一种含有博落回提取物的微乳注射剂及其制备方法[0002]目前兽医临床上由于抗生素的滥用，导致细菌的耐药现象在全球范围内迅速蔓延。耐药性的产生不仅使治疗细菌感染成为了严重困扰动物健康的问题，同时由于动物源性食品的兽药残留超标及耐药性传递，对人类健康也产生严重的威胁。因此寻求中兽药治疗畜禽疾病、减缓耐药菌株的产生已成为当前研究热点。但目前中兽药制剂技术落后，剂型单一，主要以传统散剂为主，占中国兽药典收录剂型的百分之八十多，远不能适应满足兽医临床实际需要。[0003]微乳是由水相、油相、乳化剂及助乳化剂在适当的配比下组成的粒径在10~IOOnm的一种透明或半透明、热力学与动力学稳定的分散体系。微乳对水溶性、脂溶性及难溶性药物均有较好的溶解力，作为油、水难溶性药物的载体有其独特优点。研究证明，制备微乳可提高难溶性药物的溶解度，促进大分子水溶性药物在机体内的吸收，提高药物在体内的生物利用度，还可提高不稳定药物的稳定性。[0004]博落回注射液是兽药国标收载的治疗仔猪大肠杆菌病经典处方，因博落回主要有效成分氨性生物碱水溶性差，目前标准上收载的博落回注射液只有一个低含量规格(0.5/100，g/ml)。小规格含量的博落回注射液存在用药次数多，生物利用度低，质量不稳定等不利因素。本发明采用的自微乳技术，具有增加博落回生物碱溶解度及提高药物稳定性和生物利用度等优点，具有更广阔的发展前景并将得到广泛的应用。
[0005]本发明的目的在于针对目前兽医临床上抗生素的不合理使用，提供一种防治仔猪大肠杆菌病的纯中药微乳制剂及其制备方法。博落回的主要有效成分为氨性生物碱，在水中几乎不溶，生物利用度低，严重影响了药物的临床疗效。本发明利用伪三元相图筛选处方，确定了博落回提取物的微乳注射剂的各组分及最佳比例，主要包括药物、油相、表面活性剂以及助表面活性剂的选择及比例。采用本发明自微乳技术制备的微乳注射剂治疗猪大肠杆菌病效果明显优于传统中药注射剂，具有良好的市场前景。[0006]本发明的技术方案是:一种含有博落回提取物的微乳注射剂，其特征是，所述每100mL的微乳注射剂包含以下组分:博落回提取物0.5~5g, 二乙酸甘油酯I~15g,聚山梨酯-80 (乳化剂)I~4g,聚乙二醇600 (助乳化剂)0.1~Ig,甘油(助乳化剂)I~IOg,维生素E0.1~Ig,注射用水加至100mLo[0007]优选配比为:博落回提取物3g，二乙酸甘油酯10g，聚山梨酯-80 2g，聚乙二醇6000.5g，甘油5g，维生素E0.5g，注射用水加至100ml。
[0008]所述博落回提取物是由博落回经提取、纯化、浓缩、干燥制得的中药提取物，主要有效成分为血根碱(C2tlH14NO4)和白屈菜红碱(C21H18NO4), 二者的总量不少于60.0% (w/w) 0
[0009]本发明的另一个目的是提供一种含有博落回提取物的微乳注射剂的制备方法，具体包括以下步骤:
[0010](I)油相的制备
[0011]按上述配比称取博落回提取物、二乙酸甘油酯和维生素E，将二乙酸甘油酯100-120°C湿热灭菌20-40分钟，降至60~70°C时，将博落回提取物和维生素E加入其中，搅拌至完全溶解至透明状作为油相备用；
[0012](2)水相的制备
[0013]按上述配比称 取聚山梨酯-80、甘油和聚乙二醇600，加入注射用水中，加热使其溶解至透明状，100-120°C灭菌20-40分钟，降至室温作为水相备用；
[0014](3)乳化
[0015]油相经管道进入乳化罐，水相缓慢加入,边加边搅拌,加完继续搅拌5~8min成初乳，初乳加入胶体磨剪切乳化15~30分钟，形成澄明的单一相微乳体系，过0.45 μ m滤膜除去粗乳滴及碎片，最后经低温间歇蒸汽灭菌法重复3-5次，每次灭菌温度75°C~80°C，每次灭菌时间20-40分钟，即得细分散的0/W型微乳注射液。取样，12000r/min离心15min观察，应不分层、不破乳，则合格，可进行灌封，即得。
[0016]作用与用途:主治仔猪黄白痢。
[0017]用法与用量:肌内注射,一次量，猪，2~IOml, —日I次；一次用量不得过15ml。
