专利名称：一种肌内脂肪沉积fto基因的制作方法近年来，由于猪的选育工作中过度追求高瘦肉率，导致猪肉品质的严重下降。随着生活水平的不断提高，人们对猪肉颜色、嫩度、风味等肉品质特性的要求也越来越高。肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)是影响肉品质的重要因素，目前已得到越来越多的认识和重视。肌内脂肪的沉积是一个复杂的生理生化过程，主要涉及肌肉内甘油三酯的代谢，包括甘油三酯的合成、分解及转运等过程。因此，肌内脂肪细胞内的脂类代谢是肌内脂肪沉积的基础。FTO 基因(Fat Mass and Obesity Associated, FTO)是一种与肥胖相关的等位基因，也称肥胖基因。2007年英国牛津大学马克·麦卡锡等研究人员首先鉴别出了等位基因FTO基因，定位在人16号染色体上，一个副本来自父体，另一副本来自母体，呈双螺旋结构。体内FTO基因变异的人，如果两个副本均变异，其肥胖的几率会比那些无变异副本的人高出70%之多。小鼠实验表明，FTO基因过度活跃会造成小鼠饮食过度，从而导致体重大幅增加。对人类的研究发现，FTO基因使人缺乏对食欲的控制。正常的“一日三餐”无法消除 FTO基因携带者的饥饿感，导致他们不停进食，并导致肥胖。且FTO基因对食欲的影响与年龄、性别、社会经济背景或身高体重指数无关。因此，FTO基因是与肥胖相关的重要基因。德国科学家发现，FTO基因受到抑制的老鼠出生后生长较慢，脂肪组织和瘦肉组织较少。出生 6周之内，这些老鼠体重比其它同类轻30%至40%。研究人员认为，FTO基因会抑制新陈代谢，降低能量消耗效率而导致肥胖。因此，这些FTO基因受到抑制的老鼠消耗能量较快。此外，FTO基因也可能通过影响内分泌激素，如瘦素、脂联素、肾上腺素等来调控食欲和能量代谢过程。FTO基因位于染色体16ql2. 2，基因全长约400kb，包括9个外显子，全部编码蛋白质。FTO基因在人、鼠、猪以及其他哺乳动物中高度保守。FTO基因属于非血红素双加氧酶超家族，编码2 -酮戊二酸依赖型核酸脱甲基酶，是一种核酸修复酶，能作用于下丘脑弓状核， 调节食欲和能量代谢。FTO基因mRNA在大脑内，尤其下丘脑mRNA的表达最丰富，但在其他组织也有表达。动物实验研究发现，FTO基因能够使DNA去甲基化，并参与DNA修复、脂肪酸代谢和翻译后修饰。基因组关联分析发现FT0基因内有许多单核苷酸多态性位点，这些单核苷酸多态性位点与肥胖和胰岛素敏感性有关，FTO基因的变异增加肥胖和2型糖尿病的风险。目前FTO基因的功能仍然还是一个谜。FTO基因与肥胖存在显著相关性毋庸置疑， 但体育锻炼程度、饮食习惯、能量摄入对FTO基因表达的影响尚无定论。从目前的研究可以看出，FTO基因影响肥胖和2型糖尿病，然而FTO基因在很多组织中的广泛表达，是否预示着FTO功能的普遍性；FT0参与肥胖的同时，是否还参与其他生物过程，因此，FTO基因的功能鉴定及其作用机制需要进一步的研究。迄今为止，FT0基因的表达对猪肌内脂肪沉积和 脂类代谢的影响及调节机理，国内外尚未见报道。
本发明的目的是提供一种肌内脂肪沉积FT0基因，采用基因芯片技术和生物信 息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现FT0基因参与肌 内脂肪细胞脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 FT0基因。具体为一种肌内脂肪沉积FT0基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉 积相关的脂肪沉积与肥胖相关(FT0)基因，基因的CDS序列全长为1518bp，其CDS核苷酸 序列如SEQ. ID. NO. 1。并且，CDS核苷酸序列编码505个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。 对上述特征的肌内脂肪沉积FT0基因设计引物，进行PCR扩增，检测FT0基因在猪心、肝、 脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FT0基因在脂肪组织中大量表达， 初步表明FT0基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。猪是脂肪沉积型动物，其脂肪沉积能力在不同品种之间变化很大。我国一些肉质 优良的地方猪种是最宝贵和稀缺的基因资源，这在优质猪肉的培育中有独特的利用价值。 版纳微型猪是云南省优良的地方猪种，具有耐粗饲、适应性强、肉质优良、肌内脂肪丰富，肌 纤维细密，肉质鲜嫩等优良特性。然而，目前对版纳微型猪的生长发育及肌内脂肪沉积的分 子机制知之甚少。