专利名称：吴茱萸次碱类化合物的新用途的制作方法动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是缺血性心脑血管疾病的一种。近年来 心脑血管疾病的发病率呈明显上升趋势，该病导致的死亡人数占全球死亡人数的1/3。临床上的AS治疗药物包括扩张血管药物、调整血脂药物、抗血小板药物等。但是这些要我虽可减缓该病进程，但不能治愈AD。在临床上广泛应用的他汀类药物主要是通过抑制胆固醇的生物合成和增强外周细胞对胆固醇摄取的LDL受体调节通路来实现抗动脉粥样硬化的，但仅可以降低20 40 的心血管事件(Shah PK. Emerging non-statinLDL-Iowering therapies for dyslipidemia and atherosclerosis. Rev CardiovaseMed, 2003,4(3) : 136-141)，并且目前他汀类药物发现很多肝脏、心脏等方面毒性。而且，越来越多的临床试验表明升高HDL水平对心血管疾病有益，并且不依赖降低LDL (Price MJ等人，New Strategies in Managing and Preventing Atherosclerosis Focus on HDL. RevCardiovasc Med, 2002，3 (3) : 129-137)。要进一步降低心血管疾病的危害，在降低低密度脂蛋白胆固醇的同时必须从预防和/或逆转动脉粥样硬化的新治疗靶点出发来寻找具有新作用机制的药物。潜在靶点ABCA1已知ABCAl (ATP-binding cassette transporter Al)的主要功能是将细胞内游离的胆固醇及磷脂转运至贫脂或无脂的载脂蛋白A-I(apoA-I)，这是胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的第一个限速环节，因此ABCAl对脂质代谢和AS的发生、发展具有重要影响。研究表明，ABCAl在肝脏中的表达对于HDL代谢以至体内整个胆固醇的内环境稳定而言都很重要(Timmins JM 等人，Targeted activation of hepatic Abcal causesprofound hypoalphalipo-proteinemia and kidney hypercatabolism of apoA-I.JClin Invest, 2005，115 (15) :1333-1342)，还对体内巨噬细胞中的RCT起到正调控的作用(F. Basso 等人，Role of the hepatic ABCAl transporter in modulating intrahepaticcholesterol and plasma HDL cholesterol concentrations. J Lipid Res,2003,44(2)296-302)。ABCAl基因位于常染色体9q31上，约150kb，包括50个外显子和49个内含子，人ABCAl蛋白由2261个氨基酸组成的膜转运蛋白，分子量为220kDa(Kaminski WE,Piehler A, Wenzel JJ.ABC A-subfamily transporters !Structure, function anddisease. Biochim Biophys Acta, 2006,1762 (5) :510-524)。ABCAl 基因突变导致 Tangierdisease (TD)病、组织巨噬细胞内胆固醇聚积，血浆HDL胆固醇降低(HDL cholesterol,HDL-C),增加心血管疾病的风险(Joyce C等人，Study of ABCAl Function in TransgenicMice, Arteroscler Thromb Vasc Biol. 2003,23(6) :965-971)。ABCAl 基因敲除小鼠表现出血衆HDL水平降低和巨卩遼细胞中脂质积聚的现象(McNeish J等人，High densitylipoprotein deficiency and foam cell accumulation in mice with targeteddisruption of ATP-binding cassette transporter-1. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA, 2000,97 (8) :4245-4250)。高表达 ABCAl 的转基因小鼠可以升高血浆HDL、apoA-I的水平，并且使巨噬细胞胆固醇流出明显增加，从而降低AS的危险性。ABCAl被认为是发现新型心血管药物的潜在的新祀标(Attie AD等人，Pivotal role ofABCAl in reverse cholesterol transport influencing HDL levels and susceptibitoatherosclerosis. J Lipid Res, 2001，42(11) :1717-1726)。