专利名称：：对抗核糖核苷酸还原酶的r1与r2组分的抗肿瘤反义序列的制作方法：发明领域本发明的领域涉及控制赘生性细胞的致瘤性和/或转移的方法。具体而言，本发明涉及对抗哺乳动物核糖核苷酸还原酶的R1与R2组分的反义序列的应用。参考文献本申请引用下列公开出版物、专利申请和专利美国专利No.5,034,5061991年6月11日颁布的美国专利No.5,023,252国际专利申请No.PCT/US98/00540Agarwaletal.，(1995)Oncogene，11427-438Akhteretal.，(1991)″InteractionsofantisenseDNAoligonucleotideanalogswithphospholipidmembranes(liposomes)″.NucleicAcidsRes.195551-5559Alessietal.，(1995)Meth.Enzyymol.255279-290Altschul，etal.，(1990)″Basiclocalalignmentsearchtool″，J.Mol.Biol.215403-410Amaraetal.，(1994)″Phorbolestermodulationofanovelcytoplasmicproteinbindingactivityatthe3’-untranslatedregionofmammalianribonucleotidereductaseR2mRNAandroleinmessagestability″.J.Biol.Chem.2696709-7071Amaraetal.，(1995B)″Defininganovelciselementinthe3’-untranslatedregionofmammalianribonucleotidereductasecomponentR2mRNARoleintransforminggrowthfactor-βinductedmRNAstabilization″.NucleicAcidsRes.231461-1467Anazodoetal.，(1995)″Sequence-SpecificInhibitionofGeneExpressionbyaNovelAntisenseoligodeoxynucleotidePhosphonothioateDirectedAgainstaNonregulatoryRegionoftheHumanImmunodeficiencyVirusType1Genome″.J.Virol.691794-1801Anazodoetal.，(1996)″RelativeLevelsofInhibitionofp24GeneExpressionbydifferent20-merAntisenseOligonucleotideSequencesTargetingNucleotides+1129to+1268oftheHIV-1gagGenomeAnAnalysisofMechanism″.Biochem.Biophys.Res.Commun.229305-309AshiharaandBeserga，(1979)″CellSynchronization″.MethodsEnzymol.58248-262Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，BaltimoreMd.(1989)Blaesse，(1997)″GeneTherapyforCancer″ScientificAmerican276(6)111-115Bjorklundetal.，(1993)"Structureandpromotercharacterizationofthegenecodingthelargesubunit(R1Protein)ofmouseribonucleotidereductase″Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011322-11326BlinandStafford，(1976)″AgeneralmethodofisolationofhighmolecularweightDNAfromeukaryotes".NucleicAcidsRes.，32303-2308.Blosmanisetal.，(1987)CancerRes.471273-1277.Bradleyetal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA835277-5281.Buchardt，deceased，etal.，美国专利No.5,766,855Buchardt，deceased，etal.，美国专利No.5,719,262Calabretta，etal.，(1996)″Antisensestrategiesinthetreatmentofleukemias″.Semin.Oncol.2378Caras，(1985)″ClonedMouseRibonucleotideReductaseSubunitM1cDNARevealsAminoAcidSequenceHomologywithEscherichiacoliandHerpesvirusRibonucleotideReductases″BiolChem.2607015-7022Chadeeetal.，(1995)J.Biol.Chem27020098-20105Chanetal.，(1993)Biochemistry3212835-12840Changetal.，(1978)″PhenotypicexpressioninE.coliofaDNAsequencecodingformousedihydrofolatereductase″Nature，275617-624Changetal.；(1995)SomaticGeneTherapy，CRCPress，AnnArborMIChenetal.，(1993)″MammalianribonucleotidereductaseR1mRNAstabilityundernormalandphorbolesterstimulatingconditionsinvolvementofacis-transinteractionatthe3’-untranslatedregion″EMBOJ.，123977-3986Chenetal.，(1994B).″DefininganovelribonucleotidereductaseR1mRNAciselementthatbindstoanuniquecytoplasmictrans-actingprotein″NucleicAcidsRes.224796-4797Choyetal.(1989)BiochemBiophysResCommun1621417-1424Choyetal.，(1988)″Molecularmechanismsofdrugresistanceinvolvingribonucleotidereductasehydroxyurearesistanceinaseriesofclonallyrelatedmousecelllinesselectedinthepresenceofincreasingdrugconcentrations″CancerRes.482029-2035Crooke，(1995)″Progressinantisensetherapeutics″，Hematol.Pathol.259Damenetal.，(1989)″Generationofmetastaticvariantsinpopulationsofmutatorandamplificatormutants″J.Natl.CancerInst.81628-631Damenetal.，(1991)″TransformationandamplificationoftheK-fgfProtooncogeneinNIH-3T3cells，andinductionofmetastaticpotential″BiochemBiophys.Acta1097103-110Davisetal.，(1994)″Purification，Characterization，andLocalizationofSubunitInteractionAreaofRecombinantMouseRibonucleotideReductaseR1Subunit″Biol.Chem.26923171-23176DevereuxJ.etal.，(1984)″AcomprehensivesetofsequenceanalysisprogramsfortheVAX″，NucleicAcidsRes.12387-395Dreeleyetal.，(1992)Science，2581650-1654Edwardsetal.，(1985)MolCellBiol.53280-3288Egan，etal.，(1987A)″ExpressionofH-rasCorrelareswithMetastaticPotentialEvidenceforDirectRegulationoftheMetastaticPhenotypein10T1/2andNIH3T3Cells″Mol.Cell.Biol.7830-837Eganetal.，(1987B)″Transformationbyoncogenesencodingproteinkinasesinducesthemetastaticphenotype″Science238202-205Erikssonetal.，(1984)″Cellcycle-dependentregulationofmammalianribonucleotidereductase.TheSphase-correlatedincreaseinsubunitM2isregulatedbydenovoproteinsynthesis″J.Biol.Chem.25911695-11700Fanetal.