专利名称：一种培养基发酵高产银耳多糖的方法银耳又称白木耳，是ー种高等真菌，是世界上公认的重要药材。银耳中含有的ー种酸性多糖类物质，能提高机体的免疫功能，具有抗病毒的作用，促进T細胞的活动能力，故能有效地防治癌症在内的多种疾病。银耳多糖还能提高机体对原子辐射的防护能力，降低机体脂褐质沉积的物质，具有抗衰延年的作用等。目前市面上要大量获得银耳多糖主要采用对分生孢子进行液体深层发酵，发酵生产成本低廉，高产多糖，能实现产业化，能够给生产企业取得显著的经济效益。高产银耳多糖的研究大多数集中在对发酵条件进行优化，发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到エ业生产的必要环节。能否设计出ー个好的发酵培养基，是ー个发酵产品エ业化成功中非常重要的一歩。本发明是银耳多糖液体深层发酵培养基优化，通过大量的实验研究筛选，找到了一种最适合其生长酵母状分生孢子菌发酵的培养基，目前市面上产多糖4 g/L左右，本发明的方法产多糖高达9. 5 g/L，在原来的基础上提高发酵多糖的产量，以期达到生产最高发酵多糖的目的。
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种培养基液体深层发酵高产银耳多糖的方法，其特点是在生产中供菌种生长繁殖和积累发酵产物，保持银耳多糖菌体良好的細胞形态，高密度的生长，获得大量高纯的银耳多糖产物。本发明的技术方案如下一种培养基发酵高产银耳多糖的方法，其特征在于按如下的步骤进行(1)菌种银耳芽孢Tremella fuciformis CGMCCC5. 466购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；(2)培养基配制银耳芽孢甘油保藏培养基甘油300g/L ；
银耳芽孢斜面保藏培养基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0. 3g/L, 磷酸ニ氢钾2g/L，琼脂20g/L ；
银耳芽孢种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸镁2.5 g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，PH要求6. 0 ；
银耳芽孢发酵培养基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2.5 g/L, YNB(无氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，PH要求6. 0 ；(3)制备エ艺
菌种保藏用甘油保藏培养基，-70°C保存一年；
种子摇瓶培养接种量以5 10%菌液接入到种子培养基中培养1天，培养温度25°C ； 发酵培养将培养好的种子以8 10%接种量接入到发酵罐中，发酵装液量5L，发酵温度25°C，搅拌转速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；发酵时间到48h，调搅拌转速到300rpm，发酵培养周期到72h结束，离心收集上清液，浓縮，醇沉得到银耳多糖。本发明更加详细的方法如下
(1) 菌种Tremella fuciformis CGMCCC5. 466购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(2) 培养基配制
银耳芽孢甘油保藏培养基甘油300g/L。银耳芽孢斜面保藏培养基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0. 3g/ L,磷酸ニ氢钾2g/L，琼脂20g/L。银耳芽孢种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸镁2.5 g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5g/L，磷酸ニ氢钾0.5g/L，PH要求6.0。银耳芽孢发酵培养基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2. 5 g/L, YNB (无氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，PH要求6.0。(3) 制备エ艺
菌种保藏用甘油保藏培养基，-70°C保存一年。种子摇瓶培养接种量以5 10%菌液接入到种子培养基中培养1天，培养温度 25 0C ο发酵培养将培养好的种子以10%接种量接入到发酵罐中，发酵装液量5L，发酵温度25°C，搅拌转速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；发酵时间到48h，调搅拌转速到300rpm，发酵培养周期到7 结束，离心收集上清，浓縮，醇沉多糖。发酵培养基为(葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，YNB (无氨基酵母氮源)2g/L，PH要求6. 0)。本发明制备的发酵多糖的理化特性如下
方法先采用脱蛋白(Sevage法)、脱小分子(透析)、凝胶色谱纯化(EDAE柱)，柱纯化吋，采用硫酸苯酚法监测，然后进行DEAE柱色谱图分析得到两种均一体多糖BN516和 BN608。BN516和BN608均一体多糖的生物活性抑制淋巴瘤实验
取BN516和BN608多糖，用注射用水配置成浓度5mg/kg、10mg/kg。IRM-2纯系小鼠，雌雄各半。在IRM-2纯系小鼠左侧腹股沟处皮下注射，把IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤传代培养，处死IRM-2纯系小鼠剥离瘤块，称瘤重，通过实验表明，银耳多糖对淋巴瘤具有抑制作用。本发明的有益效果通过发酵培养中设计到的培养基，使发酵过程中有利分生孢子菌体的生长，代谢大量的目标产物，得到了高效生产多糖9. 5g/L，有利于缩短了发酵周期、成本低廉、エ艺简单易操作、环境污染小、能得到高产的多糖及容易实现产业化。