潜在靶点PPAR y -LXR a -ABCAl级联通路ABCAl基因的表达受转录调控，包括核受体和一些转录因子等(Xia M，等人， Anthocyanins Induce Cholesterol Efflux from Mouse Peritoneal Macrophages. J BiolChem，2005，280(44) :36792-36801)。ABCAl基因的转录起点上游大约Ikb为已知的启动子区，含有多个调节脂代谢的转录因子结合位点，其主要是通过核受体超家族(包括肝脏X受体(LXR a )、视黄酸X受体(RXR)、法呢醇X受体，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)和甲状腺激素受体)和转录因子(如AP-l、AP-2，Spl和NF-kB等)与其上游调控序列相互作用来实现的(Langmann T 等人，Identification of sterol-independent regulatoryelements in the human ATP-binding cassette transporter Al promoter role ofSpI/3,E-box binding factors,and an oncostatin M-responsive element. J Biol Chem,2002,277(17) : 14443-14450)。其中过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)是一类核受体超家族成员，存在三种亚型，即PPAR a ,PPAR 6 ,PPAR y。PPAR y在配体激活的情况下，与RXR(视黄酸受体)形成二聚体，与响应元件结合调控下游靶基因的转录。最近研究表明PPARy能通过诱导LXRa的转录，最终通过ABCAl增加胆固醇流出(Soumian S等人，ABCAl and atherosclerosis.Vasc Med, 2005,10 (2) :109-119)。LXRa能够与RXR形成异源二聚体，识别ABCAl启动子的DR4 兀件，增加 ABCAl 基因的转录与表达(Zarubica A 等人，from pathology to membranefunction. Pflugers Arch, 2007,453 (5) :569-579)。有研究表明，PPAR Y-LXR a-ABCAl级联通路是胆固醇从巨噬细胞流出的一种有效的方式，在影响动脉硬化斑块的发展过程中起重要的作用(Soumian S 等人，ABCAl and atherosclerosis. Vasc Med, 2005,10 (2)109-119)，可以作为研究动脉硬化药物研究的靶点。潜在靶点SR-BI人类SR-BI (Scavenger Receptor Class B Type I)是作为 CD36 膜蛋白超家族以及溶酶体整合膜蛋白相关蛋白被独立发现的，所以又称为CLA-I (⑶36 and LIMPIIAnalogous-1)。研究表明，SR-BI/CLA-1是HDL代谢的主要调节者之一，并且是可以与广泛的天然和修饰的脂蛋白结合的多功能受体。SR-BI/CLA-1参与外周组织中胆固醇的流出和肝脏及固醇激素合成组织中胆固醇的选择性摄取，在胆固醇的流出和流入过程中都起着关键作用(Robins SJ 等人，Relation of gemfibrozil treatment and lipid levelswith major coronary events VA-HIT a randomized controlled trial. Journal oftheAmerican Medical Association, 2001, 285 (12) :1585-1591)。HDL 受体表达上调剂可以通过增强胆固醇的逆转运过程，使泡沫细胞中过量的胆固醇外流，并通过逆转运机制转运到肝脏细胞或固醇激素合成组织被利用和代谢，从而减缓动脉粥样硬化脂质斑块的形成甚至使之发生逆转。候选药物来源中药吴茱萸(Evodia rutaecarpa(Juss. )Benth)是芸香科植物吴茱萸干燥的近成熟果实。始载于《神农本草经》，列 为中品，具有散寒、止痛、降逆、助阳、止泻的功效，近代药理研究发现吴茱萸尚具有扩张血管、降压、强心、止泻、收缩子宫、杀虫、抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗胆碱酯酶、抗癌等作用(胡熙明，中华本草.上册(M)上海科学技术出版社，1996.1026-1034)。吴茱萸含有多种化学成分，目前从中分离的主要有生物碱类、苦味素类、挥发油类等化学成分。