近年来，本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组 织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现FT0基因参与肌内脂肪细胞的脂类代谢过程， 并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 FT0基因。因此，研究版纳微型猪FT0基因的序列 与表达模式，分析其核苷酸和氨基酸序列结构，从分子水平了解版纳微型猪肌内脂肪沉积 较多的规律，为进一步研究该基因的功能及为改善猪胴体脂肪性状的育种工作提供理论基 础。本发明克隆得到版纳微型猪FT0基因⑶S全序列，全长为1518bp，提交到 Genbank，登录号为JQ031263。与Genbank提供的猪FT0基因相比较，发现有八个核苷酸突 变位点，其中六个为有义突变，导致六个氨基酸发生相应变化。FT0蛋白在物种间的同源性较高，通过进化树可以看出，猪与牛的亲缘性较近，其 次是羊、人、大鼠。猪FT0蛋白氨基酸序列与牛、羊、人和大鼠的同源性分别为91%、90%、89% 和83%。FT0蛋白在不同物种间的高度保守性提示它们功能的重要性，这些基因的保守性也 是FT0在各个物种中相应的生理特点保持不变的分子基础。另外，FT0在脂肪组织中的大 量表达，也证明了它在肌内脂肪沉积等方面有重要作用。图1是本发明的PCR扩增FT0基因图示。图2是本发明的FT0基因在不同组织中的表达水平柱图。图3是本发明的FT0基因酶切鉴定图。图4是本发明的进化树分析图。图5是本发明的FT0蛋白二级结构预测图。图6是本发明的FTO蛋白磷酸化位点预测图。图7是本发明的FTO蛋白糖基化位点预测图。图8是本发明的FTO蛋白疏水性分析图。图9是本发明的FTO蛋白的三级结构模型图。

采取50kg成年版纳微型猪肌肉组织立即放入液氮中保存备用。利用RNA提取试剂提取版纳微型猪肌肉组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行。将提取的RNA反转录成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物设计及PCR反应条件
根据 GenBank 中猪 FTO 序列信息(GenBank 登录号 AY448008),利用 Primer Premier 5. O设计引物，并合成。用于克隆的FTO基因的引物序列为
F :5，- ATGAAGCGAACCCCAACC -3，
R:5’ - CTAGGGTTTGGCTTCCAG -3’
用于荧光定量的FTO基因的引物序列为
F :5，- AACCGCCGAGGAACGAGA -3，
R :5，- GCTGCCACTGCTGATAGAA -3，
内参18S rRNA的引物序列为
F :5’ -CTGCCTTCCTTGGATGTG -3’
R:5’ -GCGGCTTTGGTGACTCTA -3’
FTO基因克隆的PCR反应条件为94°C预变性4min;94°C变性40s、55°C退火40s、 72°C延伸I. 5min 35个循环；72°C后延伸IOmin进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定其亮度和特异性。通过PCR扩增，得到了长度为1518bp的片段。PCR扩增产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增的产物的长度大小同于目的片段大小。荧光定量PCR的反应条件为95°C预变性30s ;95 °C变性5 s，60°C退火30s、 72°C延伸30s，40个循环进行扩增。数据处理的方法为，检测心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪七个组织中FTO基因的相对表达量，实验数据以18S rRNA作为内参，采用双标准曲线法处理。 结果显示，FTO在被检测的7个组织中都有表达，在肝中高量表达，在脂肪、肾、脾和肺中大量表达，在肌肉、心中少量表达。3、FTO基因的克隆及序列分析按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒书说明书回收特异性条带，产物连接于pMD-18T载体，转化至ToplO感受态细胞，氨苄筛选挑取阳性克隆，分别接种于IOmL LB液体培养基中， 37°C振荡过夜，提取质粒经Ecor I和Hind III双酶切鉴定为阳性，进行测序。4、测序结果
所得到的版纳微型猪FTO编码区(CDS)全长1518bp，核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，并提交到Genbank数据库，登录号为JQ031263。CDS序列编码505个氨基酸，其氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。5、测序结果与Genbank中提供的序列比对
