专利名称：产琼脂酶的类芽孢杆菌及其应用的制作方法琼胶是一种从江篱、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成，其中琼胶糖是由1，3连接的β-D-半乳吡喃糖和1，4连接的3，6_内醚-a-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖。近些年来的研究表明，琼胶糖的降解产物，2 10聚合度的寡糖具有多种生理活性，如抗氧化活性，降血脂活性，免疫调节活性，抗过敏活性、抑制糖苷酶活性等。琼胶酶就是能够降解琼胶为寡糖的酶，其在琼胶寡糖制备方面具有特异性强、得到寡糖活性高等优点，其在分子生物学等方面也多有应用，因此，对于琼胶酶的研究与开发具有重要的意义。琼胶酶有两个来源，一个来源是微生物。能够产生琼胶酶的微生物主要是海洋细菌，如假单胞菌属O^eudomonas)、别单胞菌属(Alteromonas)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)等；另一个来源是以海藻为食的海洋软体动物，如从海兔(Aplysiadactylomela)、鲍鱼(Haliotis coccinea)等。相比之下，微生物具有生长繁殖快，周期短，产酶活性高等特点，适合酶的大规模工业化生产，是获得琼胶酶的最佳来源。微生物菌种是发酵工业的基础和关键，能否提高发酵工业的效率、降低产品成本，关键在于能否获得高产优良的菌种。从自然界分离的野生菌种，往往存在产量低、发酵性能差等不足，需要对野生型菌株进行选育后才能改善其不足。时至今日，多种微生物育种新技术发展已取得长足发展，但诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术，其不仅可以提高有效产物的产量，改善生物学特性和创造新品种，而且对于研究有效产物代谢途径，绘制遗传图谱等方面都有一定的用途。离子注入法是最初应用金属材料表面的改性，当被引进生物材料的诱变育种后，由于其具有较高的诱变频率和较好的诱变效果而备受关注，也得到了越来越多的应用。离子注入生物材料后进行诱变的方法，由于其集能量沉积、质量沉积、动量传递过程以及粒子注入和电荷交换过程的联合作用，引起强烈的生物学效应而能够取得较好的诱变效果。离子注入具有变异幅度大、突变频率较高、突变谱较广、突变体的遗传性能较稳定、回复突变率低的优点。
本发明目的是提供一株琼胶酶高产菌株——类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在制备琼胶寡糖中的应用，较好地克服现有微生物发酵制备琼胶酶中的发酵周期长和酶活性低的缺点。本发明采用的技术方案是一株琼胶酶高产菌菌株——类芽孢杆菌(Paenikicillus sp.)札_15，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮政编码430072，保藏编号CCTCCNo =M 2011；357，保藏日期2011 年 10 月 19 日。类芽孢杆菌WL-15是以从我国东海浙江省温岭市近海海域海水中分离出的类芽孢杆菌WL为出发菌株，经低能N+离子注入诱变选育而获得，类芽孢杆菌WL菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号=CCTCC No =M 2010049，保藏日期2010年3月12日。具体的，本发明所述的类芽孢杆菌WL-15采用以下步骤获得(1)将出发菌株的菌体用无菌人工海水制成细胞浓度为IXlO7 IXlO8个/mL的菌悬液，涂布于培养皿中，在超净工作台上风干，镜检细胞间无重叠后进行N+离子注入诱变。出发菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. )WL(CCTCC No :M 2010049)；(2)对步骤(1)涂布于培养皿中的菌体，采用能量为lOkeV，剂量为23. 4X 1014ions/cm2的N+离子注入诱变，诱变后用无菌人工海水洗脱，经无菌人工海水稀释后，涂布于平板培养基上进行培养4 5天；(3)挑选步骤O)中平板培养基上形成凹陷较深的菌落，转接于斜面培养基培养24 36h，接种于产酶培养基培养M 3 后，测定发酵液的琼胶酶活力，与出发株进行比较，筛选获得酶活最高的菌株类芽孢杆菌WL-15 ；(4)将步骤(3)筛选得到的类芽孢杆菌WL-15连续传代5代并发酵产酶，测得各代产酶的活力，其产酶活力没有下降，确定该菌株是产酶活力遗传稳定。本发明类芽孢杆菌WL-15菌落具有以下特征菌体经稀释后接种平板培养基，30°C条件下培养M 48h，可形成直径2 3mm的菌落，菌落呈灰白色、半透明、表面湿润、圆形、边缘整齐，菌落生长处，培养基明显凹陷(见附图1)。所述的平板培养基组成为琼脂15 25g/L，葡萄糖1 2g/L，酵母浸出粉3 5g/L, MgSO4 · 7H20 4 5g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20 0· 01 0. 03g/L, CaCl2 0. 1 0. 3g/L, NaH2PO4 0· 5 1. Og/L，溶剂为水，pH 7 8。所述的产酶培养基组成为琼胶1 3g/L，NaNO3 3 6g/L，NaCl 10 20g/L,MgSO4 · 7H20 4 6g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 03g/L, CaCl2O. 1 0. 3g/L,MnCl2 · 4H20 0· 1 0. 2g/L，溶剂为水，pH 7 8。本发明还涉及所述的类芽孢杆菌WL-15在微生物发酵制备琼胶酶中的应用。所述的应用为将所述类芽孢杆菌WL-15菌种接种至适用于类芽孢杆菌的发酵产酶培养基(常规发酵培养基添加1 3g/L琼胶即可)中，25 35°C培养M 36h，获得含有琼胶酶的发酵液。所得发酵液经过离心或过滤除去菌体的清液为粗酶液，可以直接应用于琼胶寡糖的制备；也可以按照常规生化方法进行酶的分离纯化，得到纯化后的琼胶酶应用于琼胶寡糖的制备。优选的，所述发酵产酶培养基组成如下琼胶1 3g/L，NaNO3 4 6g/L，NaCl10 20g/L, MgSO4 · 7H20 4 6g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 03g/L, CaCl20· 1 0. 3g/L, NaH2PO4 0· 5 lg/L，MnCl2 · 4H20 0· 1 0. 2g/L，溶剂为水，pH 7 8。本发明的有益效果主要体现在(1)采用低能N+离子注入的方法进行诱变产琼胶酶微生物，具有突变率高、操作简单等优点；( 诱变选育得到的菌株产琼胶酶遗传稳定性良好，高产特性不易发生退化；C3)菌株具有产酶活力高、营养要求低和发酵周期短等优点，可应用于工业发酵制备琼胶酶，而琼胶酶在制备琼胶寡糖等领域有多种用途。图1为平板培养基上的类芽孢杆菌WL-15菌落形态照片。
本发明提供了一株经离子注入诱变得到的琼胶酶高产菌株——类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在微生物发酵制备琼胶酶中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NoM2011357，保藏日期2011年10月19日。本发明的有益效果主要体现在(1)采用低能N+离子注入的方法进行诱变产琼胶酶微生物，具有突变率高、操作简单等优点；(2)诱变选育得到的菌株产琼胶酶遗传稳定性良好，高产特性不易发生退化；(3)菌株具有产酶活力高、营养要求低和发酵周期短等优点，可应用于工业发酵制备琼胶酶，而琼胶酶在制备琼胶寡糖等领域有多种用途。