，(1996A)″RibonucleotidereductaseR2componentisanovelmaiignancydeterminantthatcooperateswithactivatedoncogenestodeterminetransformationandmalignantpotential″Proc.Natl.AcadSci.USA9314036-14040Fanetal.，(1996B)″AlinkbetweenferritingeneexpressionandribonucleotidereductaseR2cDNA″FEBSLett.382145-148Felgneretal.，美国专利No.5,580,859Flintoff，(1989)Methotrexate，InGupta，R.S.(ed.)，DrugResistanceinMammalianCells，BocaRaton，Fla.CRCPress，1-14.Gannonetal.，(1990)″Activatingmutationsinp53produceacommonconformationaleffect.Amonoclonalantibodyspecificforthemutantfrom″EMBOJ.，91595-1602Gewirtz，(1993)″Oligodeoxynucleotide-basedtherapeuticsforhumanleukemias″StemCellsDayt.1196GoodandNielsen；(1998)″InhibitionoftranslationandbacterialgrowthbypeptidenucleicacidtargetedtoribosomalRNA″，PNASUSA952073-2076Hanania，etal.，(1995)″Recentadvancesintheapplicationofgenetherapytohumandisease″AmJ.Med.99537HardsandWright(1981)″N-carbamoyloxyurea-resistantChinesehamsterovarycellswithelevatedlevelsofribonucleotidereductaseactivity″J.CellPhysiol.106309-319HuangandWright，(1994)″Fibroblastgrowthfactormediatedalterationsindrugresistanceandevidenceofgeneamplification″Oncogene9491-499Huangetal.，(1995A)″Drugresistanceandgeneamplificationpotentialregulatedbytransforminggrowthfactorβgeneexpression″CancerRes.551758-1762Huangetal.，(1995B)″Multipleeffectsondrugsensitivity，genomestabilityandmalignantpotentialbycombinationsofH-ras，c-mycandmutantp53geneoverexpression″Int.J.Oncol.757-63Hurta，etal.，(1991)″EarlyinductionofribonucleotidereductasegeneexpressionbytransforminggrowthfactorβinmalignantH-rastransformedcelllines″J.Biol.Chem.26624097-24100HurtaandWright，(1992)″Alterationsintheactivityandregulationofmammalianreibonucleotidereductasebychlorambucil.aDNAdamagingagent″J.Biol.Chem.2677066-7071HurtaandWright，(1995A)″MalignanttransformationbyH-rasresultsinaberrantregulationofreibonucleotidereductasegeneexpressionbytransforminggrowthfactor-β″J.Cell.Biochem.57543-556HurtaandWright，(1994)J.CellPhysiol.158187-197Jelineketal.，(1994)Mol.Cell.Biol.，148212-8218Jensenetal.，(1994)″Identificationofgenesexpressedinpremalignantbreastdiseasebymicroscopy-directedcloning″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.919257-9261Kernetal.，(1992)″Oncogenicformsofp53inhibitp53-regulatedgeneexpression″Science，256827-830Kohn，(1996)″Regulatorygenesanddrugsensitivity″J.Natl.CancerInst.，881255-1256Koongetal.，(1994)CancerRes.545273-5279Leeversetal.，(1994)Nature，369411-414Lefebvre-d’Hellencourtetal.，(1995)″Immunomodulationbycytokineantisenseoligonucleotides"Eur.CytokineNetw.67Lenormandetal.，(1996)J.Biol.Chem.，27115762-15768Lev-Lemanetal.，(1997)AntisenseOligomersinvitroandinvivo.InAntisenseTherapeutics，A.CohenandS.Smicek，eds(PlenumPress，NewYork)Lewisetal.，(1978)″Assayofribonucleotidereductioninnucleotide-permeablehamstercells″J.CellPhysiol.94287-298Livingstonetal.，(1992)″Alteredcellcyclearrestandgeneamplificationpotentialaccompanylossofwildtypep53″Cell.70923-935Lokeetal.，(1989)″Characterizationofoligonucleotidestransportintolivingcells″PNASUSA863474Loweetal.，(1994)″Abrogationofoncogene-associatedapoptosisallowstransformationofp53-deficientcells″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，912026-2030Mai，(1994)″Overexpressionofc-mycprecedesamplificationofthegeneencodingdihydrofolatereductase"Gene，148253-260Mannetal.，(1988)″RibonucleotidereductaseM1subunitincellularproliferation，quisecence，anddifferentiation″J.CancerRes.485151-5156McClartyetal.，(1987)"ElevatedexpressionofM1andM2componentsanddrug-inducedposttranscriptionalmodulationofribonucleotidereductaseinahydroxyurearesistantmousecellline″Biochemistry268004-8011McClartyetal.，(1988)"Molecularmechanismsresponsibleforthedrug-inducedposttranscriptionalmodulationofribonucleotidereductaselevelsinahydroxyurea-resistantmouseLcellline"Biochemistry，277524-7531McClartyetal.，(1990)"Increasedferritingeneexpressionisassociatedwithincreasedribonucleotidereductasegeneexpressionandtheestablishmentofhydroxyurearesistanceinmammaliancells"J.Biol.Chem.2657539-7547Milleretal.，(1993)"Useofretroviralvectorsforgenetransferandexpression"MethEnzymol.217581-599MishelandShugieds.SelectedMethodsinCellularImmunology，W.H.Freeman&Co.(1980)Nielsenetal.(1991)Science3541497Ottoetal.，(1989)″IncreasedincidentofCADgeneamplificationintumorigenicratlinesasanindicatorofgenomicinstabilityofneoplasticcells″J.Biol.Chem.2643390-3396Pavloffetal.