专利名称：一种转基因大米Bt63检测试剂盒及其检测方法Bt63转基因大米是含有抗虫基因的大米，能够抵抗病害，增加稻产量，但用这种大米制成的儿童食品可能影响婴儿健康。2008年4月15日起，欧盟要求所有从中国进口的米制品接受欧盟认可实验室的检验，并附上确定未含“Bt63”的卫生证书(http://eUr-leX· europa. eu/Lex UriServ/LexUriServ. do uri = OJ L :2008 :096 :0029 :0034 EN PDF)。 以往检测Bt63转基因大米主要有普通PCR法和荧光定量PCR法(徐颖.转基因大米的安全性与核酸检测技术的进展.安徽农业科学，2009，37 (33) : 16240-16242 ;吴孝槐，路勇.利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米[J]现代食品科技，2009 (25) :211-216.)，普通PCR 法需要相对昂贵的PCR仪及凝胶成像系统，荧光定量PCR法则需要昂贵的荧光定量PCR仪， 基层检测机构以及广大食品加工企业很难普及该检测方法。目前尚未见到用环介导等温扩增扩增技术检测Bt63转基因大米的报道
本发明的第一目的在于提供一种转基因大米Bt63检测试剂盒。本发明的第二目的在于提供一种转基因大米Bt63的检测方法。所述转基因大米Bt63检测试剂盒包括I)环介导等温扩增反应液A所述环介导等温扩增反应液A含有IOXBst DNA聚合酶反应缓冲液、300 μ M dNTP、2mM硫酸镁和转基因大米引物I ;所述转基因大米引物I包括0.8μΜ上游内引物 FIP-1、0. 8μΜ下游内引物ΒΙΡ-1、0. 2μΜ上游外引物F3-1和O. 2 μ M下游外引物Β3-1 ；其中，上游外弓I 物 F3-1 GTTACTTTGAAAGTGCCAATG下游外引物Β3-1 GAAACTTTATTGCCAAATGTTTG上游内引物 FIP-I ACTCCAGCAGTCCCACTAAAGCTTTTACATCTTCACTCGGTAA下游内引物BIP-I ATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGAACGATCGGGGAAATTCG2)环介导等温扩增反应液B所述环介导等温扩增反应液B含有IOXBst DNA聚合酶反应缓冲液、300 μ M dNTP、2mM硫酸镁和大米内源基因引物2 ;所述大米内源基因引物2包括0.8μΜ上游内引物 FIP-2、0. 8μΜ下游内引物ΒΙΡ-2、0· 2μΜ上游外引物F3-2和O. 2 μ M下游外引物Β3-2 ；其中，上游外弓I 物 F3-2 GGAAAGCCGATGGCATCAG下游外引物Β3-2 TCTCCATTGTCCTCCTCTGC上游内引物FIP-2 GCAAAACGCTCACCAGCTTCAAGACATTGAGGCGTTGCATCT下游内引物BIP-2 ATGTTGTGCTGCCAATGTGGCCCAGTATTGCCTGCACTGAT其中IOXBst DNA聚合酶反应缓冲液含有200mM pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、IOOmM 氯化钾(KCl)、IOOmM 硫酸铵((NH4) 2S04)、20mM 硫酸镁(MgSO4) 和 1% 曲拉通 X-100 (Triton X-100)；3) Bst DNA聚合酶C :含8个活性单位/ μ L 4)显色剂D :10% SYBR GREEN I荧光染料(SYBR GREEN I荧光染料是一种DNA荧光染料，国内商品名为SYBR GREEN I，该称谓也可见中国专利200710026390. X)；在装有环介导等温扩增反应液A的反应管加入转基因大米引物I的上游外引物 F3-1和下游外引物Β3-1各O. 2ymol/L，加入转基因大米引物I的上游内引物FIP-I和下游内引物BIP-I各至O. 8 μ mol/L ;在装有环介导等温扩增反应液B的反应管加入大米内源基因引物2的上游外引物F3-2和下游外引物B3-2至O. 2 μ mol/L，加入大米内源基因引物 2的上游内引物FIP-2和下游内引物BIP-2至O. 8 μ mol/L。所述转基因大米Bt63的检测方法包括以下步骤I)提取模板DNA ；在步骤I)中，所述提取模板DNA的方法可按常规方法或商品化的大米DNA提取试剂盒提取大米DNA ；2)环介导等温扩增a.在装有23 μ L LAMP反应液A的反应管A中加入I μ L待检模板DNA，同时在装有23 μ LLAMP反应液B的反应管B中加入I μ L待检模板DNA，95°C恒温水浴5min，立即置于冰上Imin ；b.分别在反应管A和反应管B中各加入IyL Bst DNA聚合酶；c. 60 65 °C 恒温水浴 Ih ；d. 80°C恒温3min，中止反应；3)显色检测在反应管B中加入IyL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样品DNA提取失败，整个实验必需重做；如颜色为绿色，说明样品DNA提取成功，进行下一步实验。在验证了样品DNA提取成功的前提下，在反应管A中加入I μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样品为非转基因大米；如颜色为绿色，则可判定样品为转基因大米。本发明的优点本发明依据欧盟联合研究中心(JRC)确认的CRL方法的检测原理，采用环介导等温扩增技术建立了 Bt63转基因大米的环介导等温扩增检测试剂盒和检测方法，此技术特异性强，与PCR方法有相同的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来检验，加入荧光染料目测观察即可，简单快速，特别适合于基层食品检测机构和食品加工企业自检。本发明利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速扩增DNA，在Ih内能达到IO9靶序列拷贝。可通过荧光染料来观察扩增效果。本发明提供了一种快速、特异性强、成本低的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法用于检测Bt63转基因大米,可以替代欧盟联合研究中心(JRC)确认的CRL方法，为食品安全监控提供新的科学依据。(3)显色检测在反应管B中加入IyL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样品DNA提取失败，整个实验必需重做；如颜色为绿色，说明样品DNA提取成功，进行下一步实验。 在验证了样品DNA提取成功的前提下，在反应管A中加入I μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样品为非转基因大米；如颜色为绿色，则可判定样品为转基因大米。
一种转基因大米Bt63检测试剂盒及其检测方法，涉及转基因大米。试剂盒包括环介导等温扩增反应液A、环介导等温扩增反应液B、Bst DNA聚合酶C和显色剂D。提取模板DNA；环介导等温扩增；显色检测。利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速扩增DNA，在1h内能达到109靶序列拷贝。可通过荧光染料来观察扩增效果。提供一种快速、特异性强、成本低的环介导等温扩增方法用于检测Bt63转基因大米，可以替代欧盟联合研究中心确认的CRL方法，为食品安全监控提供新的科学依据。