，激活的星形胶质细胞和小胶质细胞可使Aβ增多，进而产生神经毒性，本发明利采用HCMV先天性潜伏感染的方式来建立的Alzheimer’s病小鼠模型，能较好地模拟AD发生发展的过程和神经学特征神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)、神经细胞外老年斑(senile plaque，SP)和神经细胞丢失、突触数减少。

2、激活实验分为体外体内激活A、激活前组织匀浆低速离心取上清，接种HF细胞，盲传三代，观察CPE，确定无CPE出现。
B、体内激活实验称量小鼠的体重，分别在第1、4、5天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg。在注射药物15天后，各组小鼠处死前称量体重后做如下实验a、在6孔板上培养HF细胞至形成单层，将实验所取小鼠脑组织进行组织匀浆(超声法)30-35W，15-20s。组织匀浆低速离心取上清，接种HF细胞，盲传三代，观察CPE，确定出现典型的CPE。
b、提取小鼠脑组织DNA及RNA，用HCMV UL83的引物及HCMV IE的引物进行扩增，PCR检测确定在病毒组激活前后均有检测HCMV基因，RT-PCR实验表明激活后检测HCMV基因的表达，而激活前无HCMV基因的表达。
c、石蜡包埋切片用于原位杂交定位检测HCMV IE DNA和UL83 DNA用DIG标记的UL83DNA和IE寡核苷酸探针行原位杂交，观察到小鼠大脑皮质和海马部位的存在HCMV基因。
C、体外激活实验利用热休克的方法体外激活神经元中潜伏感染的HCMV，将在六孔板中培养好的神经元细胞放入42-46℃的水中水浴15分钟，再置于37℃培养。培养4周后，取神经元细胞做如下实验接种HF细胞，病毒组激活后的神经元接HF细胞后能观察到病毒特征性的CPE，提取培养物的DNA及RNA，用HCMV UL83的引物及IE的引物进行扩增，检测到HCMV基因及其基因的表达。
3、激活前后取脑组织用2.5％戊二醛固定，10％锇酸固定后，乙醇脱水，树脂包埋后做常规超薄切片，染色，电镜观察激活后脑组织内有疱疹样病毒颗粒，并以HCMV pp65及HCMV LA单抗为一抗，做免疫电镜检测确定疱疹样病毒颗粒为HCMV。
二、建立HCMV先天潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠及鉴定随机选取确定为HCMV先天潜伏感染小鼠10只及DMEM对照10只小鼠进行鉴定病理学鉴定HE染色发现感染组小鼠大脑皮质神经元数量减少，出现红色斑块及神经元纤维缠结，但对照组未发现明显的病理改变；刚果红染色从感染组小鼠大脑皮质观察到淀粉样斑块；浸银染色从感染组小鼠大脑皮质可同时观察到淀粉样斑块和神经元纤维缠结，对照组小鼠大脑皮质也发现个别的神经元纤维缠结。同对照组相比，感染组小鼠大脑皮质tau蛋白及Aβ-淀粉样蛋白沉积团块分布密集，神经元纤维缠结数目显著升高，突触数密度和单位面积中的神经元数目则显著降低。
例2一、建立HCMV潜伏感染小鼠模型并鉴定模型以1×105 PFU的HCMV AD169株感染8周龄Balb/c SPF级雌雄鼠，并设置DMEM对照组，饲养一年后，随机选取小鼠病毒感染组20只，相应20只对照小鼠，确定病毒感染组小鼠感染状态为潜伏感染；二、HCMV潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠的鉴定确定小鼠感染状态后，随机选取病毒感染组10只小鼠及对照组小鼠10只，做小鼠行为学实验，初步确定小鼠为老年性痴呆鼠，行为学实验后处死小鼠，进行脑组织神经病理学检测，确定小鼠脑组织神经细胞内神经元纤维缠(neurofibrillary tangles，NFTs)、神经细胞外老年斑(senile plaque，SP)和神经细胞丢失、突触数减少。
本例中采取的实验方法同例1。


本发明涉及人巨细胞病毒潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠及建立方法，用于研究人类AD病的病因、病理及发病机制，其关键技术之处主要在于用HCMV AD169株感染8周龄Balb/c SPF级雌雄小鼠，建立子代小鼠Alzheimer’s病模型，此模型能全面的再现AD的行为学异常、神经病理学特征和神经生化的改变，为研究人类Alzheimer’s病的病因、病理发病机制、预防和治疗提供了工具。