专利名称：与免疫应答有关的新颖多肽的制作方法要产生适当的T淋巴细胞(T细胞)免疫应答，必须通过抗原呈递细胞(APC)提供给T细胞两个信号。第一，如果要决定特异性，抗原必须经由主要组织相容性复合体(MHC)呈递给T细胞受体(TCR)。第二，不须依赖抗原的共同刺激信号必须通过APC上的B7族成员与T细胞上的CD28蛋白的衔接来递送。生产性免疫应答导致增殖、分化、克隆扩充、和效应或功能。在没有第二个共同刺激信号的情况下，T细胞经历持久的抗原特异性无效应性状态，称之为无反应性。T细胞引发免疫应答，介导抗原特异性效应子功能，并通过分泌细胞因子调节其他白细胞的活性。T细胞受体(TCR)将T细胞与其他淋巴细胞区别开来，并且当其在MHC的范围内通过APC呈递时可以仅结合抗原。特定T细胞的功能活性可以与膜抗原诸如CD4和CD8的表达联系起来。例如，CD4+T细胞通常起T辅助细胞(TH)的作用，并且是MHC类别II限制性的；而CD8+细胞通常起细胞毒性T细胞(Tc)的作用，并且是MHC类别I限制性的。先前已确定的有效的T细胞共同刺激多肽包括名为B7.1的多肽(Freeman等，J.Immunology(免疫学杂志)143，2714-2722(1989)，Freeman等，Jour.Expt.Med.(实验医学杂志)174，625-31(1991))和名为B7.2的多肽(Freeman等，Science(科学)262，909-911(1993)，和Freeman等，Jour.Expt.Med.(实验医学杂志)178，2185-2192(1993))，(或者分别是CD80和CD86)。这些多肽或者是诱导的，或者组成性表达于各种APC上，并且分别是T细胞上CD28和CTLA-4的膜结合配体。CD28(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院报)84，8573-8577(1987)和Gross等，J.Immun.(免疫学杂志)144，3201-3210(1990))在静息T细胞上表达，并介导正的共同刺激信号。CTLA-4(Brunet等，Nature(自然)328，267-270(1987)和Dariavach等，Eur.Jour.Immun.(欧洲免疫学杂志)18，1901-1905(1988))表达是随着T细胞的活化诱导的，并负向调节CD28信号，因为其对B7.1和B7.2有更高的结合亲和力。没有CTLA-4基因的小鼠显示出非常高的T细胞浓度，因为在缺乏CTLA-4的情况下有关增殖信号的切断机理削弱了。这种表现型清楚地证明了CTLA-4共同刺激蛋白具有对T细胞增殖的主要抑制作用。缺乏CD28或B7.1或B7.2的小鼠具有较轻程度的表现型，表明可能存在用于T细胞共同刺激的另外的路径。对于用CD28/CTLA-4路径作为调节T细胞活化和增殖的手段这一点人们一直相当感兴趣。含有与人Fc融合的CTLA-4的细胞外部分的嵌合蛋白具有强免疫抑制作用，并且已在各种各样的临床环境中进行了研究。对B7.1和B7.2蛋白的抗体也已就免疫抑制范围内的类似表现进行了评估。抗CTLA-4抗体已显示了促进T细胞活化的效用。此外，B7.1和B7.2基因治疗在癌症的免疫治疗方面显示出极大的前途。迄今为止，CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2都与单T细胞共同刺激路径有关。被赋予通过调节T细胞共同刺激来调制免疫应答的能力后，它将有希望鉴别相同的其他成员或可在调节宿主T细胞功能和免疫应答中具有有益性能的分离的T细胞共同刺激路径。因此，本发明的一个目的是提供用于刺激T细胞活性和/或增殖的新颖多肽。本发明的另一个目的是使用这些新颖多肽来预防和治疗T细胞介导的免疫疾病。发明概述出乎意料地，现已确定了T细胞共同刺激路径的两种新颖多肽。这些多肽代表看来似乎与由先前所述的蛋白CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2组成的路径不同的独特的共同刺激路径中的配体-受体对。这些多肽被称之为CD28相关蛋白-1或CRP1，和B7相关蛋白-1或B7RP1。本发明提供了编码CRP1和B7RP1多肽以及相关多肽的核酸分子。本发明的分离核酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列a)、

图1A中显示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；b)、编码图1A中显示的残基1-200或21-200的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；
c)、编码与图1A中显示的多肽至少约70％相同的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；d)、(a)、(b)或(c)任一个的天然产等位变体或可变剪接变体；e)、与(a)、(b)或(c)任一个互补的核苷酸序列；f)、编码至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少约10、15、20、25、50、75、100或大于100个核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在严格条件下与(a)-(g)任何之一杂交的核苷酸序列。
本发明还提供了包含选自下列成员的核苷酸序列的分离核酸分子a)、图2A(SEQ ID NO6)或图3A(SEQ ID NO11)或图12A(SEQ IDNO16)中显示的核苷酸序列；b)、编码图2A(SEQ ID NO6)中显示的残基1-322或残基47-322的多肽或者图3A(SEQ ID NO11)中显示的残基1-288或残基19-288、20-288、21-288、22-288、24-288或28-288的多肽的核苷酸序列；或者编码图12A中显示的残基1-302或残基19-302、20-302、21-302、22-302、24-302或28-302的多肽的核苷酸序列；c)、编码与图2A(SEQ ID NO6)或图3A(SEQ ID NO11)或图12A(SEQ ID NO16)中显示的多肽至少约70％相同的多肽的核苷酸序列；d)、(a)、(b)或(c)任一个的天然产等位变体或可变剪接变体；e)、与(a)、(b)或(c)任一个互补的核苷酸序列；f)、编码至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少约10、15、20、25、50、75、100或大于100个核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在严格条件下与(a)-(g)任何之一杂交的核苷酸序列。
本发明的主题还涉及CRP1和B7RP1多肽以及相关多肽。本发明提供了包含选自下列成员的氨基酸序列的分离多肽a)、图1A中显示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)；b)、图1A(SEQ ID NO2)中显示的包含位于残基21上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；
c)、图1A(SEQ ID NO2)中显示的包含至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物(ortholog)；和e)、(a)、(b)或(d)的等位变体或可变剪接变体。
本发明还涉及包含选自下列成员的氨基酸序列的分离多肽a)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)或图12A(SEQ IDNO17)中显示的氨基酸序列；b)、图2A(SEQ ID NO7)中显示的包含位于残基47上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或图3A(SEQ ID NO12)中显示的包含位于残基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或图12A(SEQ ID NO17)中显示的包含位于残基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)或图12A(SEQ IDNO17)中显示的包含至少约25、50、75、100或大于100个氨基酸残基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位变体或可变剪接变体。
