环二核苷酸cGAMP在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于生物医药【技术领域】具体涉及一种环二核苷酸(cGAMP)在制备抗肿瘤药物中的应用。[0002]肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。WHO专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2 000万人，死亡人数将达到I 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。肺癌、结/直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列。据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加,恶性肿瘤治疗需求越来越大。[0003]化疗是治疗肿瘤的有效方法之一。传统化疗药物的作用机制主要是阻止脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白质的合成，或直接对这些大分子发生作用，从而抑制肿瘤细胞的分裂增殖，使之死亡。有些药物也可以通过改变体内激素平衡而抑制肿瘤生长。目前抗肿瘤药物已发展到6大类:①抗代谢药；②烷化剂；③细胞毒素类抗生素；④植物生物碱和其他天然药抗肿瘤激素类；?钼类及其他抗肿瘤药。随着临床治疗模式的转变和一些新的抗肿瘤药物靶点的发现，抗肿瘤药物领域的研发发生了巨大变化:就药物的作用机制而言，从传统的非特异性的细胞毒类药物转向了非细胞毒类的靶向药物开发。2012年FDA批准的抗肿瘤药物中，小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)成为研发最热门的一类抗肿瘤药物，尤其是作用于多个靶点的TKI (约占3 / 4)，截至2013年6月美国FDA批准的TKI已达18种。此外，其他热点作用机制药物包括免疫刺激剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、免疫抑制剂和刺激剂、蛋白激酶抑制剂等。[0004]在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导内源强有力的免疫应答。内质网(ER)受体蛋白(STING)对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP 二核苷酸合成酶(cGAS)在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBKl和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP 二核苷酸GAMP。cGAS结合18bp dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。
[0005]本发明的目的在于提出cGAMP在制备抗肿瘤药物中的应用，以制备毒性低、效果好的抗肿瘤药物。[0006]本发明实验研究表明，cGAMP可以抑制多种肿瘤细胞的生长，具有明显的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。[0007]本发明中，所述肿瘤包括但不限于胃癌，肺癌，结肠癌，肝癌，前列腺癌，胰腺癌等。[0008]本发明还涉及利用cGAMP所制备的抗肿瘤药。所制备的抗肿瘤药物毒性低、效果好。

[0009]下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
[0010]实施例1:cGAMP的制备
cGAMP (环化-GMP-AMP)按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP 二核苷酸合成酶(cGAS)催化合成。纯度在98%以上。(PingweiLi, et al., Immunity, 2013,39(6)，1019-1031.) 实施例2: cGAMP (环化-GMP-AMP )的抗肿瘤作用采用荷瘤鼠模型进行检测cGAMP对动物皮下移植瘤生长的抑制作用。
[0011]受试药物 名称:cGAMP 性状:白色粉末 溶媒:生理盐水。
[0012]配制方法:临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。
[0013]受试物浓度:lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml。
[0014]动物
种属、品系、性别、体重、来源、合格证
BALB/c裸鼠，雄性，体重16-18g，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号=SCXK (沪)2007-0005 ]。
[0015]饲养条件
所有裸鼠，均自由觅食和饮水，在室温(23±2) °C，饲养于中国人民解放军某军医大学实验动物中心。
[0016]剂量设置
cGAMP腹腔注射小鼠，设置2个剂量组:10 mg/kg, 20 mg/kg，40mg/kg。
[0017]试验对照
阴性对照:生理盐水溶液 阳性对照:5-氟尿嘧啶(5-FU)，剂量20mg/kg 给药方法
给药途径:腹腔注射给药 给药体积:10ml/kg 给药次数:每天I次，连续14天 每组动物数:8只 肿瘤细胞株人胃癌细胞株MNK-45，人肺腺癌细胞株A549，人结肠癌细胞株Lovo，人肝癌细胞株SMMC-7721，人前列腺癌细胞株PC-3，人胰腺癌细胞SW1990，均购自中国科学院细胞库。
[0018]试验主要步骤
1.荷模型的建立与干预
细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为1.0X0培7的细胞悬液，裸鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液(细胞浓度为2.0浓度为6个/只)，10 d左右肿瘤长至直径约5 mm，致瘤成功，随机均分为4组:阴性对照组(腹腔注射生理盐水组)、5_FU组(腹腔注射 5-FU 20mg/kg 组)、cGMP-AMP 低剂量组(腹腔注射 cGMP-AMP 2mg/kg 组)。cGMP-AMP组高剂量组(腹腔注射cGMP-AMP 8mg/kg组)。每天给药I次,连续给药14天。14天后，处死裸鼠并称瘤体重量，抑瘤率=[1-实验组平均瘤重(B、C、D组为实验组)/ A组平均瘤重)]X100%。
[0019]分别制备6种皮下移植瘤模型:人胃癌细胞株MNK-45，人肺腺癌细胞株A549，人结肠癌细胞株Lovo，人肝癌细胞株SMMC-7721，人前列腺癌细胞株PC-3，人胰腺癌细胞SW1990,并观察cGAMP的作用。
[0020]2.统计分析数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验比较各组瘤重差异的显著性,显著性水平a=0.05。
[0021]结果
裸鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，5-FU和cGAMP均可明显抑制肿瘤生长，给药14天后的瘤重均显著低于阴性对照组(P〈0.05，P〈0.01)，表明cGAMP具有抗肿瘤作用。具体结果见表1-表6。
[0022]表1 cGAMP对裸鼠人胃癌细胞株MNK-45皮下移植瘤的作用