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中所用的培养基个各种试剂均有市
隹实施例1
本发明用的菌种为iTremella fuciformis CGMCCC5. 466购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。先把菌种转接到银耳芽孢斜面保藏培养基中培养4天，温度要求 25°C，斜面保藏培养基为(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸 ニ氢钾2g/L，琼脂20g/L);然后把培养好的斜面菌种转接到甘油保藏培养基中进行-70°C 保存，保存时间为一年，甘油保藏培养基为(甘油300g/L)；
在甘油保藏培养好的菌种以10%接种量转接到摇瓶种子培养基中培养1天，培养温度25°C，摇床转速160rpm，种子培养基为(葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2. 5g/L， YNB(无氨基酵母氮源)1.5 g/L，磷酸ニ氢钾0.5g/L，PH要求6.0);将培养好的种子以10% 接种量接入到发酵罐中，发酵装液量5L，发酵温度25°C，搅拌转速200rpm，根据细胞的生长情况把溶氧控制在50%，通气速率3vvm，用氨水控制PH6. 0 ；当发酵时间到4 进行调搅拌转速到300rpm，发酵培养周期到7 结束，发酵培养基为(葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2. 5g/L，磷酸ニ氢钾2. 5g/L，YNB (无氨基酵母氮源)2g/L，PH要求6. 0)；
把发酵液进行离心收集細胞和上清液，离心转速为3000 rpm,时间为20min ；将收集好的发酵上清进行旋转蒸发仪浓縮，浓缩温度75°C ；加三倍体积乙醇进行多糖沉淀，静置 IOmin后离心收集沉淀，离心转速为3000 rpm，时间为20min，沉淀用少许乙醚洗进行脱色， 用温箱50°C烘干，收集得到高产多糖9. 5g/L。实施例2
(1)菌种银耳芽抱！1remella fuciformis CGMCCC5. 466购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
(2)培养基配制
银耳芽孢甘油保藏培养基甘油300g/L ；
银耳芽孢斜面保藏培养基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0. 3g/L, 磷酸ニ氢钾2g/L，琼脂20g/L ；
银耳芽孢种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸镁2.5 g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，PH要求6. 0 ；
银耳芽孢发酵培养基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2.5 g/L, YNB(无氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氢钾0.5g/L，PH要求6.0 ；
(3)制备エ艺
菌种保藏用甘油保藏培养基，-70°C保存一年；
种子摇瓶培养接种量以5%菌液接入到种子培养基中培养1天，培养温度25°C ； 发酵培养将培养好的种子以10%接种量接入到发酵罐中，发酵装液量5L，发酵温度 25°C，搅拌转速200rpm，溶氧控制50%，用氨水控制PH6. 0 ；发酵时间到48h，调搅拌转速到 300rpm，发酵培养周期到7 结束，把发酵液进行离心收集細胞和上清液，离心转速为3000 rpm，时间为20min ；将收集好的发酵上清进行旋转蒸发仪浓縮，浓缩温度75°C ；加三倍体积乙醇进行多糖沉淀，静置IOmin后离心收集沉淀，离心转速为3000 rpm,时间为20min，沉淀用少许乙醚洗进行脱色，用温箱50°C烘干，收集得到高产多糖9. 5g/L。实施例3比较试验常规方法
(1)方法液体深层发酵
(2)步骤先用种子培养基培养种子，种子培养基为麦芽糖10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，磷酸ニ氢钾0. 46g/L，磷酸氢ニ钾lg/L，硫酸镁lg/L，PH自然；培养好的种子在转接到发酵培养基中培养，发酵培养基为麦芽糖10g/L，葡萄糖20g/L，豆粕20g/L，磷酸ニ氢钾0. 46g/L，磷酸氢ニ钾lg/L，硫酸镁lg/L，PH自然；培养120h收集发酵液进行浓縮，醇沉， 收集多糖。(3)結果收集得到多糖4 g/L左右。本发明的方法
(1)方法液体深层发酵
(2)步骤先用种子培养基培养种子，种子培养基为葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2. 5 g/L, YNB (无氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，PH要求6. 0 ；培养好的种子在转接到发酵培养基中培养，发酵培养基为葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁2.5 g/ L, YNB (无氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氢钾0. 5g/L，PH要求6. 0 ；培养7 收集发酵液进行浓縮，醇沉，收集多糖。(3)結果收集得到高产多糖9. 5 g/L。


本发明涉及一种培养基发酵高产银耳多糖的方法，属于微生物发酵培养技术领域。本发明用于Tremellafuciformis CGMCCC5.466作为菌种，先接入种子培养基中培养一天，将培养好的种子接入到发酵培养基中培养，发酵装液量5L,发酵周期72h，然后把发酵液进行离心，收集，浓缩，醇沉，乙醚洗，烘干，得到高产多糖9.5g/L，本发明的方法有效的缩短了发酵周期、具有工艺简单易操作、环境污染小、能得到高产的多糖及容易实现产业化的特点。