专利名称：一种苯丁酸氮芥多重靶向载药系统及其制备方法和应用的制作方法目前对恶性肿瘤的治疗采用手术加化疗的综合治疗为主，其中化疗是必须使用的 治疗手段，但现有的化疗药物对正常细胞与肿瘤细胞选择性差，易产生严重不良反应和易 发生多药耐药(Multi-drug resistance，MDR)，致使化疗效果不理想。目前认为，任何能提 高肿瘤细胞内化疗药物有效浓度的方法都是克服MDR的可行方法，如采用脂质体、靶向给 药系统等新制剂进行治疗。因此，针对并加强该类化疗药物制剂普遍存在的细胞选择性差、 毒副作用大、不良反应严重，特别是肿瘤细胞MDR等共性问题的基础研究，对开发化疗药物 新给药系统，提高恶性肿瘤治疗效果具有重要理论和现实意义。随着医学和材料科学新的研究成果不断涌现，药物制剂理论与实践获得了迅速发 展，为提高肿瘤的治疗效果、降低毒副作用、逆转MDR等发挥了重要作用。尤其是“靶向给 药”理论与实践研究的成果，为将化疗药物选择性导向特定肿瘤细胞、解决化疗药物制剂普 遍存在的选择性差等共性问题提供了新的思路，化疗药物的靶向给药有望成为治疗恶性肿 瘤的新途径。靶向给药系统(Targeting Drug Delivery System,TDDS)具有能将药物准确 送到病灶部位，提高病灶部位的药物浓度，从而提高药物治疗效果，避免或减轻药物毒副作 用等优点。靶向性可分为主动靶向性和被动靶向性。主动靶向性是指该系统具有主动识别 靶细胞并进入靶细胞的能力，如受体靶向给药系统等。被动靶向能力与系统的尺寸大小有 关，100纳米以下的颗粒易透过肿瘤组织的血管，使药物或基因等效应分子浓集于肿瘤细胞 周围并产生作用。透明质酸(Hyaluronan acid, HA)是由重复二糖结构单元β _D_葡萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖相互交替连接构成的线性黏多糖，具有低免疫原性、生物可降解性，是一 种理想的生物医用高分子材料。有文献报道，以HA作为药物载体的前药具有良好的主动及 被动靶向性，将抗肿瘤药物与HA偶合能提高药物的溶解性、稳定性、控释性；并使药物的毒 性降低，达到靶向治疗肿瘤的目的。CD44是细胞表面最重要的HA受体，其N端与HA非共价 结合，结合部位可以延伸至HA的数个重复二糖单位，且其在恶性肿瘤细胞表面高度表达， 因而HA适合用作恶性肿瘤靶向给药系统的主动靶向因子。分层自组装磁靶向给药系统是近年来研究的一种新的控释靶向给药系统，对一些 离表皮较近的实体肿瘤如食管癌、肝癌、乳腺癌、恶性肿瘤等均显示出临床治疗的优越性， 其靶向性和专一性更强、更快，从而达到高效、速效、低毒的效果。近年来已开展一系列利用 该给药系统来逆转化疗药的耐药性的研究。
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种苯丁酸氮芥(CHL)多重靶向载药系统及其制备方法和应用，该载药系统在用于肿瘤化疗时具有明显的优势，其 在杀伤高表达CD44受体的肿瘤细胞的同时，对正常组织的毒性较低，且该载药系统制备方 法简单，易于实施。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案苯丁酸氮芥多重靶向载药系统，其 特征在于由PEG-HA-CHL组分和Fe3O4磁流体组分按重量比为1 1_5的比例混合配制而 成，其中，PEG-HA-CHL组分的组分含量按重量份数计为苯丁酸氮芥20-100 份，PEG500-1500 份，HA100-500 份，DCC10-50 份，DMAP1-10 份， 丁二酸酐100-500份，EDC 10-50份，亚硫酸氢钠20-100份。