本发明还包括用于生产多肽的表达载体和宿主细胞，与CRP1和B7RP1多肽结合以及与相关多肽结合的抗体，和用于检测B7RP1和B7RP1相关多肽与CRP1和CRP1相关多肽的结合的测定法。本发明还涉及包含CRP1或CRP1相关多肽和B7RP1或B7RP1相关多肽的药物组合物。本发明还提供了用于鉴别与CRP1或B7RP1相互作用的化合物的方法，以及用于确定这些化合物是否是CRP1或B7RP1活性的激动剂或拮抗剂的测定法。
CRP1和B7RP1多肽与T细胞共同刺激和增殖有关。CRP1和B7RP1多肽、其选择性结合剂、以及其激动剂和拮抗剂，可以用于诊断、预防和治疗与T细胞反应的控制有关的疾病。
CRP1和B7RP1多肽、其选择性结合剂、以及其激动剂和拮抗剂，可以用于诊断、预防和治疗免疫疾病，或者用于刺激不足的免疫应答，或者减少或抑制过度或不适当的免疫应答。免疫疾病可以由T细胞直接或间接介导。
本发明提供了治疗、预防或改善T细胞介导疾病的方法，包括对动物给药CRP1或B7RP1多肽。本发明还提供了诊断动物的T细胞介导疾病或对T细胞介导疾病的敏感性的方法，包括测定CRP1或B7RP1多肽表达的存在或量；和基于多肽表达的存在和量诊断T细胞介导疾病或对T细胞介导疾病的敏感性的方法。一般说来，T细胞介导疾病是可以由T细胞直接或间接介导的免疫疾病。动物优选是哺乳动物，更优选为人。本发明还提供了鉴别与CRP1或B7RP1多肽结合的检验分子的方法，包括使多肽与检验化合物接触并测定多肽与检验化合物的结合伸展。该方法可以用于鉴别CRP1和/或B7RP1多肽的激动剂和拮抗剂。
CRP1和/或B7RP1多肽的拮抗剂可以用作许多适应症用的免疫抑制剂，包括自身免疫疾病(诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化、糖尿病和系统性红斑狼疮)，中毒性休克综合征，骨髓和器官移植，炎性肠疾病，因输血导致的同种致敏，和移植物抗宿主疾病的治疗。此外，拮抗剂可以用作T细胞依赖性B细胞介导的适应症包括哮喘和变态反应、以及抗体介导的自身免疫用的抑制剂。CRP1和/或B7RP1多肽的激动剂可以用于但不限于肿瘤监测和切除中的T细胞活化。
本发明的拮抗剂包括抗体或其片段，它们能与B7RP1反应或者与B7RP1或B7RP1的胞外域结合，其中抗体减少或消除B7RP1与CRP1的结合。在一个实施方案中，抗体选择性地与人B7RP1或其胞外域结合。属于拮抗剂的抗体或其片段部分或完全抑制B7RP1的免疫共同刺激活性。在优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体并且可以是鼠的、人的、嵌合的或人源化的。
本发明进一步提供了调节B7RP1与CRP1的相互作用的方法，包括对动物给药CRP1的选择性结合剂或B7RP1的选择性结合剂或二者。在一个实施方案中，选择性结合剂是与B7RP1结合的抗体并且减少或消除B7RP1与CRP1的结合。本发明还提供了调节由B7RP1介导的免疫共同刺激的方法，包括对动物给药B7RP1的选择性结合剂。该选择性结合剂优选与B7RP1结合的抗体并部分或完全抑制由B7RP1介导的免疫共同抑制。
本发明还提供了调节动物体内的T细胞活化或增殖的方法，包括对动物给药编码CRP1或B7RP1多肽的核酸分子。例如，编码B7RP1多肽的核酸分子可以在基因治疗中用于增强响应各种肿瘤的T细胞活化。
本发明还包括转基因的非人哺乳动物，其包含编码CRP1或B7RP1多肽的核酸分子。CRP1或B7RP1核酸以允许CRP1或B7RP1多肽的表达和循环浓度增加的方式引入到哺乳动物体内。该转基因非人哺乳动物优选啮齿动物，更优选小鼠或大鼠。
附图的描述图1、A).鼠CRP1的DNA和氨基酸序列(mCRP1)。预测的CRP1的信号序列在氨基端加了下划线，实验确定的前肽切割位点由星号指示。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).鼠CRP1蛋白序列(mCRP1)与鼠CD28(mCD28)的氨基酸序列对比。
图2、A).鼠B7RP1的DNA和氨基酸序列(mB7RP1)。预测的B7RP1的信号序列在氨基端加了下划线，实验确定的前肽切割位点由星号指示。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).B7RP1蛋白序列(mB7RP1)与鼠CD80(mCD80)的氨基酸序列对比。
图3、A).推定人B7RP1(hB7RP1)的蛋白质编码区的结构和序列。hB7RP1的预测信号序列在氨基端加了下划线。预测的信号肽切割位点用星号标记。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).推定的成熟hB7RP1蛋白质与成熟的鼠B7RP1(mB7RP1)蛋白质的氨基酸序列对比。
图4、A).来自用pcDNA3/CRP1-Fc转染的293T细胞的可溶性CRP1-Fc融合蛋白的表达。如图中所示在10％PAGE凝胶上加载并分离归一化体积的细胞裂解物或条件培养基。用于细胞伴随的(细胞裂解物)和分泌的(培养液)Fc融合蛋白的表达的细胞裂解物和细胞培养上清液的蛋白质印迹分析。初级抗体是山羊抗人Fc抗体(Pierce化学公司，Rockford，IL.)。B).来自用pcDNA3/B7RP1-Fc转染的293T细胞的可溶性B7RP1-Fc融合蛋白的表达。在10％PAGE凝胶上加载并分离20μl的归一化细胞裂解物或培养上清液。如(A)中所述进行蛋白质印迹分析。
图5、CRP1-Fc和B7RP1-Fc融合蛋白与COS-7细胞中表达的膜结合蛋白的相互作用。COS-7细胞用pcDNA3/CRP1、pcDNA3/B7RP1、或单独的pcDNA载体瞬时转染。CH0 D细胞用psDRα/hCD28转染并稳定地表达人CD28(hCD28)。表达膜结合CRP1、B7RP1或hCD28的细胞如图所示一排排地表示在面板的左侧。Fc融合蛋白用如图所示一列列地表示在面板上部的平板结合细胞温育。温育后，将细胞洗涤，使用抗人Fc抗体和ACAS(粘着细胞分析和分选；ACAS Ultima，Meridian Instruments，Inc.，Okemos，MI)分析检测结合Fc融合蛋白。
图6、B7RP1的受体(推定的，CRP1)在活化CD4+和CD8+T细胞上的表达的FACS(荧光活化细胞分检器)分析。小鼠脾细胞用PMA和离子霉素活化12小时。B7RP1-Fc融合蛋白、对照Fc蛋白(Mock-Fc)或PBS(未染色)用细胞温育，洗涤，随后用显示在每个面板底部的山羊抗人Fc-FITC缀合抗体(GaHuFc-FITC)温育。加入显示在每个面板左侧的细胞标志抗体(T细胞标志CD4和CD8的)PE缀合的、或同种型对照抗体(大鼠同种型)PE缀合的、或PBS(未染色)。
图7、B7RP1在B细胞上的表达的FACS(荧光活化细胞分检器)分析。CRP1的配体(推测的，B7RP1)在小鼠脾细胞上的表达的荧光细胞计量分析。CRP1-Fc融合蛋白、对照Fc蛋白(Mock-Fc)或PBS(未染色)用细胞温育，洗涤，随后用显示在每个面板底部的山羊抗人Fc-FITC缀合抗体(GaHuFc-FITC)温育。加入显示在每个面板左侧的CD45R的PE缀合细胞标志抗体(CD45R是B细胞标志)或同种型对照抗体(大鼠同种型)或PBS(未染色)。
图8、mCRP1配体在腹膜巨噬细胞上的表达的FACS分析。腹膜细胞首先根据它们的光散射性能分成亚群(面板A)。巨噬细胞由于它们强大的向前(FSC)和向侧面(SSC)散射光的能力以及由于它们对巨噬细胞的标记-F4/80抗原的阳性染色而在5区(R5)中鉴别出来(面板B)。6区(R6)中的巨噬细胞在它们对F4/80抗原染色强度小并且发现能被CRP1-Fc融合蛋白染色(推测是由于它们对B7RP1的表达)的基础上挑选出来。
图9、使用B7RP1-Fc融合蛋白对T细胞增殖的抑制。来自小鼠脾细胞的T细胞用图底部所示的递增浓度的伴刀豆凝集素A(Con A)活化。将mCRP1-Fc、mB7RP1和mB7.2-Fc融合蛋白在不存在(没有加入)或存在Con A的条件下加入到来自脾细胞的富集T细胞中。200,000个细胞用于在96孔平板中进行的T细胞增殖测定。细胞用图例中所示的培养基(没有加入)或Fc融合蛋白温育。42小时后，细胞用H-胸苷脉冲处理6小时，然后采收并掺入确定的放射性。表示出来自一式三份样本的平均CPM和标准偏差。
