专利名称：大豆中抗SMV蛋白及其编码基因Rsv3C与应用的制作方法大豆是重要的植物蛋白质和食用油脂来源，但由大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus, SMV)所引起的大豆花叶病是在全世界范围内普遍发生的最严重的大豆病害之一。 在我国的各个大豆产区，每年SMV均造成相当程度的危害，且随着病毒毒性的演变加强，产量损失有逐年加重的趋势。例如从台湾“亚蔬”引进的菜用大豆品种“台湾75”就曾因为严重感染大豆花叶病毒在江浙两省的许多地区几乎绝产。SMV不仅降低大豆产量，而且造成籽粒斑驳，影响大豆的外观品质，直接威胁到豆农增收和国家的农业安全。无论在国内还是国外，防治大豆花叶病一直是保障大豆持续生产的一个优先研究课题，但目前尚无有效药剂用于SMV的防治。分子生物学技术的迅速发展，使得从大豆抗性品种中筛选出感性品种所不具备的功能性抗病基因，继而利用其进行大豆分子育种成为可能。这是一种极佳的病毒防治策略，也是培育抗病、优质大豆新品种的最为经济有效的办法。
解决的技术问题本发明针对上述技术空白，提供一种大豆中抗SMV蛋白及其编码基因Rsv3C，并提供了它们在培育抗SMV大豆中的应用。技术方案大豆中抗SMV蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述。编码上述大豆中抗SMV蛋白的基因Rsv3C，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所述。包含上述核苷酸序列的重组质粒。包含上述重组质粒的宿主载体。上述的氨基酸序列在培育抗SMV大豆中的应用。上述的核苷酸序列在培育抗SMV大豆中的应用。有益效果本发明克隆的Rsv3C功能性抗SMV基因，可作为目的基因导入更多高产大豆品种，它所编码的R蛋白能够识别相应SMV病原释放的效应因子并激发抗性反应，提高植物的抗病能力，达到植物品种改良的目的。携带有本发明RSV3C功能抗SMV基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、DNA直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。提高育种的准确性和加速育种进程，满足生产上对品种抗性的要求，控制SMV的危害，提高大豆的产量和品质，增强国产大豆的市场竞争力。另外，通过对大豆抗SMV功能基因的快速预测、筛选、确定及克隆的研究，也可以为其它的抗病基因研究提供一种新的技术与操作平台，推动大豆功能基因克隆新技术的发展。图1为大豆14号染色体上位于分子标记A519与M3&itt之间的5个NBS-LRR型抗病基因所在位置示意图，分别命名为Rsv3-A，B, C, D, E；
图2为针对每个基因的上下游特异区域设计引物，用于扩增相应基因的全部编码区 (包括一个内含子区域)；
图3为从抗、感品种大豆中得到Rsv3上各基因的序列后进行分析，构建系统演化树，发现只有Rsv3C基因在抗感品种间分别各自聚类，且抗性品种的序列发生很大变化，检测到明显的正向选择作用，其演化模式符合功能性基因的特征；而其他的基因则不具备这些特征，如RsUB基因未能在抗感品种间各自聚类，序列差异不大，也检测不到正向选择作用；
图4为蛋白质3D结构模拟分析显示，上图为感性品种，下图为抗性品种与感性品种中的Rsv3C相比，抗性品种早熟18中的Rsv3C产物在C-末端的功能识别区(LRR区域)发生了显著变化，如感性蛋白中的一些松散的loop区域(箭头)在抗性蛋白产物中不明显，甚至消失。从而识别SMV病毒释放的病毒因子，并激发抗性。图5为我们选用的转基因克隆载体pBA002，将抗性品种早熟18中分离的Rsv3C基因已经连接到该载体中，质粒抽提的结果与PCR验证结果均为阳性。图中Ml为151Λ分子标记；1为连接成功后抽提的质粒(含有Rsv3C)基因；2为PCR验证得到的Rsv3C片段；M2 为8kb分子标记。图6为利用农杆菌介导的子叶节法，将早熟18_Rsv3C基因导入到高感品种后产生的转基因植株，其叶片对大豆花叶病毒表现为抗性。

获取功能基因
(1)利用大豆Williams82基因组数据(http //soybase. org/)，获取14号染色体上分子标记A519和M3Satt限定的153kb序列。接着以Pfam数据库(http://pfam. janelia. org/)中的标准结构域序列NB-ARC (PF00931)为参照，对该1531Λ序列进行比对搜索，找到含有NBS功能域的基因。通过基因预测工具FGENESH和排序比较两种方法，确定这基因的全长区域，包括外显子、内含子的数目与位置。将它命名为Rsv3 C。(2)通过软件01igo6，设计出Rsv3C的特异性引物(图2)，引物序列为 上游 CGGAATTCCGAGCGACAAGTCATGGTAT ；
下游 TCCCCGCGGGGATATGAGGGGTGTTAGTGTCTGA ；
4(3)种植大豆早熟18，两周后采集叶片5克左右，采用改进的CTAB法提取基因组DNA， 并用0. 8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所得DNA的浓度和纯度。以基因组DNA 为模板(浓度控制为20ng/yL)，利用第(2)步设计出的特异性引物，采用TAKARA公司的 LA-Taq酶及配套试剂，用Long-PCR方法扩增NBS-LRR型候选基因Rsv3C。使用的PCR程序为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，56°C复性45秒，68°C延伸7分钟，共30个循环， 68°C复性10分钟，随后12°C恒温。使用的PCR体系为25微升体系包括15. 2微升去离子水，2. 5 微升 10XLA PCR Buffer, 2. 5 微升 MgCl2, 2. 5 微升 dNTP (20mM), 1 微升上游特异引物，1微升下游特异引物，以及0.3微升LA Taq酶。反应后，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，然后送测序公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)测定其核苷酸序列。(4)选用转基因克隆载体PBA002，采取双酶法用限制性内切酶EcoRI与McII将载体切割成线状，再用带有酶切位点(含保护碱基)的Rsv3C上下游引物将Rsv3C基因扩增纯化后，采用T4连接酶(TAKARA公司)将其连接到载体中，得到PBA002 — Rsv3C。为确保连接克隆成功，我们进行了必要的质粒抽提和PCR验证，结果均为阳性(图5)。功能性验证
(5)接着采取农杆菌介导子叶节法，将Rsv3C基因转入到高感品种中(Williams):用冻融法将 PBA002 — Rsv3C 转入根癌农杆菌菌株 EHA105 (Avsian-Kretchmer et al, 2004， Plant Physiology, 135 1685-1696)中。pBA002 — Rsv3C 通过农杆菌株 EHA105 的介导， 转化高感品种，利用抗生素筛选和PCR技术筛选阳性转基因植株。待诱导产生的不定芽生长并产生叶片后，对其进行大豆花叶病毒侵染。2周后检测转基因苗叶片的发病情况，发现基本不发病，与非转基因对照株高达80%以上的发病率相比，抗性极显著(图6)。这表明原本对大豆花叶病毒表现为感病的高感品种因转入了我们筛选的Rsv3C基因，而具备了抵抗大豆花叶病毒的能力。


大豆中抗SMV蛋白及其编码基因Rsv3C与应用，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所述。该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所述。本发明克隆的Rsv3C功能性抗SMV基因，可作为目的基因导入更多高产大豆品种，它所编码的R蛋白能够识别相应SMV病原释放的效应因子并激发抗性反应，提高植物的抗病能力，达到植物品种改良的目的。