专利名称：一种双氢青蒿素磷脂复合物及其制备与应用的制作方法恶性肿瘤在全球范围内已成为严重威胁人类生命健康的多发病和常见病。据统 计，目前我国每年有180万人新患恶性肿瘤，150万死于恶性肿瘤，其治疗失败的主要原因 是肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性，以及恶性肿瘤组织结构功能异常引起的肿瘤快速增 生和转移。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素类药物在体内的最终活性代谢 产物，青蒿素是我国药学工作者1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种过氧桥 的倍半萜内酯类化合物，并一直以来作为抗疟药使用；随着技术进步以及临床的需要，青蒿 素以及其衍生物的其他药理活性得到了广泛的关注，尤其是青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作 用方面，各国药物学家进行了广泛的研究，其抗肿瘤作用的机理可以分成三个作用包括协 同、增效作用，逆转肿瘤的多药耐药性，以及抑制肿瘤血管生长和转移的作用；协同、增效作 用双氢青蒿素可以与亚铁原子发生反应，延迟细胞周期，诱导细胞凋亡，如中国专利二 氢青蒿素在增强化疗药物抗肿瘤疗效中的应用(申请号200710071185. 5)中提到的二氢青 蒿素与环磷酰胺协同增效作用研究，以及青蒿素衍生物与长春瑞滨的组合无及其应用(申 请号200810201607. 0)中提到的双氢青蒿素可显著增强长春瑞滨对MCF-7人乳腺癌细胞、 A549人肺癌细胞、K562人白血病细胞等多种细胞的细胞毒性；逆转肿瘤细胞的多药耐药 性中国专利青蒿素在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用(申请号200710143393. 1)公 开了青蒿素及其衍生逆转长春新碱耐药KB细胞的耐药性；此外二氢青蒿素在增强化疗药 物抗肿瘤疗效中的应用(申请号200710071185. 5)还公开了二氢青蒿素可通过阻断肿瘤血 管生成，阻断肿瘤细胞的快速增殖及转移，因此可作为血管生成抑制剂使用。这些研究结果 均表明，双氢青蒿素作为化疗药物的增效剂具有广阔的应用前景，但是双氢青蒿素作为青 蒿素的衍生物，在水和大豆油中的溶解度都差，分别为0. 132士0. 016和1. 63士0. 02mg/mL, 使用中，尤其是在作为增效剂以及血管生成抑制剂使用时，往往影响其药效的发挥。磷脂复合物(phytosomes)的研究最早是由加拿大科学家Venkataram于1984报 道，他们发现将药物Griseofulvin与磷脂共同溶于氯仿中，蒸发除去有机溶剂得到的磷脂 沉淀物对药物的溶出具有明显的促进作用，随后人们对这种制剂形式进行了大量的研究， 例如灯盏花素，黄芩苷，吲哚美辛等，这些磷脂复合物可改善药物的亲水亲脂性质，提高药 物的溶出速度，从而使化合物的理化性质和生物特性产生不同程度的改变。脂质体(liposome)为一种新的药物传递系统，小粒径脂质体可有效的增加药物 在体内的循环时间，增强药物的作用效果，从而使药物的毒性降低，耐受性提高，考虑到双 氢青蒿素在用于抑制血管生长时，所用剂量较大，将其制备成脂质体，以方便给药，且也有 研究表明以磷脂复合物制备脂质体，可提高制剂的包封率和稳定性。
本发明目的是提供一种双氢青蒿素磷脂复合物与脂质体制剂，该制剂改善了双氢 青蒿素亲水亲脂的理化性质，提高了双氢青蒿素在使用中的耐受性，本发明还提供了双氢 青蒿素磷脂复合物及其脂质体制剂的制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明采用的技术方案是一种双氢青蒿素磷脂复合物，所述双氢青蒿素磷脂复合物为双氢青蒿素与磷脂以 质量比1 0. 1 10的复合物；所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂。本发明所述的双氢青蒿素磷脂复合物按以下方法制备按照配比量，将双氢青蒿 素与磷脂加入有机溶剂A中，30 60V反应0. 