[0018]各原料药来源及药理作用
[0019]博落回:S粟科植物博落回(Macleaya cordata(ffilld.)R.Br.)的果实。博落回提取物中有效成分主要为血根碱(sanguinarine)和白屈菜红碱(chelerythrine),以果实中含量最高。博落回具有较强的杀菌、抑菌活性，体外抑菌试验和兽医临床试验表明，博落回提取物对大肠杆菌最低抑菌浓度(MIC)为7.81ug/mL，治疗仔猪黄痢和白痢的总有效率达80%，并具有用量小、成本低等优点，已载入农业部96版《兽药质量标准》中。
[0020]二乙酸甘油酯:作为油相，无色透明无嗅油状液体；微溶于水、易溶于醇、醚和其它有机溶剂，为优良、高效、安全无毒的有机溶剂，广泛用于制药产业。
[0021]聚山梨酯80:别名吐温80，为淡黄至橙黄色的黏稠液体，是非离子型亲水性表面活性剂，毒性、刺激性、溶血性都很小，安全性高且乳化能力强。
[0022]聚乙二醇600、甘油:为助表面活性剂，协助表面活性剂降低界面张力；增加界面流动性，减少微乳形成时的界面弯曲能，使微乳自发形成；调节表面活性剂的HLB值，使表面活性剂在油-水界面有较大的吸附。维生素E是抗氧剂。
[0023]本发明的有益效果是:本发明根据微乳作为载药系统，具有增加难溶性药物溶解度及提高药物稳定性和生物利用度等优点，将博落回提取物溶解在微乳的油相中，制成药物微乳注射剂，不仅克服了博落回生物碱溶解性差，生物利用度低的缺点，而且微乳质量稳定，在室温密封遮光条件下保质期为24个月。同时该制剂具有缓释特点，从而减少了用药次数，有利于维持恒定的血药浓度，减少多次给药的毒副作用，更好得发挥了药物临床疗效，在药剂学方面展现了广阔的应用发展前景。对仔猪大肠杆菌病的临床防治效果表明，该制剂的有效率达100%，治愈率达90%以上，明显优于传统中药注射液。该微乳注射剂无任何毒副作用、无残留、符合当前“绿色产品”发展要求等优点。
[0024]实施例1
[0025]配比:博落回提取物3g，二乙酸甘油酯10g，聚山梨酯-80 2g，聚乙二醇600 0.5g,甘油5g，维生素E0.5g，注射用水加至100ml。
[0026]上述博落回提取物，由湖南美可达生物资源有限公司生产，批号；2013051201，系博落回经提取、纯化、浓缩、干燥制得的中药提取物，主要有效成分为血根碱(C2tlH14NO4)和白屈菜红碱(C21H18NO4), 二者的总量不少于60.0 % (w/w) ο
[0027]制备方法:
[0028](I)油相的制备按上述配比准确称取博落回提取物、二乙酸甘油酯和维生素E，将二乙酸甘油酯115°C湿热灭菌30分钟，降至60~70°C时，将博落回提取物、维生素E加入其中，500rmp/min搅拌10分钟并不断搅拌至完全溶解至透明状作为油相备用；
[0029](2)水相的制备按上述配比准确称取乳化剂聚山梨酯-80、助乳化剂甘油和聚乙二醇600，加入注射用水中，加热使其溶解至透明状，115°C灭菌30分钟，降至室温作为水相备用；
[0030](3)乳化油相经管道进入乳化罐，水相缓慢加入，边加边搅拌，加完继续搅拌5~8min成初乳,初乳加入胶体磨剪切乳化15~30分钟,形成澄明的单一相微乳体系，过0.45 μ m滤膜除去粗乳滴及碎片，最后经低温间歇蒸汽灭菌法重复3次，每次灭菌温度75°C~80°C，每次灭菌时间30分钟，即得细分散的0/W型微乳注射液。取样，12000r/min离心15min观察，应不分 层、不破乳，则合格，可进行灌封，即得。
[0031]上述微乳注射剂为淡棕红色至棕红色透明液体，平均粒径为60.14± 1.06nm,多分散指数为0.198。微乳液滴呈圆球形。
[0032]该微乳体系性质稳定,3000r/m离心15min,未见分层,在37°C条件下避光放置21天进行加速试验，结果未见破乳现象发生。
[0033]以下结合实验数据说明其治疗效果。
[0034]1.试验材料
[0035]1.1试验药物:实施例1制备的含有博落回提取物的微乳注射剂。