图10、A).来自对照小鼠#10的正常肠系膜淋巴结，显示了该淋巴结的皮质、副皮质和髓质。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。B).来自有显著的滤泡增生(FH)、副皮质扩张和髓索增生(MH)的WXll小鼠#40的显著增大的肠系膜淋巴结。H&E，40x。C).来自对照小鼠#10的肠系膜淋巴结的髓索(MC)和髓窦(MS)的闭合。注意主要由与带有肉样巨噬细胞的髓窦相邻的小淋巴细胞组成的小髓索。H&E，400x。D).来自WXll小鼠#40的肠系膜淋巴结的髓索(MC)和髓窦(MS)的闭合。注意由大量带有偶然拉塞尔小体细胞(箭头)的血浆细胞组成的显著变厚的髓索。H&E，400x。E).来自对照小鼠#10的正常的脾，显示了带有小动脉周淋巴鞘(PALS)的红髓和白髓区域，100x。插图带有小淋巴细胞、巨噬细胞和偶然血浆细胞的围绕白髓的边缘区的闭合，400x。F).来自WXll小鼠#6的脾，带有增大的白髓区域，包括PALS和滤泡(箭头)，100x。插图带有大量血浆细胞和偶然拉塞尔小体的边缘区的闭合，400x。G).来自对照小鼠#25的带有派伊尔结的回肠，有由两个次级滤泡侧面相接形成的滤泡间区(箭头)，40x。H).来自WXll小鼠#32的带有派伊尔结的回肠，有具有明显生发中心和滤泡间组织(箭头)的显著增大的滤泡，40x。
图11、A).来自对照小鼠#5的正常肠系膜淋巴结，显示了该淋巴结的皮质、副皮质和髓质。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。B).来自有显著的滤泡增生(顶部外皮质中的次级滤泡行)、副皮质扩张(中间)和髓索增生(底部)的WXll小鼠#33的显著增大的肠系膜淋巴结。H&E，40x。C).来自带有抗B220抗体(B细胞标志)的对照小鼠#10的肠系膜淋巴结的免疫组织化学染色。注意强烈(褐色)染色的皮质区和细小的髓索。免疫染色使用抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)免疫过氧化物酶法进行(DAB色原，苏木精复染剂)，40x。D).来自带有抗B220抗体的WXll小鼠#33的肠系膜淋巴结的免疫组织化学染色。注意强烈染色的皮质滤泡和髓索(尽管髓索中的成熟血浆细胞对B220是阴性的)，40x。E).来自带有抗CD3抗体(T细胞标志)的对照小鼠#10的淋巴结的免疫组织化学染色。注意该淋巴结的副皮质区的免疫染色，40x。F).来自带有抗CD3抗体的WXll小鼠#33的淋巴结的免疫组织化学染色。注意该淋巴结的增大的、强烈染色的副皮质区，40x。
图12、A).编码人B7RP1(hB7RP1)区的蛋白质的结构和序列。hB7RP1的预测信号序列在氨基端加了下划线。预测的信号肽切割位点用星号标记。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).推定的成熟hB7RP1蛋白质与成熟的鼠B7RP1(mB7RP1)蛋白质的氨基酸序列对比。
图13、A).编码人CRP1(hCRP1)区的蛋白质的结构和序列。hCRP1的预测信号序列在氨基端加了下划线。预测信号肽切割位点用星号标记。预测的跨膜序列向羧基端加了下划线。B).hCRP1蛋白质与鼠CRP1(mCRP1)蛋白质的氨基酸序列对比。
图14、CRP-1在静息记忆细胞上。来自6-7月龄小鼠的静息脾细胞使用由FITC缀合抗人Fc抗体和CD44(图14A)、CD45RB(图14B)或CD69(图14C)的PE缀合抗体标记的B7RP-1-Fc进行二重染色。
图15、经由B7RP-1-Fc融合蛋白的T细胞共同刺激。A).由不同数量的B7RP-1-Fc(密实正方形)、B7.2-Fc(密实圆圈)或OPG-Fc融合蛋白对照(空心正方形)与抗CD3抗体联合诱导的T细胞增殖。融合蛋白以不同浓度用于涂敷预先用抗人Fc FAb2(12.5μg/ml)和抗CD3抗体(0.9μg/ml)涂敷的96孔平板。B7RP-1-Fc和B7.2-Fc以剂量依赖方式共同刺激T细胞不超过0.3μg/ml，此时达到最大效应。B).由B7RP-1-Fc(密实正方形)、B7.2-Fc(密实圆圈)、非融合Fc(空心正方形)或无Fc(空心圆圈)与抗CD3抗体(0.85μg/ml)联合并在不同浓度的兔抗B7RP-1-Fc多克隆抗体的存在下诱导的T细胞增殖。Fc融合蛋白以0.3μg/ml的浓度使用并如上所述结合到平板上。通过皮下注射在佐剂中乳化的抗原提出针对纯化B7RP-1-Fc的抗B7RP-1-Fc抗体，然后进行亲和纯化。抗体加入细胞之前用Fc融合蛋白温育30分钟。抗B7RP-1-Fc抗体以剂量依赖方式特异性抑制由B7RP-1-Fc诱导的T细胞增殖。
图16、CRP-1-Fc和B7RP-1-Fc蛋白质对小鼠的胶原诱导关节炎的发生率(A)和严重程度(B)的影响。易受胶原诱导关节炎影响的B10.RIII小鼠在尾巴的根部用存在于CFA中的10μg猪II型胶原免疫接种。小鼠接受100μg融合蛋白，每周两次。Fc融合蛋白和对照PBS治疗显示在图例中。
图17、B7RP-1-Fc转基因小鼠的近侧结肠。(A).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常近侧结肠，显示了带有粘膜、粘膜下层、肌层和浆膜的肠壁。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。(B).来自有显著的腺肥大、裂隙溃疡和透壁炎症的B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F的弥漫增厚的近侧结肠。H&E，40x。(C).来自有多灶性裂隙溃疡和透壁炎症的B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F的近侧结肠的下部动力图(如面板B中所示)。H&E，20x。(D).来自B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F的裂隙溃疡和肥大性结肠腺的闭合(显示在上面的面板B和C中)。注意有粘液脓性渗出物的腔。H&E，100x。(E).具有被巨噬细胞、淋巴细胞和少数嗜中性白细胞围绕的多核巨细胞的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的粘膜下层中的肉芽肿性炎症的闭合。H&E，400x。(F).具有位于粘膜腺下方的与淋巴细胞、血浆细胞和少数嗜中性白细胞混合的上皮样巨噬细胞的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的粘膜中的肉芽肿性炎症的闭合。H&E，400x。
图18、B7RP-1-Fc转基因小鼠的远侧结肠。(A).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常远侧结肠，显示了带有粘膜、粘膜下层、肌层和浆膜的肠壁各层。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。(B).来自有显著的腺肥大和增生和散在滤泡脓肿的B7RP-1-Fc转基因小鼠#111F(雌性)的弥漫增厚的远侧结肠。H&E，40x。(C).来自有显著的腺肥大和增生的B7RP-1-Fc转基因小鼠#55M(雄性)的弥漫增厚的远侧结肠。H&E，40x。(D).来自有肥大性结肠腺、局灶性淋巴样聚集物和许多滤泡脓肿的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F(雌性)的弥漫增厚的远侧结肠。H&E，40x。(E).来自带有抗CD3抗体(T细胞标志)的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的远侧结肠的免疫组织化学染色。注意浅表粘膜和结肠淋巴组织斑的免疫染色。H&E，40x。(F).具有滤泡脓肿(箭头)和由B220+B细胞组成的淋巴样聚集物(插图)的B7RP-1-Fc转基因小鼠#112F的结肠粘膜的闭合。H&E，100x。
图19、B7RP-1-Fc转基因小鼠的小肠。(A).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常十二指肠，显示了腔、绒毛和粘膜的滤泡以及下面的粘膜下层、肌层和浆膜。苏木精-曙红(H&E)染剂，40x放大率。(B).来自有显著的滤泡肥大和增生和固有层中轻度淋巴浆细胞浸润的B7RP-1-Fc转基因小鼠#51F(雌性)的弥漫增厚的十二指肠。H&E，40x。(C).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常空肠，显示了空肠粘膜中正常长度的绒毛和滤泡。H&E，40x放大率。(D).来自有局部广延的滤泡肥大和增生的B7RP-1-Fc转基因小鼠#51F(雌性)的显著增厚的空肠粘膜。H&E，40x。(E).来自对照小鼠#53F(雌性)的正常回肠，显示了回肠粘膜中正常长度的绒毛和滤泡。H&E，40x放大率。(F).来自绒毛局灶性损失和钝化的B7RP-1-Fc转基因小鼠#231M(雄性)的回肠粘膜的轻度萎缩。H&E，40x。