生物碱类又可分为喹啉酮类生物碱和吲哚类生物碱。其中喹啉酮类生物碱有17种，包括吴茱萸卡品碱(evocarpine)、二氢吴茱萸卡品碱(dihydroevocarpine)等；[!引哚类生物碱17种,如吴茱萸碱(evodiamine)、吴茱萸次碱(rutaecarpine)、去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine)等。除生物碱类,苦味素类也是吴茱萸的一种重要活性成分。从吴茱萸分离出的苦味素类成分有朽1檬苦素(Iimonin)、吴茱萸苦素(rutaevin)、吴茱萸苦素乙酸酯(rutaevineacetate)、吴茱萸内酯醇(evodol)等。除上述两种成分,从吴茱萸中还分离出月桂烯、吴茱萸烯(evodene)等挥发油成分。发明人考虑到目前动脉粥样氧化预防和/或者治疗药物的需求，设想将根据构建的药物筛选模型的平台，以吴茱萸的多种化学成分为作为候选激动剂和药物可以进行目标药物的筛选工作。
根据上述设想，发明人借助人ABCAl上调剂筛选模型，经过大量实验，筛选到了人ABCAl上调剂吴茱萸次碱和吴茱萸内酯。在筛选得到这两种化合物后，在活性检测时发现这两种化合物还可以作用于其他靶点。并且根据在分子水平、细胞水平以及apoE+小鼠体内的研究结果，首次发现吴茱萸次碱类化合物可以在分子细胞水平上调ABCAl、CLA1和LXR a的表达、激动PPAR y、抑制巨噬细胞泡沫化、促进胆固醇流出；首次发现吴茱萸次碱可以减轻高脂饮食的apoE+小鼠主动脉全长的斑块，减少脂质在肝脏、心脏流出道的聚积，降低血浆中TC、TG和LDL水平，升高HDL水平。综合体外和体内实验结果表明，本发明人发现的吴茱萸次碱类化合物可以通过上调ABCAl等机制进而实现其抗动脉粥样硬化作用，对动脉粥样硬化的预防和/或治疗具有重要的意义。由此，本发明提供了含有吴茱萸次碱类化合物的激动剂或者药物组合物，其中含有吴茱萸次碱、吴茱萸内酯中的至少一种。同时本发明提供了吴茱萸次碱、吴茱萸内酯中的至少一种在制备用于上调ATP结合盒转运子ABCAl、高密度脂蛋白受体CLA-1/SR-BI、肝脏X受体LXRa表达活性，激动PPAR y活性、抑制抑制巨噬细胞泡沫化、和增强巨噬细胞胆固醇流出的激动剂中的用途。进一步提供了吴茱萸次碱、吴茱萸内酯中的至少一种在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的用途。吴茱萸次碱类化合物是指包括吴茱萸次碱(rutaecarpine)、吴茱萸内酯(Evodine)的化合物或其组合。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，适于通过任何合适的途径治疗施用的形式，例如口服、皮下、肌内、静脉内和皮内等途径。本发明的药物组合物优选含量有重量比为0. 1% -99. 5%的活性成分，最优选含有重量比为0. 5% -99. 5%的活性成分。在本发明中，所述激动PPARy的活性是指利用本发明实施例中详述的PPAR y -LBD激动剂筛选模型测定的荧光强度增加到150%以上。 应当理解，本发明的化合物和组合物的适当剂量可能取决于疾病的类型、严重程度和阶段，并且随患者各不相同。确定最佳剂量一般包括使治疗优点水平与本发明的治疗的任何危险或有害副作用相平衡。发明的有益效果I)筛选靶点的新颖性目前国内外致力于寻找ABCAl的上调剂或者激动剂，但尚未有作用于此靶点的药物出现；本发明人将ABCAl上调剂应用在动脉硬化模型的apoE+小鼠上，并得到确切的抗动脉硬化效果，这在国内外属首次；同时，本发明人所做的工作也说明以ABCAl为靶点可以筛选到新的、有效的抗动脉粥样硬化的先导化合物。2)化合物的新颖性吴茱萸为传统中医用药，具有广泛地作用。本发明人第一次阐述了吴茱萸次碱在动脉硬化方面的确切作用，并且从首次从分子机制和动物体内阐述其抗动脉硬化作用的原因，这对于我国中药的现代化具有重要的意义。3)动脉硬化的预防和治疗血管疾病尤其是动脉粥样硬化已严重威胁到人类的生命健康，已有的药物早已不能满足临床的需求，不能从根本上治疗。本发明发现的化合物在动物体内具有良好的抗动脉粥样硬化效果，为开发抗动脉硬化药物提供了很好的先导化合物，具有广阔的应用前景。图I吴茱萸次碱(2018651B)、吴茱萸内酯(2018661B)增加ABCA1-LUC IfepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线图2吴茱萸次碱(2018651B)、吴茱萸内酯(2018661B)增加CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线图3吴茱萸次碱(2018651B)激动PPAR y细胞荧光素酶活性的量效关系曲线图4A吴茱萸次碱(2018651B)对肝癌细胞H印G2中ABCAl的mRNA表达的影响，其浓度均为 0. I u g/ml、l. 0g/ml、10. 