[0036]1.2对照药物①:硫酸庆大霉素注射液(5ml: 20万单位)，批号:20020415，齐鲁动
保厂生产；
[0037]对照药物②:博落回注射液，批号:20130415，齐鲁动保厂生产。
[0038]1.3试验猪:患黄痢、白痢的自然发病仔猪，莱芜振兴猪场提供。
[0039]1.4菌种:猪大肠杆菌08、064、O101株，山东省兽医总站检验中心惠赠，山东省兽药质量检验所传代、保存。
[0040]1.5培养基:营养肉汤、营养琼脂平板,按常规方法制作。
[0041]2试验方法
[0042]2.1病原鉴定:用灭菌棉拭子从患拉稀的自然发病仔猪的直肠深部采集病料，进行细菌分离、培养和鉴定，以确诊是否为仔猪黄白痢。
[0043]2.2体外抑菌试验:
[0044]2.2.1药物原液的配制:用灭菌蒸馏水将药物稀释至1280ug/ml。[0045]2.2.2试管两倍稀释法测MIC
[0046]菌液的制备:无菌操作法取已活化的菌种一环于含6ml肉汤培养基的小试管中，37°C培养17小时，使其生长浊度达9X 108/ml。采用倍比稀释法，将菌液稀释10000倍。
[0047]MIC测定:根据所试药物和菌种数排列无菌小试管，每一种药物和任一菌排一列，每一列13管。将上述已稀释10000倍的菌液加入到各小试管中，除第一管加入稀释后菌液
1.8ml外,其余各管均加入1ml。继于第I管加入抗菌药物原液0.2ml,混匀后吸出Iml加入第2管中，用同样方法依次稀释至第12管，弃去lml。第13管作为生长对照。则各管的浓度依次为 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25,0.125,0.06 μ g/ml ? [0048]培养:将各管置于37°C温箱中培养17h，以无细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度 MIC。
[0049]2.3临床试验及疗效观察
[0050]2.3.1试验分组:挑选患黄白痢的自然发病仔猪随机分成5组。1、IIJII组为博落回提取物的微乳注射液高、中、低剂量治疗组，剂量分别为10、5、2.5mg/Kg体重，肌肉注射，I天I次，连用3天。IV组为硫酸庆大霉素注射液对照组，4mg/Kg体重，肌肉注射，每天二次，连用3天。V组为博落回注射液对照组，5mg/kg体重,一日2~3次,连用3天。VI组安全性试验组，给相同日龄的健康仔猪注射25mg/kg体重的博落回提取物的微乳注射液，每天2次，连用3天。与病猪隔尚饲养。
[0051]2.3.2疗效观察:试验期为7天，试验期间注意观察排粪次数及粪便状态。疗效判断标准:
[0052]痊愈:治疗后患猪的精神、食欲恢复正常,粪便呈条状或颗粒状,肛门干燥、收缩、无红肿，七天内无复发现象。
[0053]显效:治疗后粪便变稠，排便次数减少，肛门红肿未完全消退，精神食欲有所改善。
[0054]无效:治疗后患猪精神、粪便、食欲无明显改善，甚至死亡。
[0055]3试验结果
[0056]3.1病原鉴定:用灭菌棉拭子从病猪直肠深部采集病料，接种营养肉汤增菌培养，然后在麦康凯鉴别培养基上划线，37°C培养24小时有大量大小均一的红色菌落生长。挑取菌落，涂片，染色，镜检为革兰氏阴性短杆菌。用分离菌培养物给仔猪灌服，能复制出类似症状。结合流行病学特点，确诊为仔猪黄痢白痢。
[0057]3.2体外抑菌试验结果
[0058]本试验结果表明，博落回提取物的微乳注射液对猪源致病性大肠杆菌08、064、O101的MIC为8ug/ml,硫酸庆大霉素的最低抑菌浓度为16ug/ml。可见,病原菌已对庆大霉素产生一定的耐药性。
[0059]3.3临床治疗试验结果
[0060]病猪在用药后精神好转，拉稀症状减轻，排便次数减少，粪便变稠，用药3次病猪基本痊愈。试验药物中剂量组的有效率、治愈率分别为100%、94.7%，结果见下表:
[0061]表1博落回提取物的微乳注射液液临床试验结果
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