，(1992)J.DNASequencingandMapping2227-234PCRProtocolsAGuideToMethodsAndApplications，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)Phillips，(1973)"DyeExclusionTestsforCellViability"inTissueCultureMethodsandApplications(editorsP.F.Kruse，Jr.andM.K.Patterson，Jr.)，AcademicPress，NewYorkandLondon，pp.406-408Priceetal.，(1987)ProcNatl.Acad.Sci.USA84156-160PriceandCalderwood，(1993)"Increasedsequence-specificp53-DNAbindingactivityafterDNAdamageisattenuatedbyphorbolesters″Oncogene.83055-3062Quietal.，(1995)Nature374457-459Reichard，(1993)"FronRNAtoDNA，whysomanyribonucleotideredutases？″Science601773-1777Remington’sPharmaceuticalSciences，MacePublishingCompany，PhiladelphiaPa.17thed.(1985)Saekietal.，(1995)″Immunohistochemicaldetectionofribonucleotidereductaseinhumanbreasttumors″Int.J.Oncol.6523-529Salemetal.，(1993)FEBSLetters32393-95Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork(1989，1992)Scanlonetal.，(1995)"Oligonucleotides-mediatedmodulationofmammaliangeneexpression″FASEBJ.91288Shawetal.，(1991)"Modifieddeoxyoligonucleotidesstabletoexonucleasedegradationinserum"NucleicAcidsRes.19747-750Shigesadaetal.，(1985)"ConstructionofacDNAtothehamsterCADgeneanditsapplicationtowarddefiningthedomainforaspartatetranscarbamylase″Mol.Cell.Biol.，51735-1742Starketal.，(1990)GeneRearrangements，InB.D.HamesandD.M.Glover(eds.)FrontiersinMollecularBiology，Oxford，UnitedKingdomIRL；99-149Stark，(1993)″Regulationandmechanismsofmammaliangeneamplification″Adv.CancerRes.，6187-113Stitesetal.，(1994)BasicandClinicalImmunology(8thEd.)Appleton&Lange，Norwalk，Conn.Stokoeetal.，(1994)″ActivationofRafasaresultofrecruitmenttotheplasmamembrane″Science2641463-1467Stubbe，(1989)″Proteinradicalinvolvementinbiologicalcatalysis？″Annu.Rev.Biochem.58257-285Sullivan(1994)，美国专利No.5,225,347TakedaandWeber，(1981)″Roleofribonucleotidereductaseinexpressionoftheneoplasticprogram″LifeScience281007-1014Takenakaetal.，(1995)″Regulationofthesequence-specificDNAbindingfunctionofp53byproteinkinaseCandproteinphosphatases″J.Biol.Chem.，2705405-5411Tayloretal.，(1992)″Evidenceforsynergisticinteractionsbetweenras，mycandamutantformofp53incellulartransformationandtumordissemination″Oncogene71383-1390Thelanderetal.，(1985)″SubunitM2ofmammalianribonucleotidereductase.CharacterizationofhomogeneousproteinisolatedfromM2-overproducingmousecells″J.Biol.Chem.2602737-2741Thelanderetal.，(1980)″Ribonucleotidereductasefromcalfthymus.Separationoftheenzymeintotwononidenticalsubunits，proteinsM1andM2″J.Biol.Chem.2557426-7432Toninetal.，(1987)″Chromosomalassignmentofamplifiedgenesinhydroxyurearesistanthamstercells″CytogenetCellGenet.45102-108Vegaetal.；GeneTargeting，CRCPress，AnnArborMI.(1995)VectorsASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses，Butterworths，BostonMA.(1988)Wagneretal.，(1996)″Potentandselectiveinhibitionofgeneexpressionbyanantisenseheptanucleotide″NatureBiotechnology14840-844Wagner，(1994)″Geneinhibitionusingantisenseoligodeoxynucleotides″Nature372333Weber，(1983)″Biochemicalstrategyofcancercellsandthedesignofchemotherapy″CancerRes.433466-3492Wrightetal.，(1987)″AlteredExpressionofRibonucleotideReductaseandRoleofM2GeneAmplificationinHydroxyurea-ResistantHamster，Mouse，Rat，andHumanCellLines″Somat.Cell.Mol.Genet.13155-165Wright，(1989A)″Alteredmammalianribonucleotidereductasefrommutantcelllines″Encycl.Pharmacol.Therapeut.12889-111Wrightetal.，(1989B)Hydroxyureaandrelatedcompounds.InR.S.Gupta(ed.)，DrugResistanceinMammalianCells，BocaRaton，FL；CRCPress，In.；15-27Wrightetal.，(1990A)″RegulationanddrugresistancemechanismsofmammalianribonucleotidereductaseandthesignificancetoDNAsynthesis″Biochem.Cell.Biol.681364-1371Wrightetal.，(1993)″Transforminggrowthfactorβandfibroblastgrowthfactoraspromotersoftumorprogressiontomalignancy″Crit.Rev.Oncogen.4473-492Yakubovetal.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866454Yinetal.，(1992)″Wild-typep53restorescellcyclecontrolandinhibitsgeneamplificationincellswithmutantp53allels″Cell.70937-9481997年8月1日提交的美国申请No.08/904,901，该申请要求1996年8月2日提交的美国临时申请No.60/023,040和1997年3月7日提交的美国临时申请No.60/039,959的优先权所有上述公开出版物、专利申请和专利均全文结合在此作为参考，等同于每篇个别的公开出版物、专利申请或专利具体和分别地指出全文结合在此作为参考。技术现状合成DNA的第一个独特步骤是核糖核苷酸转化为它们相应的脱氧核糖核苷酸，该反应受到看家基因核糖核苷酸还原酶以细胞周期特异性方式的催化[Lewis等，1978；Reichard，1993；Wright，1989a；Wright等，1990a；Stubbe，1989]。哺乳动物的酶由两种相异的二聚蛋白质组分组成，通常称为R1和R2，它们被位于不同染色体上的两种不同基因所编码[Bjorklund等，1993；Tonin等，1987]。哺乳动物的R1蛋白是同二聚结构，分子量约为170kDa，具有底物位点和变构效应位点，这些位点控制酶活性和底物特异性[Wright，1989A；Thelander等，1980；Caras等，1985；Wright等，1990a]。