图20、B7RP-1-Fc融合蛋白抑制了小鼠体内的肿瘤生长。将Meth A肉瘤细胞真皮内植入到Balb/C小鼠的腹部。在植入后的第7、10、14和17天时，小鼠用载体(深色菱形)或鼠B7RP-1-Fc(灰色三角形，实施例7)治疗。如实施例20中所述，在指示的植入的那些天中测量肿瘤的体积。监测肿瘤的生长直到第28天。每组有8只小鼠。
图21、经由人B7RP-1-Fc的T细胞共同刺激。用抗CD3和人B7RP-1Fc涂敷96孔平板，并如实施例21中所述培养和收获1×105T细胞/孔(＞98％CD3+)。A).在不同浓度的抗CD3初始刺激下由单独的抗CD3(密实圆圈)、0.5μg/ml B7RP-1Fc(密实三角形)、0.5μg/ml OPG-Fc(空心圆圈)和5μg/ml抗CD28(空心三角形)诱导的共同刺激。数据显示，B7RP-1-Fc将抗CD3致敏T细胞共同刺激到了与使用抗CD28抗体共同刺激所达到的类似水平。所显示的数据是来自用从三个正常供体分离的T细胞产生的若干实验中的一个典型实验的一式三份孔中的掺入[3H]TdR均值+/-SD。B).经由CRP-1-Fc对B7RP-1-Fc共同刺激的剂量依赖性抑制。T细胞在用0.3μg/ml的抗CD3和0.5μg/ml的B7RP-1-Fc涂敷的孔中培养。连续稀释浓度的CRP-1-Fc(密实圆圈)或OPG-Fc(空心圆圈)在加入T细胞之前用B7RP-1-Fc预温育30分钟。数据显示，CRP-1-Fc以剂量依赖性方式抑制了B7RP-1诱导的共同刺激。以抑制百分数对CRP-1-Fc或OPG-Fc蛋白质浓度作图。所显示的数据是在一式三份孔中完成的三个实验的掺入[3H]TdR均值+/-SD，并且是用两个正常供体产生的实验的典型。C).经由CHO人B7RP-1细胞的共同刺激。T细胞从外周血液中纯化，并在单独的抗CD3(密实圆圈)、1×104CHO载体对照细胞(空心圆圈)或1×104CHO B7RP-1细胞(密实三角形)的存在下用不同浓度的抗CD3培养，如实施例22中所述。数据显示，膜结合B7RP-1共同刺激T细胞的生长到了与使用B7RP-1-Fc融合蛋白观察到的类似水平。所显示的数据是一式三份培养物的均值+/-SD，并且是用两个正常供体产生的结果的典型代表。D).细胞因子产生。如(图21A)中所述培养T细胞，在48小时(黑条)和72小时(灰条)时收集上清液。数据表明，由B7RP-1-Fc共同刺激细胞产生的IL-2的量(上图)与由用抗CD3和对照Fc刺激的细胞产生的量类似，但显著低于由抗CD28共同刺激细胞产生的量。数据还表明，B7RP-1-Fc共同刺激增强了IL-10(中图)和IFN-γ(下图)的产生。
发明的详细描述本发明提供了在本文中称之为CRP1和B7RP1的新颖多肽，它们包含与T细胞活化有关的受体-配体对。从用小鼠肠上皮内细胞制备的文库鉴别出编码这些多肽的cDNA并在与CD28和CTLA-4多肽(关于CRP1)或B7.1和B7.2多肽(关于B7RP1)的同源性的基础上进行筛选。
CD28相关蛋白质-1或CRP1，据预测是带有位于氨基端的信号序列和胞外域、跨膜结构域和羧基端胞内域的I型跨膜蛋白(图1)。全长CRP1蛋白质的成熟形式为180个氨基酸。预测前导序列大约跨越氨基酸残基1-20(相对于起始甲硫氨酸)，该成熟蛋白质的胞外域大约包括残基21-145(实施例1)。预测的跨膜结构域大约跨越残基146-163，胞内域包括大约残基164-200。氨基端胞外域与具有保守推定分子内和分子间键合半胱氨酸的Ig环类似。另外，先前已知对于B7.1和B7.2与CD28和CTLA-4的结合非常重要的“MYPPPY”基元也是部分保守的。
CD28和CTLA-4是弱同源性的，例如鼠CD28和CTLA-4之间有26％氨基酸相同。CRP1与鼠CD28有19％氨基酸相同，CRP1与鼠CTLA-4有14％相同。但是，鼠CD28、CTLA-4和CRP1之间的决定性半胱氨酸残基保存在残基42、63、83、109和137处(相对于CRP1蛋白质中的起始甲硫氨酸，参见图1A)。在CRP1、CD28和CTLA-4中，近似成熟蛋白质长度和相对于羧基端的跨膜区的位置也类似。
人CRP1是具有图13A中所示核苷酸和氨基酸序列的跨膜蛋白质。预测的前导序列大约跨越残基1-19或约残基1-20。预测的成熟氨基端在残基20或21处。优选地，成熟氨基端在21位。胞外域从任何一个预测成熟氨基端跨越到约氨基酸残基140，跨膜结构域跨越约残基141-161，而胞内域跨越约残基162-199。人CRP1蛋白质与鼠蛋白质有69％相同，相应的核苷酸序列为77％相同。人CRP1的序列报道于Hutloff等，Nature(自然)397，263-266(1999)。
B7相关蛋白质-1或B7RP1，据预测是带有位于氨基端的信号序列和胞外域、跨膜结构域和羧基端胞内域的I型跨膜蛋白质(图2A)。全长B7RP1蛋白质的成熟形式为276个氨基酸。预测前导序列大约跨越氨基酸残基1-46(相对于起始甲硫氨酸)，成熟蛋白质的胞外域大约包括残基47-279(实施例3)。预测的跨膜结构域大约跨越残基280-298，胞内域包括残基299-322。与B7.1和B7.2类似，B7RP1的胞外域包含两个Ig环。
B7.1和B7.2是弱同源性的，例如鼠B7.1和B7.2之间有24％氨基酸相同。B7RP1与鼠B7.1有20％氨基酸相同，B7RP1与鼠B7.2有19％相同。但是，鼠B7.1、B7.2和B7RP1之间的决定性半胱氨酸残基保存在残基62、138、185和242处(相对于B7RP1蛋白质中的起始甲硫氨酸，参见图2A)。在mB7RP1、B7.1和B7.2中，近似成熟蛋白质长度和相对于羧基端的跨膜区的位置也类似。
人B7RP1也是具有Ig环结构所必需的在胞外域中的保守半胱氨酸残基的跨膜蛋白质。预测前导序列包括如图3A中显示的约残基1-18、1-19、1-20、1-21、1-23或1-27。预测的成熟氨基端可以在残基19、20、21、22、24或28任何一处。优选氨基端在19位。胞外域从任何一个成熟氨基端跨越到约氨基酸残基259。预测跨膜结构域跨越约残基259-274。胞内域包括残基275-302。全长人B7RP1核苷酸和氨基酸序列显示在图12A中。人B7RP1与鼠蛋白质约43％相同。
CRP1和B7RP1彼此结合，但CRP1不可检测地与B7RP1相关蛋白B7.2结合；B7RP1没有显示可检测地与CRP1相关CD28或CTLA-4结合(实施例8)。B7RP1显示调节了T细胞增殖，推测是通过B7RP1与CRP1受体的相互作用(实施例11)。因此，CRP1和B7RP1代表了调节T细胞增殖和活化的新颖路径。
B7RP1与CRP1的相互作用可以用免疫共同刺激和T细胞增殖和活化能增加或减少这样的方式来调节。作为实例，针对鼠B7RP1培养的抗B7RP1单克隆和多克隆抗体阻断了B7RP1/CRP1相互作用，也阻断了由B7RP1-Fc融合蛋白诱导的T细胞增殖(参见实施例17)。人CRP-1-Fc融合蛋白阻断了由人B7RP-1-Fc诱导的人T细胞增殖(实施例21)。此外，加入CRP1-Fc融合蛋白延迟了类风湿性关节炎小鼠模型的关节炎症状的发作(参见实施例18)。B7RP-1/CRP-1共同刺激也可通过加入B7RP-1-Fc融合蛋白或此路径的其他激活剂来增加(实施例20)。
核酸分子术语“分离核酸分子”是指没有至少一个天然相联的污染核酸分子的核酸分子，优选实质没有任何其他污染哺乳动物核酸分子。
术语“等位变体”是指占据生物体染色体上所给出部位的基因的若干可能的天然产备择形式之一。
术语“剪接变体”是指由RNA转录物中内含子序列的可变加工产生的核酸分子，通常是RNA。
术语“高严格条件”指的条件是(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如，O.1 X SSC(0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠)0.1％NaDodSO4(SDS)，50℃下，或者(2)在杂交过程中采用变性剂诸如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺加上0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸钠缓冲剂加上5XSSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，在42℃下。高严格条件的另一个例子是50％甲酰胺，5 x SSC，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt溶液，超声处理过的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％葡聚糖硫酸脂，在42℃下，并在42℃下用0.2 x SSC和0.1％SDS洗涤。