5 4h至反应液澄清，将反应液30 60°C减 压旋蒸，除去有机溶剂，干燥，即得双氢青蒿素磷脂复合物；所述双氢青蒿素与磷脂的质量 比为1 0.1 10，所述有机溶剂A的用量以能够溶解双氢青蒿素及磷脂并澄清为准，用量 没有太大影响，所述的有机溶剂A为下列之一乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、 正己烷、环己烷、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或丙酮，所述的磷脂为天然磷脂或合成磷脂。所述的天然磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂，或大豆卵磷脂与蛋黄卵磷脂的组 合；所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二 油酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，也可以是以上任意组合。本发明所述的有机溶剂A优选为下列之一乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮。本发明还提供了一种双氢青蒿素磷脂复合物所制备的双氢青蒿素磷脂复合物脂 质体制剂，所述制剂由以下重量配比的药用原料组成的组合物制成脂质体，再与药物可接 受的冻干保护剂制成双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂，所述药用原料质量组成如下 0. 1 10份双氢青蒿素磷脂复合物、1 80份磷脂或1 80份磷脂和0 50份胆固醇； 所述双氢青蒿素磷脂复合物中双氢青蒿素与磷脂的质量比为1 0.1 10，所述双氢青蒿 素磷脂复合物中的磷磷与所述药用原料中的磷脂各自独立为天然磷脂或合成磷脂。所述的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂，所述的冻干保护剂为下列一种或两种 以上任意比例的组合海藻糖、乳糖、蔗糖、甘露糖或葡萄糖，优选为海藻糖、甘露糖或葡萄 糖。所述的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂按照以下步骤制得(1)按照双氢青蒿素磷脂复合物中的配比量，将双氢青蒿素、磷脂加入有机溶剂A 中，氮气保护下，30 60°C水浴加热搅拌0. 5 池至溶液澄清透明，将反应液减压旋蒸除 去有机溶剂A，干燥得到双氢青蒿素磷脂复合物；有机溶剂A为下列之一乙酸乙酯、四氢 呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、环己烷、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或丙酮，优选乙酸乙 酯、二氯甲烷或丙酮；( 将步骤(1)得到的双氢青蒿素磷脂复合物与药用原料组成中组方 量的磷脂或组方量的磷脂和胆固醇混合，加入有机溶剂B，在氮气保护下，30 60°C水浴加 热搅拌，使溶液澄清透明，所得溶液转移至茄型瓶中，减压蒸发，除去有机溶剂B，并在瓶壁 形成一层透明薄膜，加入PH5. 0 7. 4的缓冲溶液充分水化，过聚碳酸酯膜或微射流进行均 质处理，制得双氢青蒿素磷脂复合物脂质体；所述有机溶剂B为下列之一氯仿、甲醇或丙 酮；所述的聚碳酸脂膜为孔径优选200nm;(:3)将步骤( 制得的双氢青蒿素磷脂复合物脂 质体，加入冻干保护剂，并使其充分溶解，混勻，随后分装，冻干，即得双氢青蒿素脂质体冻干制剂，所述的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体与冻干保护剂的质量比为1 1 20 ；所述 冻干保护剂的加入不需要加热和搅拌，能够溶解于脂质体中。所述的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂的制备中，步骤(1)所制备的双氢青蒿 素磷脂复合物反应液也可以直接除去有机溶剂，不进行干燥直接加入磷脂进行后续的反应。