R2蛋白是同二聚体，分子量为88kDa，形成两个同等的双核铁中心，使催化所需的酪氨酰自由基稳定[Wright等，1990a；Thelander等，1985；McClarty等，1990]。R1与R2蛋白相互作用于它们的C-端，形成活性的全酶[Reichard，1993；Wright等，1990a；Davis等，1994]。R1与R2在细胞周期期间受到有差别的调节。R2蛋白存在S-期相关性增加，这是由其重新合成引起的[Lewis等，1978；Mann等，1988]。核糖核苷酸还原酶的活性、以及DNA合成和细胞增殖，在正在增殖的细胞的细胞周期期间，受到R2组分合成与降解的控制[Eriksson等，1984]。决速的R2组分是能够被细胞周期进程的CDC2与CDK2蛋白激酶介质所磷酸化的磷蛋白[Chan等，1993]，并且含有使酶活性所需的独特的酪氨酰自由基稳定的非血红素铁[Reichard，1993；McClarty等，1990]。R1蛋白的水平似乎在正在增殖的细胞的细胞周期期间不发生本质上的变化，并在整个细胞周期都能够检测到。R1mRNA的合成象R2mRNA一样，似乎主要发生在S-期[Eriksson等，1984；Choy等，1988；Mann等，1988]。在细胞周期期间R1蛋白的分布更为广泛，这归因于它比R2蛋白具有更长的半衰期[Choy等，1988；Mann等，1988]。核糖核苷酸还原酶、特别是R2组分的调节，在暴露于肿瘤促进剂或生长因子TGF-β的恶性细胞中发生改变[Amara等，1994；Chen等，1993；Amara等，1995b；Hurta和Wright，1995A；Hurta等，1991]。与非恶性细胞相比，在培养的恶性细胞中已经观察到更高水平的酶活性[Weber，1983；Takeda和Weber，1981；Wright等，1989a]，与正常的对照组织样本相比，在恶化前的组织和恶性组织中已经发现R2蛋白和R2mRNA的水平增加[Saeki等，1995；Jensen等，1994]。通过使R2蛋白的铁中心去稳定，导致酪氨酰自由基的破坏[McClarty等，1990]，并防止细胞经历细胞周期的S-期[Ashihara和Baserga，1979]，羟基脲等化合物可以抑制核糖核苷酸还原酶的活性。分子生物学和人类基因组项目的突破，已经展现了以前未曾预料的定向干预哺乳动物基因表达的可能性[Blaese，1997]。这包括诸如特殊基因的破坏等方法。设计用来与目标mRNA内的特殊序列杂交的反义(AS)低聚核苷酸(AS-ON)是这类定向干预的一个实例。一般地，反义低聚核苷酸与磷脂膜很好地相互作用[Akhter等，1991]。在它们与细胞质膜相互作用后，它们可以主动或被动地转运到活细胞内[Loke等，1989]，其发生机理是可预知的涉及特殊受体的可饱和机理[Yakubov等，1989]。很多出色的评论已经覆盖了反义技术及其巨大治疗潜力的主要方面。在这种迅速发展的技术的化学方面[Crooke，1995]、细胞方面[Wagner，1994]和治疗方面[Hanania等，1995；Scanlon等，1995；Gewirtz，1993]都有评论。在相当短的时间内，关于反义低聚核苷酸在所培养的原代细胞与细胞系中的体外应用，以及用于以短暂方式抑制特殊过程和改变机体功能的低聚核苷酸体内给药，已经积累了大量信息。此外，借助体外与体内动物模型预测人类功效，现在已经取得足够的经验。除了上述以外，国际专利申请No.PCT/US98/00540公开了与核糖核苷酸还原酶的R1和R2组分互补的反义低聚核苷酸，可用于控制恶化前的或恶性细胞中的致瘤性和/或转移的潜在性。尽管该参考文献所阐述的特定的低聚核苷酸表现出良好的抗致瘤性性，但是进一步发现其他具有提高的控制致瘤性和/或转移潜在性活性的反义低聚核苷酸仍是有益的。发明概述本发明提供小于约50个核苷酸的反义低聚核苷酸，它包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]。该序列可以进一步减少二聚物的形成和减少自互补相互作用。本发明还提供了用于抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的药物组合物，包含有效量的小于约50个核苷酸的反义低聚核苷酸，它包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]。在本发明方法的一个方面，本发明提供抑制哺乳动物赘生性细胞致瘤性的方法，该方法包括使赘生性细胞与包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反义低聚核苷酸接触。另一方面是抑制哺乳动物耐化疗药物的赘生性细胞致瘤性的方法，该方法包括认定患有耐化疗药物的肿瘤的患者；使该肿瘤与该肿瘤所耐受的化疗药物和包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反义低聚核苷酸接触，其中化疗药物和反义低聚核苷酸的量足以抑制肿瘤细胞的生长。单独的反义低聚核苷酸的量可以是不足以抑制肿瘤细胞生长的。另一方面是通过使肿瘤与包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反义低聚核苷酸接触，增加哺乳动物赘生性细胞对化疗药物的敏感性的方法。另一方面是抑制哺乳动物肿瘤细胞转移的方法，该方法包括将足以抑制肿瘤细胞生长的量的、包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反义低聚核苷酸对所述哺乳动物给药。另一方面是一种分离的DNA，它具有包含转录引发区的序列和编码小于约50个核苷酸的反义低聚核苷酸的序列，该低聚核苷酸包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]。附图简要说明图1A-C是凝胶(A和B)和二维扫描(C)的照片，显示利用单克隆抗-Myc表位抗体9E10(A)、多克隆兔抗-R2血清(B)通过蛋白质印迹分析、和在细胞周期期间利用抗体9E10通过流动细胞计数法(C)所得，来自稳定感染体的定向Myc-表位R2表达的分析。图2A-C是测量转化灶的实验照片(A和B)和图形(C)，其中(A)显示BALB/c3T3(a)和NIH3T3(b)细胞被SH/mR2感染不引起转化灶形成。(B)用T24H-ras质粒转染之后，与B3/SH(a)和N3/SH(c)相比，B3/mR2(b)和N3/mR2(d)的转化灶形成增加。(C)绘出三项独立的ras转染实验中所形成的转化灶数。图3A-C是软琼脂生长的照片(A)和图形(B和C)，其中(A)显示在ras-转染细胞中导致软琼脂中的生长效率增加的Myc-R2的表达。所示实例是r-3/mR2和未感染的r-3细胞(见表4)。(B)与C1/SH对照细胞相比，Cl/mR2显示肿瘤潜伏期缩短，生长速率增加，其中从对数生长培养物中收集3×105个细胞，皮下注射到五只同基因的C3H/HeN小鼠/细胞系/实验中。列出的结果得自两个独立的试验。显示了肿瘤生长速率的t检验分析的p值，说明两种细胞系的生长速率是显著不同的。(C)C1/mR2细胞表现出转移的潜在性升高。图4A-C是图形，其中(A)显示在R2过度表达的细胞中，与膜缔合的Raf-1蛋白的增加量。将重组R2表达细胞系B3/mR2、N3/mR2、C1/mR2、r-2/mR2、r-3/mR2和NR4/mR2(R2)与它们各自的对照系B3/SH、N3/SH、Cl/SH、r-2/SH、r-3和NR4(对照)进行比较。在所有情况下，表达重组R2的细胞表现出与膜缔合的Raf-1蛋白增加，并且当比较这两组细胞系时，发现它们的t检验分析是显著不同的(p＜0.001)。(B)显示在R2过度表达的细胞中分裂素活化蛋白激酶(MAPK-2)的活性增加。将重组R2表达系B3/mR2、N3/mR2、10T/mR2、C1/mR2、r-2/mR2和NR4/mR2(R2)与它们各自的用LXSH感染的对照系(对照)进行比较。在所有情况下，表达重组R2的细胞显示酶活性增加，两组之间的差异是非常显著的(p＜0.001)。(C)显示用活化的V12Rac-1质粒转染之后，与N3/SH细胞相比，N3/mR2细胞的转化灶形成增加。所示转化灶数表示来自两项独立实验的平均±SE。图5A-B是凝胶的照片，显示利用小鼠L细胞进行CAD(A)和DHFR(B)DNA的DNA印迹分析实例。图5A.作为对照的未暴露在药物下的H-4细胞(a)，和在50μMPALA的存在下(b)或者在60μMPALA的存在下(c)发育的集落中的H-4细胞。DNA用Xbal消化完全。图5B作为对照的未暴露在药物下的SC2细胞(a)，和在80nM甲氨蝶呤(MTx)的存在下发育的集落中的SC2细胞(b)和(c)。DNA用Pstl消化完全。图6A-B是凝胶的照片，显示利用BALB/c3T3细胞进行CAD(A)和DHFR(B)DNA的DNA印迹分析实例。DNA用PstI消化完全。图6A.未暴露在PALA下的B3/mR2细胞，和在40μMPALA的存在下(b)或者在50μMPALA的存在下(c)发育的集落中的B3/mR2细胞。图6B.未暴露在MTX下的B3/mR2细胞，和在60nMMTX的存在下(b)或者在80nMMTX的存在下(c)发育的集落中的B3/mR2细胞。图7是N/R2-4(a)和N/R2+ASR2(b)细胞中R2蛋白水平的蛋白质印迹分析照片。为了区分载体R2蛋白与被转染细胞中的内源基因产物，将编码十个氨基酸加甲硫氨酸的人c-myc表位放置在R2的cDNA5’端。在a栏中可观察到重组的(上面的带)与内源的(下面的带)R2蛋白，它们在含有R2反义的细胞(b栏)中明显减少。两种细胞系的生长具有大约相同的加倍时间，约16小时。图8是凝胶的照片，显示在PALA、MTX或羟基脲的存在下发育的集落细胞中的p53-DNA结合活性。(a)为对照的p53-裸1B细胞，(b)为在20μMPALA的存在下生长的B3/mR2细胞，(c)为在40μMPALA的存在下生长的B3/R2c2细胞，(d)为在40nMMTX的存在下生长的B3/mR2细胞，(e)为在60nMMTX的存在下生长的B3/R2c2细胞，(f)为在0.20mM羟基脲的存在下生长的B3/mR2细胞，(g)为在0.30mM羟基脲的存在下生长的B3/R2c2细胞。