术语“中等严格条件”所指的条件包括使用比上述条件严格性低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度和离子强度)。中等严格条件的例子是诸如下述条件在包含20％甲酰胺、5 x SSC、50mM磷酸钠(pH7.6)、5 xDenhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μl/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中在37℃下温育过夜，接着在约37-50℃下用1 x SSC洗涤滤器。熟练技术人员将根据需要确定怎样调节温度、离子强度和其他参数以适应诸如探针长度等因素。
重组DNA技术方法列于Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989))和/或Ausubel等编写的(分子生物学中的流行方案，Green Publishers Inc.和Wiley&Sons，NY(1994))，它们都整个结合在此作为参考。
本发明提供了编码CRP1和B7RP1多肽的分离核酸分子。还提供了是片段、等位变体、剪接变体或者序列与编码CRP1和B7RP1多肽的分子互补的核酸分子。还包括与编码CRP1或B7RP1的分子至少约70％相同或者在中等或高严格条件下与编码CRP1或B7RP1的分子杂交的核酸分子。这些核酸分子可以是cDNA、基因组DNA、RNA或部分或完全合成的核酸分子。在优选的实施方案中，本发明的核酸分子与编码CRP1或B7RP1的核酸分子至少约75％、80％、85％、90％或95％相同。
编码CRP1或B7RP1多肽的基因或cDNA或其片段可以得到，例如通过基因组或cDNA文库的杂交筛分或PCR扩增。用于筛分该文库的探针或引物可以在来自相同或相关基因族的其他已知基因或基因片段的序列信息的基础上产生，例如在CRP1或B7RP1相关多肽中发现的保守基元诸如半胱氨酸残基的保守阵列。另外，已从一种物质中鉴别出编码CRP1或B7RP1多肽的基因时，该基因的全部或部分可以用作探针来从其他种物质鉴别同源基因。探针或引物可以用于从据信表达CRP1或B7RP1基因的不同组织来源筛分cDNA文库。
当寡核苷酸探针用于筛分cDNA或基因组文库时，可以使用下列两种高严格溶液之一。第一种是6 X SSC加上0.05％焦磷酸钠，在35℃-62℃下，温度取决于寡核苷酸探针的长度。例如，14个碱基对的探针在35-40℃下洗涤，17个碱基对的探针在45-50℃下洗涤，20个碱基对的探针在52-57℃下洗涤，而23个碱基对的探针在57-63℃下洗涤。当背景非特异性结合显得高时，可以将温度升高2-3℃。第二种高严格溶液利用氯化四甲铵(TMAC)来洗涤寡核苷酸探针。一种严格洗涤溶液是3MTMAC、50mM Tris-HCl，pH8.0和0.2％SDS。使用该溶液时的洗涤温度是探针长度的函数。例如，17个碱基对的探针在约45-50℃下洗涤。
另一种制备编码CRP1或B7RP1多肽的基因或其片段的方式是使用熟练技术人员熟知的方法进行化学合成，诸如Engels等(Agnew.Chem.Intl.Ed.，28716-734(1989))描述的方法。这些方法包括，尤其是用于核酸合成的磷酸三酯法、亚磷酰胺法和H-膦酸酯法。用于这种化学合成的优选方法是使用标准亚磷酰胺化学的聚合物支持合成。一般说来，编码CRP1或B7RP1多肽的DNA将有数百个核苷酸长。长于约100个核苷酸的核酸可以使用这些方法合成为若干个片段。这些片段然后可连接在一起形成全长CRP1或B7RP1多肽。通常，编码多肽氨基端的DNA片段将具有编码甲硫氨酸残基的ATG。该甲硫氨酸可以或不可以呈递在CRP1或B7RP1多肽的成熟形式上，这取决于宿主细胞中产生的多肽是否是计划从该细胞中分泌的。
编码生物活性多肽的CRP1或B7RP1核酸分子、片段和/或不是它们自己的衍生物仍然可以在诊断性测定中用作杂交探针来定性或定量检验哺乳动物组织或体液样品中CRP1或B7RP1 DNA或相应RNA的存在。
在一些情况下，可能希望制备天然产CRP1或B7RP1多肽的核酸和/或氨基酸变体。当引物具有所需点突变时，核酸变体可以使用定点诱变、PCR扩增或其他合适的方法生产(参见Sambrook等，同上，和Ausubel等，同上，有关诱变技术的描述)。使用Engels等(同上)描述的方法的化学合成也可以用于制备这类变体。也可以使用熟练技术人员已知的其他方法。
优选的核酸变体包括含有已为所给宿主细胞中CRP1和B7RP1多肽的最佳表达改变的密码子的那些。特定密码子变化将取决于蛋白质和宿主细胞的选择。在一种情况下，这种“密码子优化”可以通过选择在所给宿主细胞中优选用于高度表达基因的密码子来进行。可以使用有关高度表达的细菌基因的优选密码子的加入密码子频率表诸如“Ecohigh.Cod”的计算机算法，其由威斯康星大学Package 9.0版，Genetics Computer Group，Madison，WI提供。其他有用的密码子频率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。其他优选的变体是编码如下所述(例如，其中天然产氨基酸侧链的电荷或极性通过用不同氨基酸置换没有实质改变)与野生型相比保守氨基酸变化的那些，和/或计划产生新的糖基化和/或磷酸化位点的那些，或计划删除现有糖基化和/或磷酸化位点的那些。
编码CRP1或B7RP1多肽的基因、cDNA或其片段可以使用标准连接技术插入合适的表达或扩增载体中。一般选择在所用的特定宿主细胞中是功能性的载体(即，该载体与宿主细胞机构是相容的，以便可以发生基因的扩增和/或基因的表达)。编码CRP1或B7RP1多肽的基因、cDNA或其片段可以在原核细胞、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。宿主细胞的选择将部分取决于CRP1或B7RP1多肽或其片段是否将被糖基化和/或磷酸化。如果是，则优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。
一般，在任何一个宿主细胞中所用的表达载体将含有用于质粒保持和克隆和插入核苷酸序列的表达的序列。这类序列统称为“侧翼序列”，将包括启动子和其他调节元件诸如增强子、复制元件起点、转录终止元件、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、信号肽序列、核糖体结合位点元件、聚腺苷酸化序列、用于插入编码要表达的多肽的核酸的多接头区和选择性标记元件。这些元件中的每一个将在下面进行讨论。可选地，该载体可以含有“尾端”序列，即，位于CRP1或B7RP1多肽编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸分子编码聚组氨酸(诸如六组氨酸)或其他“尾端”诸如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc，有可从商业上获得的它们的抗体。这种尾端一般随着多肽的表达而融合到多肽上，并且可以充当从宿主细胞亲和纯化CRP1或B7RP1多肽的方式。例如，亲和纯化可以通过柱色谱法使用针对尾端亲和基质的抗体完成。可选地，该尾端随后可以通过各种方式诸如使用某些肽酶从纯CRP1或B7RP1多肽上除去。
人免疫球蛋白铰链和Fc区可以由本领域中的技术人员融合到CRP1或B7RP1多肽的N端或C端。随后该Fc融合蛋白可以通过使用A蛋白亲和柱纯化。已知免疫珠蛋白Fc区显示出长的体内药动学半衰期，且融合到Fc区的蛋白质已发现显示出比未融合的相应物实质更长的体内半衰期。而且，融合到Fc区允许分子二聚和/或多聚合，这对于某些分子的生物活性是有用的。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)，异源的(即，来自宿主细胞物种或菌株以外的物种)，杂交体(即，来自一个以上来源的侧翼序列的组合物)，合成的，或者它可以是天然CRP1或B7RP1核酸侧翼序列。如此，侧翼序列的来源可以是任何单细胞的原核或真核生物、任何有脊椎或无脊椎生物、或者任何植物，条件是该侧翼序列在宿主细胞机构中是功能性的，并且可以被其激活。