本发明提供的苯丁酸氮芥多重靶向载药系统的制备方法，其特征在于包括有以下 步骤1) PEG-HA-CHL 组分的制备(a)端羧基聚乙二醇的合成及纯化将500-1500重量份PEG置于带有冷凝管、搅拌器和温度计的三口烧瓶中，加入 氯仿溶解，待溶解完毕后加入100-500重量份丁二酸酐，加热溶解，同时加入干燥的吡啶， 搅拌下回流反应2-10小时，停止反应后冷却至室温，反应所得混合物经减压蒸发至呈粘稠 状，再加入无水乙醚沉淀得到白色产物，抽滤，再用二氯甲烷溶解产物，滤去不溶物，加入无 水乙醚沉淀得到白色产物，重复数次，抽滤后真空干燥至恒重，得到端羧基聚乙二醇；(b) PEG-HA 的制备将步骤(a)得到的端羧基聚乙二醇溶解于100-500重量份透明质酸的水解液中， 倒入装有刺形分馏柱和搅拌器的三口烧瓶，加入催化剂EDC 10-50重量份、DMAP 0. 5-5重 量份，在60-140°C下反应2-10小时，收集100°C馏分，反应结束，冷却；加入无水乙醇至无沉 淀生成，过滤收集沉淀，洗涤，干燥即得PEG-HA ；(c)BA-CHL 的制备在装有温度计、分水器的三颈烧瓶中加入苯丁酸氮芥20-100重量份，亚硫酸氢钠 20-100重量份和苯甲醇在磁力搅拌下进行反应，将反应后所得的混合液依次用蒸馏水、饱 和碳酸氢钠和蒸馏水洗涤，得到油状物，将洗涤后得到的油状物用旋转蒸发仪进行蒸发，设 定旋转蒸发的温度为30-80°C，蒸发直到无馏出物为止，蒸发得到的物质用乙醇-乙醚进行 重结晶，得到乳白色的固体BA-CHL ；(d) PEG-HA-CHL 的制备将步骤(b)得到的PEG-HA、DCC 10-50重量份和DMAP 0. 5-5重量份溶于无水DMSO 中，室温避光磁力搅拌至PEG-HA全部溶解，加入步骤(c)所得BA-CHL的水溶液(pH4. 7)，室 温避光磁力搅拌过夜，然后用PBS液透析24-72h，再用双蒸水透析24-72h，冷冻干燥得反应 物粉末，将其于叔丁醇中通过0. 5-15%钯碳催化氢化脱除苯甲醇，即得产物PEG-HA-CHL ；2)智能多重靶向纳米给药系统的制备将步骤1)制得的PEG-HA-CHL与Fe3O4磁流体按重量比为1 1_5的比例混合，并 加入0. 5-5%的吐温80(0. 5-5%指重量比，即100G溶液中含0. 5-5G吐温)，进行自组装配 成智能多重靶向纳米给药系统混悬液，冷冻干燥即得智能多重靶向纳米给药系统冻干粉。按上述方案，所述的Fe3O4磁流体的制备方法是在氮气保护下，将按重量份计 六水三氯化铁50-200份，四水二氯化铁20-100份溶于吐温80溶液中，在强力搅拌下，将0. 5-5mol/l的氢氧化氨溶液缓慢加入铁盐混合溶液中，当溶液pH升高到4_8时，铁盐水解 产生大量黑色四氧化三铁晶体粒子，继续滴加NH4OH至pH = 8-10，使水解趋于完全，然后将 磁铁置于该溶液的容器底部，促使黑色Fe3O4沉淀，再用蒸馏水洗涤2-5次，分离沉淀，弃上 清，获得黑色Fe3O4凝胶，然后将Fe3O4凝胶分散于蒸馏水中，即得Fe3O4磁流体；从上述分散液中取出部分溶液，烘干后称重，计算出四氧化三铁(Fe3O4)在溶液中 的含量。取原液ImL稀释成5-20倍，在4°C超声分散仪中分散5_30分钟，用激光粒度分析 仪检测Fe3O4粒子的粒径，原子力显微镜观察其形貌。将装有Fe3O4纳米粒的小玻璃瓶和混 悬液的透明培养瓶分别置于4250高斯永磁铁旁或上，测试其磁响应性。本发明的PEG-HA-CHL的制备工艺如下本发明涉及一种肿瘤细胞多重靶向载药系统、该载药系统的制备方法及该载药系统在抗肿瘤药物方面的利用，由PEG-HA-CHL组分和Fe3O4磁流体组分按重量比为1∶1-5的比例混合配制而成，其中，PEG-HA-CHL组分的组分含量按重量份数计为苯丁酸氮芥20-100，PEG500-1500，HA100-500，DCC10-50，DMAP 1-10，丁二酸酐100-500，EDC 10-50，亚硫酸氢钠20-100。本发明的有益效果在于系统药物释放的智能性；系统的多重靶向性和良好的逆转耐药作用；系统药物释放的控释性；系统良好的血液循环稳定性；系统良好的隐形性；系统的广泛适用性。