在活化p53与DNA结合的抗体421的存在下，将细胞与32P-标记的p53共有结合序列进行培养。注意除了对照的p53-裸细胞1B以外，在所有细胞系中都存在复合物。低分子量复合物的形成由p53-DNA结合所引起，高分子量复合物的形成由抗体超级移位的p53-DNA结合所引起。图9是图形，显示在(a)含有H-ras致癌基因的NIH-3T3小鼠细胞、(b)含有H-ras致癌基因和R2反义序列的NIH-3T3小鼠细胞和(c)含有H-ras致癌基因和R2编码区序列的NIH-3T3小鼠细胞中的转化灶数。结果是三次实验的平均值。图10A-B是L60小鼠肿瘤细胞中，核糖核苷酸还原酶R2蛋白水平被AS-II-626-20抑制(A)和被各种R2反义低聚核苷酸抑制(B)的蛋白质印迹分析照片。图10A小鼠肿瘤细胞(a)；具有AS-II-626-20的小鼠细胞(b)；具有混杂AS-II-626-20的小鼠细胞(c)；具有错配AS-II-626-20的小鼠细胞(d)。图10B小鼠肿瘤细胞(a)；用AS-II-667-20(b)、AS-II-816-20(c)、AS-II-1288-20(d)、AS-II-1335-20(e)、AS-II-1338-20(f)处理的小鼠肿瘤细胞。图11是图形，显示各种反义低聚核苷酸抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞集落形成的百分率。图12是显示AS-I-618-20抑制集落形成的图形。细胞系是HepG2(肝)、SK-OV-3(卵巢)、U87(脑)、A2058(黑素瘤)、H460(肺)、MDA-MB-231(乳腺)和AsPC-1(胰腺)。图13是MDA-MB-231人乳腺癌细胞用各种反义低聚核苷酸处理后，R1蛋白表达的蛋白质印迹照片。图14A是用AS-I-618-20处理后，R1蛋白表达的蛋白质印迹照片。对照＝未处理的细胞，混杂—用混杂型AS-I-618-20(相同的GTAC比例但又完全不同的序列)处理的细胞，错配—突变型AS-I-618-20，有4个碱基错配。图14B是利用ImageQuant程序(MolecularDynamics)量化的蛋白质印迹中的R1蛋白水平图，该水平以任意单位表示(相对强度)。图15是免疫沉淀凝胶的照片。SRC—混杂型AS-I-618-20；MIS—错配型AS-I-618-20。图16是未用AS-I-618-20处理或者用AS-I-618-20处理的各种细胞的mRNA的RNA印迹的自体放射造影照片。HT-29是人结肠腺癌细胞系，MDA-MB-231是人乳腺癌细胞系。图17是显示用各种反义低聚核苷酸处理后，小鼠中人肺癌(H460)肿瘤的重量的图形。图18是显示用AS-I-618-20处理后的小鼠中各种肿瘤的重量的图形。浅色条是未处理的对照鼠所得结果，深色条是用AS-I-618-20处理的动物所得结果。图19是显示用或不用1mg/kgAS-I-618-20处理的裸鼠中，人肺癌肿瘤的生长速率的图形。图20是用AS-I-618-20处理后的小鼠中，HT-29人结肠肿瘤中的核糖核苷酸还原酶R1mRNA的RNA印迹的自体放射造影照片。图21是显示用各种反义低聚核苷酸处理后，CD-1裸鼠中的人结肠癌(HT-29)肿瘤的重量的图形。图22是显示用各种反义低聚核苷酸处理后，CD-1裸鼠中的人黑素瘤(A2058)肿瘤的重量的图形。图23是显示用各种反义低聚核苷酸处理后，CD-1裸鼠中的人肺癌肿瘤的重量的图形。发明详述定义本文所用的下列术语具有下列含义本文所用的术语“反义低聚核苷酸”是指与所需的mRNA互补的核苷酸序列。优选地，反义低聚核苷酸与核糖核苷酸还原酶mRNA互补。可以预期，所述反义低聚核苷酸可以与mRNA的5′未转译区、编码区或mRNA的3′未转译区中的任何一个互补。术语“低聚核苷酸”指的是核苷酸或核苷单体的低聚物或聚合物，由天然存在的碱、糖和糖间(主链)连接组成。该术语也包括修饰或取代的低聚物，包含功能类似的非天然存在的单体或其部分。这些修饰或取代的低聚物可能优选于天然存在的形式，因为其具有例如提高了的细胞摄取，或者在核酸酶存在下的增加了的稳定性之类的性能。该术语还包括嵌合的低聚核苷酸，含有两个或更多化学不同的区域。例如，嵌合的低聚核苷酸可以含有至少一个带来有益性质(例如增加核酸酶耐受性、增加细胞摄取)的修饰核苷酸区，或者两个或更多本发明的低聚核苷酸连接形成嵌合的低聚核苷酸。本发明的反义低聚核苷酸可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，并且可以含有天然存在的或合成的单体碱，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。低聚核苷酸还可以含有修饰的碱，例如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫代腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他8-取代的鸟嘌呤、其他氮杂和去氮杂的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。修饰还可以包括将其他化学基团，例如甲基、乙基或丙基连接到低聚核苷酸的各个部分，包括糖、碱或主链组分。本发明的反义低聚核苷酸还可以包含修饰性的在磷酸酯主链中的磷氧杂原子，短链烷基或环烷基糖间连接或短链杂原子或杂环糖间连接。例如反义低聚核苷酸可以含有膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和吗啉代低聚物。在本发明的一个实施方案中，反义低聚核苷酸包含连接4至6个3’-末端核苷酸的硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，硫代磷酸酯键连接所有的核苷酸。反义低聚核苷酸还可以具有拟糖物。本发明的反义低聚核苷酸还可以包含核苷酸类似物，其中核苷酸的结构发生根本改变。这样的低聚核苷酸类似物的一个实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链被类似于肽中所发现的聚酰胺主链代替(Nielsen等，1991；Good和Nielsen，1998；Buchardt，已故，等，美国专利N0.5,766,855；Buchardt，已故，等，美国专利No.5,719,262)。PNA类似物已经显示出耐受酶的降解作用，并且具有延长了的体内和体外寿命。PNA与互补的DNA序列的结合能力也强于天然存在的核酸分子，因为在PNA链与DNA链之间缺少电荷排斥。本发明的低聚核苷酸还可以包括其他包含聚合物主链、环状主链或无环主链的核苷酸。例如，核苷酸可以包含吗啉代主链结构(美国专利No.5,034,506)。当本发明的低聚核苷酸经过修饰而对DNA和RNA核酸酶的降解作用不敏感，或者被放置在保护低聚核苷酸不受DNA或RNA核酸酶的作用的释放媒介中时，其是“耐核酸酶的”。耐核酸酶的低聚核苷酸包括例如膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和吗啉代低聚物。赋予耐核酸酶性的合适的释放媒介包括例如脂质体。本发明的低聚核苷酸还可以含有基团，例如用于改善低聚核苷酸的药动学性质的基团，或用于改善低聚核苷酸的药效学性质的基团。反义低聚核苷酸优选地选自与核糖核苷酸还原酶mRNA或基因序列互补的序列，这样该序列表现出最小的显示双链体形成、发针形成和均低聚物/序列重复的可能性，但是具有高至中等的结合核糖核苷酸还原酶mRNA或基因序列的可能性。这些性质可以利用计算机建模程序OLIGO引物分析软件3.4或5.0版(由NationalBiosciences，Inc.，Plymouth，MN发布)测定。这种计算机程序可以进行这五种参数的定性测定。或者，反义低聚核苷酸还可以在这样的基础上加以选择，即所述序列与两种或更多哺乳动物种类的核糖核苷酸还原酶基因之一是高度相反的。这些性质可以利用威斯康星大学计算机小组(GCG)软件(DevereuxJ.等.1994)的BLASTN程序(Altschul等)以及国家生物技术信息中心(NCBI)数据库加以测定。反义低聚核苷酸可以包括突变，例如取代、插入和缺失。优选地，具有突变的序列低于10％。反义低聚核苷酸一般包含至少约3个核苷酸或核苷酸类似物，更优选地它们是至少约5个核苷酸，更优选地它们是至少约7个核苷酸，更优选地它们是至少约9个核苷酸，最优选地它们是至少约12个核苷酸。反义低聚核苷酸优选为少于约100个核苷酸或核苷酸类似物，更优选为少于约50个核苷酸或核苷酸类似物，最优选为少于约35个核苷酸或核苷酸类似物。优选地，反义低聚核苷酸包含表1、2和3所列序列(见下)。表1设计用来定向R2信息的反义序列表1脚注名称包括如下内容AS＝反义II＝R2第一个数字表示R2mRNA序列中第一个核苷酸的位置。第二个数字表示序列片段的长度。表中所示序列AS-II-2229A和文中所述序列AS-II-2229B是交替的序列，2229A选自GENBANK中的R2型(由Pavloff提交)，2229B选自Pavloff等1992年公开的型式。除非另外指出为部分硫代，所述序列被完全硫代。TM℃＝所形成的低聚核苷酸双链体的解链温度。dG＝低聚核苷酸-补体二聚物形成的自由能值。除了上述分析以外，还估计了二聚物形成的可能性(D)、自补相互作用的可能性(H)和与R2信息中不同于目标序列的序列结合的可能性(B)。上述分析和估计是利用计算机建模程序OLIGO引物分析软件3.4版(由NationalBiosciences发布)得到的。该程序可以测定Tm℃和dG值，还提供对D、H和B参数的定性评估，表示为“没有可能”、“有可能”或者本质上“完全可能”。在选择低聚核苷酸序列时，本发明人非常优选表现出高Tm℃和dG值的序列，这些对反义分子与它们的互补链紧密结合来说是很重要的，还非常优选D、H和B评估为没有可能的反义序列。