用于本发明载体中的侧翼序列可以通过本领域中公知的若干方法中的任何一种得到。一般，在此处有用的、除了CRP1或B7RP1核酸侧翼序列以外的侧翼序列将通过作图和/或通过限制内切酶消化事先鉴别出来，并且因此可从适当的组织来源使用合适的限制内切酶分离出来。在有些情况下，侧翼序列的全核苷酸序列可以是已知的。此时，该侧翼序列可以使用上面所描述的核酸合成或克隆方法进行合成。
若侧翼序列的所有或只有一部分是已知的，它可以使用PCR和/或通过筛选带有来自相同或其他物种的合适的寡核苷酸和/或侧翼序列片段的基因组文库而得到。
若侧翼序列是未知的，含有侧翼序列的DNA片段可以从可能含有例如编码序列或者甚至是另一种或另一些基因的大量DNA中分离。分离可以通过限制内切酶消化使用一种或多种仔细选择的酶来分离适当的DNA片段而完成。消化后，所需片段可以通过琼脂糖凝胶纯化、Qiagen?柱或熟练技术人员已知的其他方法进行分离。用于实现此目的的合适的酶的选择对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
复制元件起点一般是商业上购得的原核表达载体的一部分，并且有助于宿主细胞中载体的扩增。在有些情况下，载体扩增到一定的拷贝数对于CRP1或B7RP1多肽的最佳表达是重要的。如果选定的载体不含复制起点，可以在已知序列的基础上化学合成一个，并将其连接到载体中。
转录终止元件一般位于CRP1或B7RP1多肽编码序列的3′端，并起终止CRP1或B7RP1多肽转录的作用。通常，原核细胞中的转录终止元件是接着多T序列的富含G-C的片段。虽然该元件容易从文库中克隆或者甚至作为部分载体从商业上购得，但它也可使用核酸合成方法诸如上面描述的那些容易地合成。
选择性标记基因元件编码在选择培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。一般选择标记基因编码这样的蛋白质(a)为原核宿主细胞提供对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素等的抗性的，(b)补充细胞的营养缺陷的；或者(c)提供不能从复合培养基中获得的必要营养素的。优选的选择性标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
核糖体结合元件，常叫做SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)，通常是mRNA的翻译起始所必需的。该元件一般位于启动子的3′和要合成的CRP1或B7RP1多肽的编码序列的5′端。SD序列是不同的，但一般是多嘌呤(即，具有高A-G含量)。已经鉴别出许多SD序列，每个都可使用上面列出的和在原核载体中使用的方法容易地合成。
在希望从宿主细胞分泌CRP1或B7RP1多肽的情况下，可以用信号序列指导多肽从宿主细胞的输出。CRP1或B7RP1跨膜结构域也通过突变或缺失而灭活，以防止对宿主膜的附着。一般说来，信号序列位于CRP1或B7RP1基因或cDNA的编码区，或正好位于CRP1或B7RP1基因编码区的5′端。已鉴别出许多信号序列，它们中在选定的宿主细胞中具功能性的任何一个可以用于结合CRP1或B7RP1基因或cDNA。因此，信号序列可以是与CRP1或B7RP1基因或cDNA同源或异源的，并且可以是与CRP1或B7RP1多肽基因或cDNA同源或异源的。此外，信号序列可以使用上面描述的方法化学合成。
在大多数情况下，多肽经由信号肽的存在从宿主细胞分泌将导致氨基端甲硫氨酸从该多肽去除。
在许多情况下，CRP1或B7RP1基因或cDNA的转录通过载体中一个或多个内含子的存在而增加；当CRP1或B7RP1多肽在真核宿主细胞、特别是哺乳动物宿主细胞中产生时尤其是这样。所用的内含子可以是天然产生于CRP1或B7RP1基因中的，尤其当所用的基因是全长基因组序列或其片段时。若内含子不是天然产生于基因中的(就大多数cDNA来说)，则内含子可以从另外的来源得到。内含子关于5′侧翼序列和CRP1或B7RP1基因的位置通常是重要的，因此内含子必须被有效地转录。如此，当插入表达载体中的CRP1或B7RP1基因是cDNA分子时，内含子的优选位置是转录起始部位的3′端和聚腺苷酸转录终止序列的5′端。最好内含子将位于cDNA的一侧或另一侧(即，5′或3′)，以便它不会中断此编码序列。来自任何来源包括任何病毒、原核生物和真核生物(植物或动物)的任何内含子都可用于实施本发明，只要其与要插入的宿主细胞相容。此处还包括合成内含子。可选地，载体中可以使用一个以上内含子。
当要使用的载体中不存在上面列出的一个或多个元件时，可以单独得到它们并连接到载体中。用于得到每个元件的方法是熟练技术人员熟知的。
优选的用于实施本发明的载体是与细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的那些。这类载体包括，特别是pCRII、pCR3和pcDNA3.1(InvitrogenCompany，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene Company，La Jolla，CA)，pET15b(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBacII；Invitrogen)，和pFastBacDual(Gibco/BRL，Grand Island，NY)。
当载体已构建成且编码全长或截短的CRP1或B7RP1多肽的核酸分子已插入到该载体的适当部位后，完成的载体可以插入到合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)或者是真核宿主细胞(诸如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。宿主细胞当在合适的条件下培养时可以合成CRP1或B7RP1多肽，它们随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将它们分泌到培养基中)，或者直接从生成它们的宿主细胞收集(如果它们未被分泌)。收集后，CRP1或B7RP1多肽可以使用诸如分子筛色谱法、亲和色谱法等方法纯化。
用于CRP1或B7RP1多肽生产的合适的宿主细胞的选择将取决于多种因素，诸如所需的表达水平，活性所需的多肽修饰诸如糖基化或磷酸化，或容易折叠到生物活性分子中。
合适的细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾(HEK)293或293T细胞、或3T3细胞。合适的哺乳动物宿主细胞和转化、培养、扩增、筛选以及产物生成和纯化的方法的选择是本领域中已知的。其他合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1和COS-7细胞系，以及CV-1细胞系。其他例举性的哺乳动物宿主细胞包括灵长目动物细胞系和啮齿动物细胞系，包括转化细胞系。正常的二倍体细胞、从原始组织的体外培养得到的细胞株、以及初级外植体也是合适的。候选细胞可以是选择基因基因型缺损的，或者可以含有显性开放选择基因。其他合适的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞，HeLa，小鼠L-929细胞，来自瑞士Balb-c或NIH小鼠的3T3细胞系，BHK或HaK仓鼠细胞系。
类似地用作宿主细胞的是细菌细胞。例如，大肠杆菌的不同菌株(例如HB101，DH5a，DH10和MC1061)在生物技术领域中是众所周知的宿主细胞。枯草芽胞杆菌、假单胞杆菌、其他芽胞杆菌、链霉菌等的不同菌株也可以用于此方法。
本领域技术人员已知的许多酵母细胞株也可以作为宿主细胞用于本发明多肽的表达。
另外，需要时，在本发明方法中可以利用昆虫细胞系统。这类系统记载于例如Kitts等(Biotechniques(生物技术)14810-817(1993))，Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.(病毒学杂志)674566-4579(1993))。优选的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
表达载体“转化”或“转染”到选定的宿主细胞中可以使用象氯化钙、电穿孔、微注射、脂质转染或DEAE-葡聚糖法等这样的方法完成。所选的方法将部分是要使用的宿主细胞类型的函数。这些方法以及其他合适的方法是熟练技术人员熟知的，并且记载于例如Sambrook等(同上)中。