0g/ml、30. 0 u g/ml。图4B吴茱萸次碱(2018651B)对肝癌细胞H印G2中LXR a的mRNA表达的影响，其浓度均为0. g/ml ；图4C吴茱萸次碱(2018651B)对肝癌细胞H印G2中ABCAULXRa的蛋白表达的影响，其浓度为 0. I Ii g/ml、l. 0g/ml、10. 0 u g/ml、30. 0 u g/ml。图5吴茱萸次碱(2018651B)抑制巨噬细胞泡沫化油红0染色镜检照片，其中a 对照(80 u g/ml Ox-LDL) ；b :0. 5 u g/ml 吴茱萸次碱+80 u g/ml Ox-LDL ；c :阴性对照(不加Ox-LDL)。图6吴茱萸次碱(2018651B)诱导RAW264. 7细胞中胆固醇流出至ApoA-I ;其中吴茱萸次碱(2018651B)的浓度分别为 0. I ii g/ml、l. 0 u g/ml、10. 0 u g/ml、30. 0 u g/ml,cAMP (环化腺核苷一磷酸)为阳性对照，浓度为400 u M0 图7吴茱萸次碱能减少apoE+小鼠体内的药效评价，其中 图7A为apoE Z小鼠王动脉en face油红染色结果，结果显不吴朱臾次喊明显减少apoE+小鼠主动脉硬化斑块的形成，其中a，模型组(高脂饮食)；b，吴茱萸次碱8mg/ml(高脂饮食)；c，吴茱萸次碱16mg/ml (高脂饮食)；d，空白组(普通饲料)。图7B为apoE+小鼠肝组织的油红染色结果，结果显示吴茱萸次碱(2018651B)明显减少apoE+小鼠肝脏中脂质聚积，其中，a :高脂饮食模型组(40X)，b :高脂饮食模型组(400X)，c :阴性对照组(40X)，d :阴性对照组(400X)，e 2018651B高剂量组(40X),f 2018651B 高剂量组(400X)，g :2018651B低剂量组(40X)，h :2018651B低剂量组(400X),同时a:对照1，空白组(普通饲料)，b:对照2，模型组(高脂饮食)，c:吴茱萸次碱8mg/ml (高脂饮食)，d :吴茱萸次碱16mg/ml (高脂饮食)。图7C为apoE+小鼠心脏流出道的油红染色结果，apoE+小鼠心脏流出道的油红染色结果显示吴茱萸次碱(2018651B)能明显减少apoE+小鼠心脏流出道中脂质聚积，其中，a :高脂饮食模型组(40X)，b :高脂饮食模型组(400X)，c :阴性对照组(40X)，d :阴性对照组(400X)，e :吴茱萸次碱，高剂量组(40X)，f :吴茱萸次碱，高剂量组(400X)，g 吴茱萸次碱，低剂量组(40X)，h:吴茱萸次碱，低剂量组(400X)，，同时，a:对照1，空白组(普通饲料)，b :对照2，模型组(高脂饮食)，c :吴茱萸次碱8mg/ml (高脂饮食)，d :吴茱萸次碱16mg/ml (高脂饮食)。

陳Wcooh 璧饿菱麵講一将ABCA1-LUC HepG2细胞以5X IO4个/孔接种于96孔细胞培养板中，约6小时待细胞贴壁后，将培养基以200 iU/孔分别更换为含一系列稀释浓度(浓度均为以下梯度:100、50、25、12. 5,6. 25,3. 125,1. 56,0. 78,0. 39,0. 145,0. 07,0. 03,0. 003 u g/ml ；同时加药(吴茱萸次碱和吴茱萸内酯均为购买，含量99(% )，陕西森弗生物技术有限公司公司)的化合物的无血清RPMI-1640培养基(Hyclone。注意保持各浓度孔中DMSO的终浓度为0. 1% (和加药同时进行)，终浓度0. I % DMSO培养基的孔作为空白对照。继续于37°C，5% CO2条件下培养18-24小时后，用PBS (200 iil/孔)洗板2次，弃PBS。加入细胞裂解液(20 V- I/孔)(E1531, Promega), 15-30分钟后,显微镜下观察细胞裂解完全后,加入突光素酶(60 Ul/孔)，立即测定荧光素酶活性(酶标仪读数)，分析样品浓度与荧光素酶活性的改变率之间的量效关系，计算EC50。用如下方程计算待测样品对荧光素酶活性的改变率改变率(％) = A/BX100其中，A为加入待测样品后测定的细胞荧光素酶活性(RLU)，B为加入空白对照样品(DMSO)后测定的细胞荧光素酶活性(RLU)。待测样品的改变率> 150%的即视为阳性，并观察阳性样品对细胞状态的影响。 结果得到如下表I和表2。表I :吴茱萸次碱在ABCAl上调剂筛选模型筛选时的结果


本发明涉及吴茱萸次碱类化合物的组合物及其新用途，具体地涉及选自式1-式2的化合物或其组合的药物和激动剂，及其新用途，所述的新用途为制备用于上调ABCA1、CLA-1/SR-B1、LXRα以及激活PPARγ的激动剂用途，制备用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物的用途。