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪的核苷酸序列同 GeneBank中猪FTO基因(登录号为NM_001112692. I)的⑶S序列进行序列比对。结果发现有八个突变位点，即第38位由G变为A，163位由G变为T，213位由A变为G，509位由C 变为T，594位由C变为G，614位由G变为A，，796位由A变为G，988位由G变为A。其中六个为有义突变，导致氨基酸序列发生相应变化，即第13位氨基酸由甘氨酸G变为谷氨酸 E，55位氨基酸由甘氨酸G变为半胱氨酸C，170位氨基酸由丙氨酸A变为缬氨酸V，205位由丝氨酸S变为天冬酰胺N，266位氨基酸由天冬酰胺N变为天冬氨酸D，330位由丙氨酸A变为苏氨酸T。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。6、FTO基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪FTO基因测序结果与牛(登录号为BC140478. I)、人(登录号为NM_001080432. 2)、羊(登录号为EU072419. I)和大鼠(登录号为BC168239. I) FTO基因的核苷酸和氨基酸序列比对分析，结果显示版纳微型猪与牛、人、羊和大鼠的FTO基因的⑶S序列同源性分别为89%、88%、88%和84% ；CDS序列所编码氨基酸的同源性分别为91%、89%、90%和83%。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。7、FTO基因的进化树分析
利用Meg4软件的邻近(Neighbor-joining)方法构建版纳微型猪(Genbank登录号JQ031263)、牛(登录号为BC140478. I)、人(登录号为NM_001080432. 2)、羊(登录号为 EU072419. I)和大鼠(登录号为BC168239. I) FTO蛋白的系统进化树，结果显示版纳微型猪与牛、羊的亲缘性较近，其次是人、大鼠。8、FTO蛋白分子量、等电点预测分析
使用ExPASy的在线软件Compute pi/MW分析版纳微型猪FTO蛋白的等电点(pi)为 5. 18、理论分子量(pW)为 58164. 11 Da。9、FTO蛋白质二级结构预测分析
登陆http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,对版纳微型猪FTO蛋白质二级结构进行预测，共有201个螺旋、33个伸展链和271个卷曲结构。10、FTO蛋白质磷酸化位点预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,对猪 FTO 蛋白质憐酸化位点进行预测，结果显示，共有22个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有10个、苏氨酸磷酸化位点有7个、酪氨酸磷酸化位点有5个。11、FTO蛋白质糖基化位点预测
登录 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,对版纳微型猪 FTO 蛋白糖基化位点预测，结果显示FTO蛋白在第200、246、302位有3个糖基化位点。12、FTO蛋白质疏水性分析
登陆http://web. expasy. org/protscale/,对FTO蛋白质疏水性进行分析,结果显示为未水性蛋白。13、FTO蛋白质三级结构的预测分析
登录http://swissmodel. expasy. org/, Swiss-Model 软件给出 FTO 蛋白质可能的三级结构模型图。


本发明公开一种肌内脂肪沉积FTO基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的脂肪沉积与肥胖相关(fatmassandobesityassociated,FTO)基因，基因的CDS序列全长为1518bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列编码505个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。检测FTO基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示FTO基因在脂肪组织中大量表达，初步表明FTO基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。