用表达载体转化或转染的宿主细胞可以使用熟练技术人员熟知的标准培养基培养。培养基通常将含有细胞生长和存活所必需的所有营养素。合适的用于培养大肠杆菌细胞的培养基是例如Luria肉汤(LB)和/或Terrific肉汤(TB)。合适的用于培养真核细胞的培养基是RPMI 1640，MEM，DMEM，它们所有都可以根据所培养的特定细胞系的需要添加血清和/或生长因子。合适的用于昆虫培养的培养基是根据需要添加了yeastolate、水解乳白蛋白和/或胎牛血清的Grace培养基。
通常，只用于转化细胞的选择性生长的抗生素或其他化合物作为补充物加入培养基中。要使用的化合物将取决于转化宿主细胞的质粒上存在的选择性标记元件。例如，若选择性标记元件是卡那霉素抗性的，则加入到培养基中的化合物将是卡那霉素。
宿主细胞中产生的CRP1或B7RP1多肽的量可以使用本领域中已知的标准方法来评估。这类方法包括但不限于蛋白质印迹分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，非变性凝胶电泳，HPLC分离，免疫沉淀，和/或活性分析诸如DNA结合凝胶移动试验。
如果CRP1或B7RP1多肽已计划从宿主细胞分泌，则大多数多肽可以在细胞培养基中找到。以这种方式制备的多肽一般将不具有氨基端甲硫氨酸，因为它在从细胞分泌的过程中被除去了。不过，如果CRP1或B7RP1多肽没有从宿主细胞分泌，它将存在于细胞质和/或核中(对于真核宿主细胞)或存在于胞质溶胶中(对于革兰氏阴性菌宿主细胞)，并且可以有氨基端甲硫氨酸。
CRP1或B7RP1多肽从溶液的纯化可以使用各种技术完成。如果多肽已被合成使得它含有位于其羧基端或氨基端的尾端诸如六组氨酸(CRP1或B7RP1/hexaHis)或其他小肽诸如FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或myc(Invitrogen，Carlsbad，CA)，则它基本上可以通过使加尾的多肽通过亲和柱而以一步操作纯化，其中柱基质对尾端或直接对该多肽具有高亲和力(即，特异性识别CRP1或B7RP1多肽的单克隆抗体)。例如，聚组氨酸结合对镍的主要亲和力和特异性，因此镍的亲和柱(诸如Qiagen?镍柱)可以用于CRP1或B7RP1/polyHis的纯化(参见例如，Ausubel等编写的《分子生物学中的流行方案》第10.11.8节，John Wiley&Sons，New York(1993))。
当制备的CRP1或B7RP1多肽没有尾端附着时，且没有可利用的抗体时，可以使用其他众所周知的纯化方法。这类方法包括但不限于离子交换色谱法，分子筛色谱法，HPLC，非变性凝胶电泳结合凝胶洗脱，和制备等电聚焦(“Isoprime”机器/技术，Hoefer Scientific)。在有些情况下，可以结合使用这些技术中的两种或多种来提高纯度。
如果预期CRP1或B7RP1多肽将主要在细胞内发现，则胞内物质(包括革兰氏阴性菌的包涵体)可以使用熟练技术人员已知的任何标准技术从宿主细胞中提取出来。例如，宿主细胞可以通过弗氏压碎器、匀化和/或超声处理后离心而裂解，以释放出周质/细胞质的内含物。
如果CRP1或B7RP1多肽已在胞质溶胶中形成包涵体，则该包涵体经常可结合到内和/或外细胞膜上并由此在离心后将主要在颗粒物质中发现。该颗粒物质然后可在pH极值下处理或在还原剂诸如二硫苏糖醇的存在下在碱性pH下或在三羧乙基膦的存在下在酸性pH下用离液剂诸如去污剂、胍、胍衍生物、脲或脲衍生物处理，以释放、破碎和溶解包涵体。现在为可溶形式的多肽然后可使用凝胶电泳、免疫沉淀等进行分析。如果希望分离CRP1或B7RP1多肽，分离可以使用标准方法完成，诸如下面列出的那些和记载于Marston等(Meth.Enz.(酶学方法学)182264-275(1990))中的。在有些情况下，CRP1或B7RP1多肽分离后可能不是生物活性的。用于将多肽“重折叠”或转变为其三级结构并生成二硫键的各种方法可以用于还原生物活性。这类方法包括使溶解多肽在特定浓度的适宜离液剂的存在下与pH通常在7以上的溶液接触。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将含有还原剂或特定比例的还原剂和相应的氧化形式，以产生特定的氧化还原电位，使得在蛋白质的半胱氨酸桥的形成中发生二硫化物穿梭。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽(GSH)/二硫基双GSH，氯化铜，二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT，2-巯基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。在许多情况下，需要共溶剂来增加重折叠的效率，用于此目的的更多普通试剂包括甘油、不同分子量的聚乙二醇、和精氨酸。
CRP1或B7RP1多肽、其片段和/或衍生物也可以通过化学合成法(诸如固相肽合成)制备，可使用本领域中已知的技术诸如下列文献中记载的那些Merrifield等(J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)852149(1963))，Houghten等，(Proc Natl Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)825132(1985))和Stewart & Young(Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984))。合成的这些多肽的氨基端上可以有或没有甲硫氨酸。化学合成的CRP1或B7RP1多肽或片段可以使用这些参考文献中记载的方法进行氧化，以形成二硫键。CRP1或B7RP1多肽或片段预期具有可比得上重组产生的或从天然来源纯化的CRP1或B7RP1多肽的生物活性，并因此可以与重组或天然CRP1或B7RP1多肽互换使用。
多肽术语“CRP1或B7RP1多肽”指的是具有图1A(SEQ ID NO2)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)所示的氨基酸序列的多肽以及本文中描述的所有相关多肽。相关多肽包括等位变体、剪接变体、片段、衍生物、置换、缺失和插入变体、融合多肽、和直向同源物。这些相关多肽可以是成熟多肽，即，缺乏信号肽的多肽。CRP1或B7RP1多肽可以有或没有氨基端甲硫氨酸，这取决于它们的制备方式。
术语“CRP1或B7RP1多肽片段”指的是小于图1A(SEQ ID NO2)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)中列出的CRP1或B7RP1多肽的全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以来自于在氨基端的截短、在羧基端的截短和/或多肽序列内部的缺失。制备的这种CRP1或B7RP1多肽片段可以有或没有氨基端甲硫氨酸。此外，CRP1或B7RP1多肽片段可以是天然产剪接变体、其他剪接变体和由天然产体内蛋白酶活性产生的片段。优选的CRP1或B7RP1多肽片段包括可溶形式的CRP1或B7RP1，其缺乏功能性跨膜结构域并包含CRP1或B7RP1的部分或全部胞外域。
术语“CRP1或B7RP1多肽变体”指的是其氨基酸序列与图1A(SEQID NO2)、图2A(SEQ ID NO7)或图3A(SEQ ID NO12)中列出的CRP1或B7RP1多肽氨基酸序列相比含有一个或多个氨基酸序列置换、缺失和/或增加的CRP1或B7RP1多肽。这些CRP1或B7RP1多肽变体可以从相应的CRP1和B7RP1多肽核酸分子变体制备，它们具有因此与CRP1或B7RP1多肽的DNA序列不同的DNA序列。
本文中所用的术语“CRP1或B7RP1多肽衍生物”指的是已通过例如加入一个或多个水溶性聚合物、N-联或O-联糖类、糖、磷酸酯和/或其他这类分子进行了化学修饰的CRP1或B7RP1多肽、其变体或片段，其中这些分子不是天然附着到野生型CRP1或B7RP1多肽的。衍生物还包括天然附着到CRP1或B7RP1多肽的一个或多个化学基团的缺失。
本文中所用的术语“生物活性CRP1或B7RP1多肽”、“生物活性CRP1或B7RP1多肽片段”、“生物活性CRP1或B7RP1多肽变体”和“生物活性CRP1或B7RP1多肽衍生物”指的是具有至少一个CRP1或B7RP1的活性特征的CRP1或B7RP1多肽。一个活性是B7RP1对CRP1的结合。另一个活性是CRP1或B7RP1刺激T细胞增殖和/或活化的能力。