所述的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂的制备方法中步骤(2)加入pH5. 0 7. 4的缓冲溶液充分水化，所述的缓冲溶液为下列之一磷酸盐缓冲液、蒸馏水、生理盐水 或5%葡萄糖注射液。优选的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂，制备方法步骤(3)按照以下步骤进 行将双氢青蒿素磷脂复合物脂质体中加入冻干保护剂，充分溶解，过聚碳酸酯膜或者微射 流进行均质处理，使脂质体平均粒径< 300nm，分装，冻干，即得双氢青蒿素磷脂复合物脂质 体制剂；所述的聚碳酸脂膜为粒径200nm，连续过膜均化10 20次；本发明还可以微射流 进行均质处理的方法代替过聚碳酸酯膜，所述的微射流均质先以5000psi处理3个循环，然 后以10000 15000psi处理6 10个循环。所述的冻干保护剂为下列一种或两种以上任意比例的组合海藻糖、甘露糖或葡 萄糖，最优选为甘露糖。本发明所述的有机溶剂A、有机溶剂B均为有机溶剂，为便于区分不同步骤加入的 有机溶剂不同而命名为有机溶剂A、有机溶剂B，所述的有机溶剂A、有机溶剂B的加入量没 有限制，能够溶解双氢青蒿素及双氢青蒿素磷脂复合物、磷脂及胆固醇即可。所述的双氢青蒿素磷脂复合物及其脂质体制剂的在制备抗肿瘤药物中的应用。双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂还可以以药学上可接受的辅料载体制成注射 给药或口服给药剂型。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在双氢青蒿素磷脂复合物可显著增强双氢青蒿素的亲水亲脂性，将其与阿霉素组合 应用，可增强阿霉素的细胞毒性，降低阿霉素的使用量，从而降低化疗药物在治疗过程中的 毒副作用；此外双氢青蒿素磷脂复合物的亲脂性增强，也表现为其对内皮细胞(HUVEC)的 毒性作用进一步增强，与双氢青蒿素原料药相比，其IC50降低，毒性增大，更适合作为血管 生成抑制剂使用，制成脂质体制剂后其体内耐受性更好；同时，本发明双氢青蒿素磷脂复合 物脂质体制剂与阿霉素联用时，磷脂复合物可以更好的逆转阿霉素耐药株MCF-7细胞的耐 药性，双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂比双氢青蒿素具有显著的优势。图1为实施例1所制备的双氢青蒿素磷脂复合物脂质体(DHA-LP))的透射电镜 图；图2为实施例10以实施例1所制备的双氢青蒿素磷脂复合物(DHA-P)与阿霉素 (DOX)联合治疗荷S180肉瘤小鼠肿瘤抑瘤率；图3为实施例11以实施例1所制备的DHA-P与DOX联合治疗B16黑色素瘤小鼠 模型肿瘤实体图其中A为空白组，B为DHA单用药组，C为DHA-P单用药组，D为DOX单用 药组，E为D0X+DHA联合用药组，F为D0X+DHA-P联合用药组。阿霉素(ug/mL)IR(%)0.0523.48 + 1.430.574.81 +3.73169.31 +2.64484.86 ±3.92893.67 ±2.69注阿霉素对MCF-7阿霉素敏感株抑制的IC50为0. 221 士0. 045ug/mL表2阿霉素对MCF-7阿霉素耐药株细胞生长抑制率(S ± SD )
本发明公开了一种双氢青蒿素磷脂复合物与脂质体制剂及其制备与应用，所述双氢青蒿素磷脂复合物为双氢青蒿素与磷脂以质量比1∶0.1～10的复合物；所述脂质体制剂由以下重量配比的药用原料组成的组合物制成脂质体，再与药物可接受的冻干保护剂制成双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂，所述药用原料质量组成如下0.1～10份双氢青蒿素磷脂复合物、1～80份磷脂或1～80份磷脂和0～50份胆固醇；本发明双氢青蒿素磷脂复合物可显著增强双氢青蒿素的亲水亲脂性，将其与阿霉素组合应用，可增强阿霉素的细胞毒性，降低阿霉素的使用量，从而降低化疗药物在治疗过程中的毒副作用。