在三类(D，H，B)中，最重要的是D和H，因为B(也就是与R2mRNA中除了精确的目标序列以外的其他区域结合)可以增强而不是有损于低聚核苷酸活性。表1所示的大多数序列的D和H类没有可能，有些序列的D或H表现为“有可能”，在后面的肿瘤细胞生长抑制研究中发现是有效的(表13)，因此也包括在表1中。本发明人发现这种选择反义低聚核苷酸抑制剂的方法是极为有效的，因为如表13所示，绝大多数所选择的序列表现出抗肿瘤性质。表2设计用来定向R1信息的反义序列表2脚注名称包括如下内容AS＝反义I＝R1第一个数字表示R1mRNA序列中第一个核苷酸的位置。第二个数字表示序列片段的长度。TM℃＝所形成的低聚核苷酸双链体的解链温度。dG＝低聚核苷酸-补体二聚物形成的自由能值。除了上述分析以外，还估计了二聚物形成的可能性(D)、自补相互作用的可能性(H)和与R1信息中不同于目标序列的序列结合的可能性(B)。如表1脚注所述进行分析，用于选择表2所示序列的标准同表1脚注所述标准。表3具有与人核糖核苷酸还原酶R1基因互补的序列的反义低聚核苷酸表3中，″Tm″是按照最接近的热力学值计算的低聚核苷酸双链体的解链温度。在该温度下，50％核酸分子在双链体中，50％变性。″dG″是低聚核苷酸的自由能，它是低聚核苷酸双链体稳定性的量度。使用计算机建模程序OLIG0引物分析软件5.0版。术语“烷基”指的是一价烷基，优选具有1至20个碳原子，更优选具有1至6个碳原子。该术语的实例是诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正己基等基团。术语“芳基”指的是6至14个碳原子的不饱和芳香碳环基团，具有单一的环(例如苯基)或多个稠合(稠)环(例如萘基或蒽基)。优选的芳基包括苯基、萘基等。术语“环烷基”指的是3至20个碳原子的环状烷基，具有单一的环或多个稠合环。这样的环烷基的实例包括单环结构，如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等，或多环结构，如金刚烷基等。术语“卤”或“卤素”指的是氟、氯、溴和碘，优选为氟或氯。术语“巯基”指的是基团-SH。至于任何含有一个或多个取代基的上述基团，当然不言而喻的是这样的基团并不含有任何空间上不能实现的和/或合成上不可行的取代或取代模式。另外，本发明化合物包括由这些化合物的取代而产生的所有立体化学异构体。术语“药学上可接受的盐”指的是这样的盐，它们保留本发明的反义低聚核苷酸的生物学效力和性质，并且不是生物学或者其它方面所不希望的。在很多情况下，由于氨基和/或羧基或与之类似基团的存在，本发明的反义低聚核苷酸能够形成酸和/或碱盐。药学上可接受的碱加成盐可以从无机和有机碱制备。仅作为实例，从无机碱衍生的盐包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。从有机碱衍生的盐包括但不限于伯、仲和叔胺的盐，例如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、二(取代的烷基)胺、三(取代的烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、取代的烯基胺、二(取代的烯基)胺、三(取代的烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、取代的环烷基胺、二(取代的环烷基)胺、三(取代的环烷基)胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、取代的环烯基胺、二(取代的环烯基)胺、三(取代的环烯基)胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺、三杂芳基胺、杂环基胺、二杂环基胺、三杂环基胺、混合的二-与三-胺，其中胺上的至少两个取代基是不同的，并选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、杂芳基、杂环基等。还包括这样的胺，其中两个或三个取代基和氨基氮一起形成杂环基或杂芳基。仅作为举例，合适的胺的实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、三羧甲基氨甲烷、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。还应当明白，其他羧酸衍生物在本发明的实施中也将是有用的，例如羧酸酰胺，包括氨甲酰、低级烷基氨甲酰、二烷基氨甲酰等。药学上可接受的酸加成盐可以从无机和有机酸制备。从无机酸衍生的盐包括氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。从有机酸衍生的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。术语“核糖核苷酸还原酶基因”指的是任何这样的基因，其产物单独或者作为复合物的一部分，能够催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸。术语“与……互补”是指反义低聚核苷酸序列能够与目标序列，即核糖核苷酸还原酶mRNA或基因结合。优选地，反义低聚核苷酸序列与目标序列具有至少约75％的同一性，优选至少约90％的同一性，考虑到若干碱的裂隙或错配，最优选与目标序列具有至少约95％的同一性。同一性例如可以利用威斯康星大学计算机小组(GCG)软件的BLASTN程序加以测定。优选地，反义低聚核苷酸序列与核糖核苷酸还原酶mRNA杂交，该核糖核苷酸还原酶mRNA的解链温度至少为40℃，更优选至少约50℃，最优选至少约53℃，这是用本文所述的OLIGO程序3.4或5.0版测定的。术语“抑制生长”是指至少一种肿瘤细胞类型的生长可以减少至少10％，更优选至少50％，最优选至少75％。对于肿瘤细胞，生长的减少可以通过测量小鼠内肿瘤的大小或肿瘤细胞体外形成集落的无能力加以确定。术语“哺乳动物”或“哺乳动物的”是指所有哺乳动物，包括人、羊、牛、马、猪、犬、猫和鼠等。“怀疑患有肿瘤的哺乳动物”是指，哺乳动物可能患有增殖性机能紊乱或肿瘤，或者已被诊断为增殖性机能紊乱或肿瘤，或者以前被诊断为增殖性机能紊乱或肿瘤，所述肿瘤已经通过手术方法摘除，并且该哺乳动物被怀疑隐匿一些残余的肿瘤细胞。反义低聚核苷酸的制备本发明的反义低聚核苷酸可以通过常规的和众所周知的工艺制备。例如，低聚核苷酸可以利用固相合成加以制备，特别是利用商业上可得到的设备，例如可从加拿大应用生物系统公司(AppliedBiosystemsCanadaInc.，Mississauga，Canada)得到的设备制备。低聚核苷酸还可以通过本领域已知的方法，用酶消化天然存在的核糖核苷酸还原酶R1或R2基因加以制备。反义低聚核苷酸的离析和纯化如果需要，本文所述的反义低聚核苷酸的离析和纯化可以通过任何适合的分离或纯化方法进行，例如过滤、萃取、结晶、柱色谱、薄层色谱、厚层色谱、制备型低或高压液相色谱或这些方法的组合。不过当然地，也可以使用其它相当的分离或离析方法。包含反义低聚核苷酸序列的表达载体，可以根据低聚核苷酸的序列，利用本领域已知的操作加以构建。本领域技术人员可以将载体构建为含有所有实现所需反义低聚核苷酸序列转录所要求的表达组件。因此，本发明提供包含转录控制序列的载体，该序列可有效连接到编码反义低聚核苷酸的序列上。适合的转录和转译组件可以得自各种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫的基因。适当的组件的选择依赖于所选择的宿主细胞。信息基因可以包括在载体内。适合的信息基因包括β-半乳糖苷酶(例如lacZ)、氯霉素、乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分。通过监测信息基因的表达，可以监测反义低聚核苷酸的转录。载体可以通过本领域中各种已知方法的任何一种引入到细胞或组织中。这样的方法一般公开于Sambrook等；Ausubel等；Chang等，1995；Vega等；和《VectorsASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses》，并且包括例如稳定或瞬变的转染、1ipofection、电穿孔和被重组病毒载体感染。适合实现本发明的宿主细胞包括但不限于CHO、COS、BHK、293和HeLa。用于哺乳动物细胞转染的规程是本领域所熟知的，包括磷酸钙介导的电穿孔和逆转录酶病毒(retroviral)与原生质体融合物介导的转染。感染核酸的引入赋予若干优点。可以获得更高的效率和组织类型特异性。病毒通常感染特殊的细胞类型并在其中繁殖。因此，病毒特异性可以用于在体内或者在组织或混合的细胞培养物中，使载体瞄准特殊的细胞类型。病毒载体还可以用特殊的受体或配体进行修饰，以通过以受体为媒介的事件来改变定向特异性。可以使本发明的低聚核苷酸成为不溶物。例如，低聚核苷酸可以结合到适合的载体上。合适的载体的实例是琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素聚苯乙烯、滤纸、离子交换树脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、聚胺-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝等。载体的形状可以是例如管形、试验板、珠粒碟、球形等。不溶解的低聚核苷酸可以利用已知的化学或物理方法，例如溴化氰偶联，使物料与适合的不溶性载体反应来制备。可以预期，本发明的低聚核苷酸可以是裂解mRNA的核酶。所述核酶优选地具有与本发明低聚核苷酸序列同源的序列和必要的用于裂解mRNA的催化中心。例如，可以选择破坏核糖核苷酸还原酶mRNA的同源性核酶序列。本发明所采用的核酶类型可以从本领域已知的类型中选择。已经鉴定了若干核酶结构家族，包括I组基因内区、RNA酶P、肝炎δ病毒核酶、锤头核酶，和最初从烟草环斑病毒随体RNA负链(sTRSV)衍生的发针核酶(Sullivan1994，美国专利No.5,225,347)。