术语“直向同源物”指的是与从某物种鉴别的多肽相对应的多肽。例如，小鼠和人B7RP1多肽被认为是直向同源物。
术语“成熟氨基酸序列”指的是缺乏前导序列的多肽。
术语“分离多肽”是指在其天然环境中没有发现至少一个污染多肽的多肽，且最好基本上没有任何其他污染哺乳动物多肽。
如本领域中公知的，术语“相同”是两个或多个核酸分子或两个或多个多肽的序列之间的关系，是通过对比序列确定的。在本领域中，“相同”也意味着多肽或核酸分子序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过核苷酸或氨基酸序列串之间的比较确定。“相同”测量的是两个或多个序列之间同一匹配的百分数，通过特定计算机程序(即“算法”)进行间隙序列对比。
术语“相似性”是指相关概念，但与“相同”形成对照，相似性的量度包括相同匹配和保守置换匹配。由于保守置换应用于多肽而不用于核酸分子，因此相似性只涉及多肽序列对比。如果两个多肽序列有例如10/20相同的氨基酸，且剩余部分全是非保守置换，则相同百分数和相似性百分数都将是50％。如果在相同的例子中，有5个以上的位置有保守置换，则相同百分数仍然是50％，但相似性百分数将是75％(15/20)。因此，在有保守置换的情况下，两个多肽序列之间的相似性程度将高于这两个序列之间的相同百分数。“保守”氨基酸代替物在下文中参照表I进行描述。在表I的基础上，保守氨基酸代替物是从相同组中选择的替换氨基酸，例如，碱性、酸性、无荷极性和非极性组。例如，精氨酸的保守氨基酸代替物将是赖氨酸和组氨酸。
相同和相似性可以利用已知方法容易地计算出，包括但不限于下列文献中描述的那些Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects(生物计算信息学和基因组测序计划)，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析)，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M.Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.(SIAM应用数学杂志)481073(1988)。
优选的测定相同和/或相似性的方法是计划给出所检验序列之间的最大匹配。将测定相同和相似性的方法编纂成公众可获得的计算机程序。优选的用于测定两个序列之间的相同和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux，J.等，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)12(1)387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol(分子生物学杂志)215403-410(1990).BLAST X程序是公众可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源获得的(BLAST手册，Altschul，S.等，NCB NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol(分子生物学杂志)215403-410(1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定相同性。
作为实例，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，将要测定序列相同百分数的两个多肽进行排列，使它们各自的氨基酸最佳匹配(“配对广度”，利用算法测定)。将裂隙缺口损失(计算为3X平均对角线；“平均对角线”是所使用的对比矩阵的对角线的平均数；“对角线”是通过特定对比矩阵赋予每个完美氨基酸配对的得分或数值)和裂隙伸展损失(通常是裂隙缺口损失的1/10倍)，以及对比矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62与算法联合使用。标准对比矩阵(关于PAM250对比矩阵，参见Dayhoff等，载于蛋白质序列和结构图谱，第5卷，附录3(1978)；关于BLOSUM 62对比矩阵，参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院院报)8910915-10919(1992))也由算法使用。
优选的用于多肽序列对比的参数包括以下这些算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48443-453(1970)对比矩阵BLOSUM 62，来自Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)8910915-10919(1992)裂隙损失12裂隙长度损失4相似性阈值0GAP程序与上述参数一起使用。上述参数是使用GAP算法进行多肽对比的默认参数(再加上末端裂隙没有损失)。
优选的用于核酸分子序列对比的参数包括以下这些算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.(分子生物学杂志)48443-453(1970)对比矩阵匹配＝+10，不匹配＝0裂隙损失50裂隙长度损失3GAP程序也与上述参数一起使用。上述参数是用于核酸分子对比的默认参数。
本领域技术人员也可以使用其他例举性的算法、裂隙缺口损失、裂隙伸展损失、对比矩阵、相似性阈值等，包括Program Manual(程序手册)，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中列出的那些。要作出的特定选择将取决于要进行的具体对比，诸如DNA与DNA、蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA；以及此外，该对比是否是序列对之间的(在这种情况下GAP或BestFit一般是优选的)或者是一个序列与一个大序列资料库之间的(在这种情况下FASTA或BLASTA是优选的)。
至少约70％相同的多肽与野生型CRP1或B7RP1多肽相比一般将有一个或多个氨基酸置换、缺失和/或增加。在优选实施方案中，多肽将与CRP1或B7RP1多肽有约75％、80％、85％、90％或95％相同。通常，天然残基的代替物将是丙氨酸或保守氨基酸，以便对该多肽的总净电荷、极性或疏水性影响较小或没有影响。保守代替物列在下表I中。
表I保守氨基酸代替物碱性精氨酸赖氨酸组氨酸酸性谷氨酸天门冬氨酸无荷极性谷氨酰胺天门冬酰胺丝氨酸苏氨酸酪氨酸非极性 苯丙氨酸色氨酸半胱氨酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸脯氨酸甲硫氨酸亮氨酸正亮氨酸异亮氨酸本发明提供了CRP1或B7RP1多肽衍生物。在一个实施方案中，其中CRP1或B7RP1多肽与聚合物相连的化学修饰的CRP1或B7RP1多肽组合物包括在本发明的范围内。所选的聚合物一般是水溶性的，以便其附着的蛋白质不会在含水环境诸如生理环境中沉淀。所选聚合物通常经修饰具有单一活性基，诸如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，以便聚合程度在本发明方法中可以加以控制。聚合物可以是任何分子量的，并且可以是支链或无支链的。本发明范围内包括聚合物的混合物。优选地，为了最终产物制剂的治疗应用，聚合物将是药学上可接受的。
水溶性聚合物或其混合物可以从下列成员中选择，例如聚乙二醇(PEG)，一甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纤维素，或其他糖基聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。
对于酰化反应，所选聚合物应当具有单一活性酯基。对于还原烷基化，所选聚合物应当具有单一活性醛基。优选的活性醛是聚乙二醇丙醛，它是水稳定的，或者是其一C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利No.5,252,714)。
CRP1或B7RP1多肽的聚乙二醇化(pegylation)可以利用本领域中已知的任何一种聚乙二醇化反应进行，例如在下列参考文献中描述的那些Focus on Growth Factors(生长因子聚焦)34-10(1992)；EP0154316；和EP0401384。优选地，聚乙二醇化经由与如下所述的活性聚乙二醇分子(或类似活性水溶性