锤头和发针核酶基序通常在基因疗法中最适合于mRNA的反式裂解(Sullivan1994)。发针核酶优选用于本发明中。一般地，核酶长度为30至100个核苷酸。药物制剂当用作药物时，反义低聚核苷酸通常以药物组合物的形式给药。这些化合物可以通过各种途径给药，包括口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内给药。这些化合物作为可注射的和口服的组合物都是有效的。这样的组合物按药学领域熟知的方式制备，并包含至少一种活性化合物。药物组合物是例如静脉内给药的。可以预期，药物组合物可以直接给药到所治疗的肿瘤。本发明还包括药物组合物，该药物组合物含有一种或多种反义低聚核苷酸作为活性成分，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在制备本发明的组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合、用赋形剂稀释或者包封在这样的一种载体中，该载体可以是胶囊、小药囊、纸或其他容器的形式。当赋形剂充当稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体物料，充当活性成分的媒介、载体或介质。因此，所述组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或者在液体介质中)、软膏剂(例如含有高达10％(重量)的活性化合物)、软和硬胶囊剂、栓剂、无菌的可注射溶液和无菌的包装粉剂。在制备制剂时，在与其他成分混合之前研磨活性化合物以提供适当的颗粒大小可能是必要的。如果活性化合物基本上是不溶性的，通常研磨至粒径小于200目。如果活性化合物基本上是水溶性的，粒径通常通过研磨调整到基本上均匀分布在制剂中的程度，例如约40目。一些适合的赋形剂实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。制剂可以另外包括润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如甲基-和丙基羟基-苯甲酸酯；甜昧剂；和增香剂。本发明的组合物经过配制，可以在采用本领域已知的方法对患者给药之后，提供活性成分的快速、持续或延迟释放。优选将组合物配制成单位剂型，每剂含有约1.5mg至约3g、更通常为约10mg至约3.0g的活性成分。术语“单位剂型”是指物理学上不连续的单位，适合作为单一的剂量给人类受治疗者和其他哺乳动物，每个单位含有经过计算可产生所需治疗效果的预定剂量的活性物质以及适合的药物赋形剂。反义低聚核苷酸在广泛的剂量范围内都是有效的，一般按药学上的有效量给药。有效量是给药后减轻症状的量。优选地，有效量是能够抑制肿瘤细胞生长的量。优选地，有效量为约0.02mg/kg体重至约20mg/kg体重。不过应该明白，反义低聚核苷酸的实际给药量将由医师决定，要考虑有关的环境因素，包括所治疗的疾病、所选择的给药途径、实际给药的化合物、各患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重性等。治疗过程可以持续数天至数月，或者直到实现疾病减轻时为止。关于制备固体组合物，例如片剂，将主要的活性成分/反义低聚核苷酸与药物赋形剂混合，形成固体的制剂前组合物，其中含有本发明化合物的均匀混合物。当称这些制剂前组合物为均匀时，这表示活性成分平均分散在组合物中各处，这样组合物可以被轻易地细分为同样有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。本发明的片剂或丸剂可以是包衣的，或者被复合以提供具有长效优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量与外部剂量组分，后者是前者封套的形式。这两种组分可以被肠溶层隔开，肠溶层的作用是抵抗胃中的崩解，允许内部组分完整进入十二指肠，或者延迟释放。多种材料可以用作这样的肠溶层或包衣，这些材料包括许多聚合的酸和聚合的酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素等材料的混合物。其中可以结合本发明的新型组合物的、用于口服或注射给药的液体剂型包括水溶液、经过适当矫味的糖浆剂、水或油悬浮液、和经过矫味的采用食用油，例如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的乳剂，以及酏剂和类似的药物媒介。吸入或喷入用组合物包括在药学上可接受的水或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，及粉剂。液体或固体组合物可以含有本文所述的合适的药学上可接受的赋形剂。优选地，该组合物通过口服或鼻呼吸途径给药，用于发挥局部或全身效果。在优选为药学上可接受的溶剂中的组合物，可以利用惰性气体雾化。经过雾化的溶液可以直接从雾化装置中吸入，或者雾化装置可以连接在面罩或间歇式正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉剂组合物，可以优选通过口服或鼻部给药，给药装置以适当的方式释放制剂。本发明方法采用的另一种优选制剂采用透皮释放装置(“贴剂”)。这样的透皮贴剂可以用于提供本发明反义低聚核苷酸的连续或不连续输入，输入量是受到控制的。用于药剂释放的透皮贴剂的构造和使用是本领域熟知的。例如参见美国专利5,023,252，该专利结合在此作为参考。这样的贴剂可以构造成使药剂连续、脉动或按需释放。另一种优选的释放方法涉及裸露的反义低聚核苷酸穿越真皮层的“散弹式”释放。“裸露的”反义低聚核苷酸的释放是本领域熟知的。例如参见Felgner等，美国专利No.5,580,859。可以预期，反义低聚核苷酸可以在反义低聚核苷酸的“散弹式”释放之前包装在液体媒介中。下列制剂实例用来举例说明本发明的代表性药物组合物。制剂例1制备含有下列成分的硬胶囊剂成分量(mg/粒胶囊)活性成分30.0淀粉305.0硬脂酸镁5.0将上述成分混合，装填在硬胶囊中，总量为340mg。制剂例2利用下列成分制备片剂成分量(mg/片)活性成分25.0微晶纤维素200.0胶体二氧化硅10.0硬脂酸5.0将各成分掺合在一起，压制成片，每片重240mg。制剂例3制备含有下列组分的干粉吸入制剂成分重量％活性成分5乳糖95将活性成分与乳糖混合，并将混合物加入到干粉吸入器中。制剂例4如下制备片剂，每片含有30mg活性成分成分量(mg/片)活性成分30.0mg淀粉45.0mg微晶纤维素35.0mg聚乙烯基吡咯烷酮(10％无菌水溶液)4.0mg羧甲基淀粉钠4.5mg硬脂酸镁0.5mg滑石1.0mg总计120mg使活性成分、淀粉和纤维素通过No.20目U.S.筛，并充分混合。将聚乙烯基吡咯烷酮的溶液与所得粉末混合，然后通过16目U.S.筛。所形成的颗粒在50至60℃下干燥，并通过16目U.S.筛。然后将预先通过No.30目U.S.筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石加入到颗粒中，混合后，在压片机上压制成片，每片重120mg。制剂例5如下制备胶囊剂，每粒胶囊含有40mg药剂成分量(mg/粒胶囊)活性成分40.0mg淀粉109.0mg硬脂酸镁1.0mg总计150mg将活性成分、淀粉和硬脂酸镁掺合在一起，通过No.20目U.S.筛，装填在硬胶囊中，总量为150mg。制剂例6如下制备栓剂，每枚含有25mg活性成分成分量活性成分25mg饱和脂肪酸甘油酯，至2000mg使活性成分通过No.60目U.S.筛，并悬浮在预先用最小必需热量加热熔化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倒在标称容量为2.0g的栓剂模具中，并使其冷却。制剂例7如下制备悬浮液，每5.0ml含有50mg药剂成分量活性成分50.0mg黄原胶4.0mg羧甲基纤维素钠(11％)微晶纤维素(89％)50.0mg蔗糖1.75g苯甲酸钠10.0mg香料和色素适量纯净水，至5.0ml将活性成分、蔗糖和黄原胶掺合在一起，通过No.10目U.S.筛，然后与预先制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液混合。将苯甲酸钠、香料和色素用一些水稀释，并在搅拌下加入。然后加入足量的水，达到所需体积。制剂例8成分量(mg/粒胶囊)活性成分15.0mg淀粉407.0mg硬脂酸镁3.0mg总计425.0mg将活性成分、淀粉和硬脂酸镁掺合在一起，通过No.20目U.S.筛，并装填在硬胶囊内，总量为425.0mg。制剂例9如下制备一种制剂成分量活性成分5.0mg玉米油1.0ml制剂例10如下制备一种局部制剂成分量活性成分1-10g乳化蜡30g液体石蜡20g白软石蜡至100g将白软石蜡加热至熔化。加入液体石蜡和乳化蜡，搅拌直至溶解。加入活性成分并继续搅拌，直至分散。混合物然后冷却为固体。其他可用于本发明的合适制剂可以在《Remington氏药物科学》(Remington’sPharmaceuticalSciences)中找到。反义低聚核苷酸或包含所述反义低聚核苷酸的药物组合物，可以包装在方便的试剂盒中，其中还提供包装在适合容器内的必要材料。本发明的低聚核苷酸和核酶调节肿瘤细胞的生长。因此提供了用于干扰或抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的方法，包括使肿瘤或肿瘤细胞与本发明的反义低聚核苷酸接触。术语“接触”是指将低聚核苷酸、核酶等加入到细胞悬浮液或组织样本中，或者是指将低聚核苷酸等直接或间接对动物内的细胞或组织给药。所述方法可以用于治疗增殖性机能紊乱，包括各种形式的癌症，例如白血病、淋巴瘤(何杰金氏与非何杰金氏)、肉瘤、黑素瘤、腺瘤、实体组织癌、低氧肿瘤、口、咽、喉和肺的鳞状细胞癌、泌尿生殖癌症例如宫颈癌和膀胱癌、造血癌症、结肠癌、乳癌、胰腺癌、肾癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、头颈癌和神经系统癌症，以及良性损害，例如乳突淋瘤。还包括其他增殖性机能紊乱，例如牛皮癣和涉及关节硬化、血管生成和病毒感染的那些增殖性机能紊乱。本发明的低聚核苷酸还可以用于治疗耐药性肿瘤。耐药性肿瘤的实例是耐受化疗剂的肿瘤，所述化疗剂是例如5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶呤或羟基脲，和表达高水平P-糖蛋白的肿瘤，已知P-糖蛋白带来对多种抗癌药，例如秋水仙碱、长春花碱和阿霉素的耐受性；或者表达多种耐药蛋白的肿瘤，如Dreeley等所述。因此，可以设想，本发明的低聚核苷酸可以结合已知的抗癌化合物或化疗剂给药，或者除已知的抗癌化合物或化疗剂外另外给药。化疗剂是可以抑制肿瘤生长的化合物。这样的试剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶呤和羟基脲。可以设想，化疗剂的量既可以是有效量，即足以抑制肿瘤生长的量，也可以是小于有效量。可以想到，本发明的低聚核苷酸也可以与其他抗致瘤性的疗法结合使用，例如放射疗法，以增加放射疗法的功效。已经发现，本发明的低聚核苷酸可减少转移性肿瘤的生长，例如MDA-MB-231乳腺癌、HT-29结肠腺癌、H460肺癌和A2058黑素瘤的癌细胞。在发明的一个实施方案中，提供了用于减少哺乳动物转移瘤生长的方法，该方法包括将一定量的与核糖核苷酸还原酶mRNA互补的低聚核苷酸，或表1、2和3所示的低聚核苷酸给药。低聚核苷酸可以利用病毒或非病毒载体释放。序列可以结合在弹夹或构成物内，以便本发明的低聚核苷酸在细胞中被表达。优选地，所述构成物含有适当的转录控制区，以允许低聚核苷酸在细胞中被转录。因此，本发明提供包含转录控制序列的载体，该转录控制序列可连接到编码本发明低聚核苷酸的序列上。本发明进一步提供宿主细胞，选自适合的真核生物和原核生物细胞，将它们用这些载体转化。适合的载体是已知的，并优选含有实现所需的序列转录所必要的所有表达组件。噬菌粒是这类有益载体的具体实例，因为它们既可以用作质粒，也可以用作噬菌体载体。载体的实例包括病毒，例如噬菌体、杆状病毒、逆病毒、DNA病毒、脂质体和其他重组载体。所述载体还可以含有适用于原核生物或真核生物宿主系统的组件。本领域的普通技术人员将知道哪些宿主系统与特定的载体是相容的。所述载体可以通过稳定或瞬变的转染、lipofection、电穿孔和被重组病毒载体感染而被引入到细胞内。可以向所述载体加入其他特征，以确保它的安全性和/或提高它的疗效。这样的特征包括例如标记物，可以用于被动地选择被重组病毒感染的细胞。这样的被动选择标记物的一个实例是TK基因，它带来对抗病毒药更昔洛韦的敏感性。还可以包括限制特定细胞类型表达的特征。这些特征包括例如启动子和调节组件，它们对所需的细胞类型是特异性的。逆病毒载体是可用于体内引入所需核酸的载体的另一个实例，因为它们赋予诸如侧向感染和定向特异性等优点。侧向感染是这样一种过程，通过该过程，单一被感染的细胞产生很多后代病毒体，感染相邻的细胞。结果是大面积细胞被迅速感染。用在本发明方法中的载体，可以根据所要针对的所需细胞类型加以选择。例如，如果所要治疗的是乳癌，那么可以使用对上皮细胞专一的载体。类似地，如果所要治疗的是造血系统的细胞，那么优选对血液细胞专一的病毒载体。实用性本发明的反义低聚核苷酸可以用于各种目的。它们可以用于抑制哺乳动物细胞中核糖核苷酸还原酶基因的表达，导致抑制该细胞的生长。低聚核苷酸可以用作杂交探针，用于检测哺乳动物细胞中核糖核苷酸还原酶mRNA的存在。当如此使用时，低聚核苷酸可以用合适的可检测基团(例如放射性同位素、配体、特异性结合对的另一组分，例如生物素)标记。最后，低聚核苷酸可以用作分子量标记物。为了进一步阐述本发明及其优点，给出下列具体的实施例，但是无论如何也不表示它们限制权利要求书的范围。实施例在下列实施例中，所有温度均为摄氏度(除非另外指出)，所有百分率均为重量百分率(除非另外指出)。在下列实施例中，下列缩写具有下列含义。如果缩写是没有经过定义的，它具有一般所接受的含义μM＝微摩尔mM＝毫摩尔M＝摩尔ml＝毫升μl＝微升mg＝毫克μg＝微克PAGE＝聚丙烯酰胺凝胶电泳rpm＝每分钟的转数ΔG＝自由能，低聚核苷酸双链体稳定性的一个量度kcal＝千卡FBS＝牛胎血清DTT＝二硫苏糖醇SDS＝十二烷基硫酸钠PBS＝磷酸盐缓冲盐水PMSF＝苯甲基磺酰氟通用方法本领域已知的标准分子生物技术一般遵照Sambrook等(1989，1992)、Ausubel等(1989)和Perbal，(1988)中的叙述，不再赘述。聚合酶链反应(PCR)一般按照《PCR规程方法和应用指南》(PCRProtocolsAGuideToMethodsAndApplications)，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)进行。通用的免疫学方法本领域已知的标准免疫学方法一般遵照Stites等(eds)《基础与临床免疫学》(BasicandClinicalImmunology)(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)和MishellandShugi(eds)《细胞免疫学中的精选方法》(SelectedMethodsinCellularImmunology)，W.H.FreemanandCo.，NewYork(1980)，不再赘述。致瘤性和转移的测定如前人所报道的方法测定恶性肿瘤潜在性(Wright，1989a；Egan等，1987a，1987b；Damen等，1989；Taylor等，1992；Stokoe等，1994)。六至八周龄C3H/HeN同基因小鼠(CharlesRiver，Quebec)用于评价细胞的致瘤性和转移的潜在性。细胞是从次汇合的对数生长的培养物中制备的，通过小心地用胰岛素/EDTA溶液处理加以收集，并在平衡盐溶液中调节至适当的浓度。关于致瘤性(肿瘤潜伏期)测定，将体积为0.1ml的1×105个细胞皮下注射到小鼠背部，并记录形成可被触诊检测到的肿瘤(2×2mm)所需的时间。通过在肿瘤出现后每天测量肿瘤直径并估计肿瘤基本面积，评价肿瘤的生长[Damen等，1989]。乘以肿瘤横切面的大小，测定肿瘤大小。21天后摘除小鼠中的肿瘤，记录肿瘤重量。在没有肿瘤形成的情况下，注射后喂养小鼠2个月，然后处死。关于实验性转移测定(转移潜在性的测定)，将体积为0.2ml的1×105个细胞注射到6-8周龄C3H/HeN同基因小鼠尾静脉中，21天后估计肺肿瘤数。处死小鼠，气管内注射布安氏液(Bouin’ssolution，苦味酸、甲醛、乙酸(15∶5∶1))进行肺染色[Egan等，1987b；Damen等，1989]。借助解剖显微镜计数肺肿瘤。为了确认所注射的试验细胞与对照细胞数量相等，在含有生长培养液的培养平皿副本中接种大约100个细胞/平皿。培养10天后，平皿用亚甲基蓝染色，评价集落。核糖核苷酸还原酶测定如前人所报道的方法，测定细胞粗提取物中核糖核苷酸还原酶活性[Lewis等，1978；Hurta和Wright，1992；Hurta和Wright1995A]。从对数生长的细胞中获得酶制剂，所述细胞通过三次冷冻-融化循环，溶解在pH7.2的磷酸盐缓冲盐水中，该盐水中含有lmm二硫苏糖醇和lmM蛋白酶抑制剂，AEBSF(Calbiochem，SanFrancisco，CA)。离心后，如前人所详述的方法，用含[14C]-CDP(MoravekBiomedical，Brea，CA)的上层清液，进行酶活性测定[Lewis等，1978；Hurta和Wright1992；Fan等，1996A；Choy等，1988]。蛋白质印迹分析所采用的操作已有报道[Fan等，1996a；1996b；Choy等，1988]。简言之，制备细胞提取物后，测定总蛋白含量，并在10％线性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析等分试样。蛋白质转移和封闭后，将膜与抗-R2兔多克隆抗体培养[Fan等，1996A]。使用与碱性磷酸酶共轭的山羊抗-兔IgG(Sigma)检测R2蛋白。低聚核苷酸反义低聚核苷酸选自与核糖核苷酸还原酶mRNA互补的序列，以便该序列表现出最小的显示双链体形成、发针形成和均低聚物/序列重复的可能性，但是具有高的结合核糖核苷酸还原酶mRNA序列的可能性。另外，消除使人或动物对人和小鼠中其他经常出现的或重复的序列具有易感性的错误。这些性质利用计算机建模程序OLIGO?引物分析软件3.4或5.0版(NationalBiosciences，Inc.，Plymouth，MN)加以测定。低聚核苷酸序列在合成时被完全硫代酸化，表1和2中用(s)表示的部分硫代酸化除外。细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可以得到不同的人癌细胞系，包括肺癌(H460)、卵巢腺癌(SK-OV-3)、肝细胞癌(HepG2)、乳腺癌(MDA-MB-231)、转移性胰腺癌(AsPC-1)、结肠腺癌(HT-29)、人黑素瘤细胞系(A2058)、人脑癌(U87)细胞。在补充有10％牛胎血清(FBS)的α-MEM培养液(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中供养细胞系。实施例1R2与活化致癌基因的协同性为了测定核糖核苷酸还原酶的决速性R2组分的反常表达的恶性潜在性，本发明人研究了携带小鼠R2组分的逆病毒表达载体(SH/mR2)(Fan等，1996b)稳定感染的细胞的性质。本发明人进一步探究了R2与活化致癌基因之间的相互作用。表达载体如Fan等[1996b]所述，构建和包装用于人Myc表位-标记的小鼠R2组分的逆病毒表达载体SH/mR2。病毒储备溶液的感染性＞1×104集落形成单位/ml。表达T-24H-ras的质粒pHO6Ti和选择性标记物neo，用于恶性转化[Egan等，1987a，1987b；Taylor等，1992]。M.Symons提供了活化的Rac-1质粒(V12Rac-1)[Stokoeetal.，1994]。细胞和细胞培养物小鼠细胞系BALB/c3T3、NIH3T3，和四种名为Cl、NR4、r-2与r-3的T24H-ras