专利名称：一种SARS病毒DNA疫苗pVPH的制作方法世界卫生组织将严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome；SARS)简称萨斯病，并确认是一种SARS病毒(SARS coronavirus)引起的传染性疾病。目前尚无针对SARS病毒的特效药，研制有效的预防性疫苗势在必行。DNA疫苗，是近年兴起的新型疫苗，具有抗体效价维持时间长和交叉保护效果好等优点。此外DNA疫苗还具有以下突出优点(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，起到预防作用；(2)免疫保护时间长；(3)生产工艺简单、成本低廉、稳定性好且贮运方便。
本发明提供一种SARS病毒DNA疫苗pVPH，可用于预防人严重急性呼吸道综合征。其作用机理为人冠状病毒与SARS病毒具有一定的同源性，将人冠状病毒血清型OC43株抗原HE抗原决定簇编码序列插入真核表达质粒载体，将其注射于肌肉组织，使其在肌细胞中表达病毒表面抗原，经过抗原提呈过程，可激活体内的体液免疫系统和细胞免疫系统。激活的体液免疫系统可产生具交叉保护作用的抗体。消除游离在血液中的病毒，预防SARS病毒的入侵；而激活的细胞免疫系统可产生细胞毒淋巴细胞(CTL)，攻击已被感染的细胞，消除隐藏的SARS病毒。目前已知，人冠状病毒OC43株是引起人类上呼吸道感染的病原，成人的10％～30％普通感冒由其所致，该病毒与SARS病毒具有一定的同源性。HE(hemagglutinin-esterase)即红细胞凝集素酯酶，为冠状病毒的主要抗原之一，可与特异性受体结合，凝集血红细胞。已知人冠状病毒OC43株的HE基因基本结构为全长1272bp，编码424个氨基酸的成熟蛋白。本发明对HE蛋白进行抗原决定簇分析，选择编码抗原决定簇的编码序列作为插入的外源DNA序列，其结构为 ACGCCTGTACAGGTTGTTGATTCCCGGTGGAACAATGCCAGGCAGTCTGATAACATGACGGCGGTTGCTTGTCAACCTCCGTACTGTTATTTTCGTAATTCTACTACCAACTATGTTGGTGTTTATGATATTAATCATGGAGATGCTGGTTTTACTAGCATACTTAGTGGTTTGCTGTATAATTCACCTTGTTTTTCCCAGCAAGGCGTTTTTAGGTATGATAATGTTAGCAGTGTCTGGCCTCTCTACCCCTATGGCAGATGTCCCACTGCTGCTGATATTAATAACCCTGATCTGCCCATTTGTGTGTATGATCCGCTACCAGTTATTTTGCTTGGCATTCTTTTGGGCGTTGCGGTCATAATTATTGTAGTTTTGTTGCTGTATTTTATGGTGGATAATGGTACTAGGCTGCATGATGCTTAG鉴于人TPA(纤溶酶原激活剂)的信号肽具有将蛋白质前体搬运到细胞膜，之后信号肽被切割，成熟蛋白就分泌到细胞外的功能，故将其编码序列接在HE抗原决定簇编码序列前端，所组成的人冠状病毒分泌型HE蛋白抗原决定簇编码序列简称为HE-P，其表达的抗原蛋白能分泌到细胞外，从而大大提高体液免疫，起到更好的预防病毒感染的作用。本发明SARS病毒DNA疫苗pVPH的制备方法如下1.人工合成人冠状病毒分泌型HE蛋白抗原决定簇编码序列HE-P(见核苷酸序列表1)a)序列特征长度552bp类型核酸链数双链几何结构线性b)分子类型DNAc)来源人工合成d)序列描述分泌型HE蛋白抗原决定簇编码序列HE-P ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGATCTGAATTCACGCCTGTACAGGTTGTTGATTCCCGGTGGAACAATGCCAGGCAGTCTGATAACATGACGGCGGTTGCTTGTCAACCTCCGTACTGTTATTTTCGTAATTCTACTACCAACTATGTTGGTGTTTATGATATTAATCATGGAGATGCTGGTTTTACTAGCATACTTAGTGGTTTGCTGTATAATTCACCTTGTTTTTCCCAGCAAGGCGTTTTTAGGTATGATAATGTTAGCAGTGTCTGGCCTCTCTACCCCTATGGCAGATGTCCCACTGCTGCTGATATTAATAACCCTGATCTGCCCATTTGTGTGTATGATCCGCTACCAGTTATTTTGCTTGGCATTCTTTTGGGCGTTGCGGTCATAATTATTGTAGTTTTGTTGCTGTATTTTATGGTGGATAATGGTACTAGGCTGCATGATGCTTAG 其中，加下划线的序列为TPA的人信号肽编码序列，共114bp；5’末端的 为Hind III酶切位点；3’末端的 是Xho I酶切位点。
2.制备DNA疫苗pVPH用限制性内切酶Hind III和Xho I分别对上述合成的DNA片段HE-P和真核表达载体pVAX1进行双酶切，酶切片段分别经琼脂糖凝胶电泳纯化回收。然后将上述pVAX1载体酶切片段与HE-P酶切片段按一定比例混合，通过连接酶进行连接，以CaCl2法将其转化至感受态大肠杆菌DH5α(购自GIBLCO公司)中，在卡那霉素平板上得到转化子，进行筛选。筛选到的阳性转化子为重组pVPH的工程菌，该工程菌可用于制备DNA疫苗pVPH。
本发明DNA疫苗是真核表达载体pVAX1与HE-PDNA片段的重组质粒。该重组质粒含有pUC ori质粒复制起始位点、卡那霉素抗性基因Kanamycin、一个完整的真核转录翻译单元的巨细胞病毒启动子PCMV、人冠状病毒分泌型HE蛋白抗原决定簇编码序列HE-P及3’端的多聚腺苷酸BGH pA。
本发明DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，可在真核细胞中表达HE-P抗原并可激活淋巴细胞。其表达的抗原蛋白能分泌到细胞外，从而大大提高体液免疫，预防病毒感染的作用更强。


图1为本发明SARS病毒DNA疫苗pVPH的结构示意2为本发明SARS病毒DNA疫苗pVPH的构建流程图

实施例1SARS病毒DNA疫苗pVPH的制备DNA疫苗pVPH结构见图1，构建流程见图2。
1.合成HE-PDNA序列(结构如前所述)，其5’末端含Hind III酶切位点 3’末端含Xho I酶切位点 2.构建pVPH的重组质粒
用限制性内切酶Hind III和Xho I对HE-P DNA片段进行双酶切。反应体系为HE-P DNA片段5μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H2O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1％低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收M-P酶切片段。同时，用Hind III和Xho I双酶切pVAX1载体。反应体系为pVAX1载体2μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H2O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAX1酶切片段。
将上述pVAX1酶切片段与HE-P酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为pVAX1酶切片段0.5μl(200ng/μl)；HE-P酶切片段1μl(50ng/μl)；连接Buffer(660mM Tris-Hcl pH7.6；66mM MgCl2；100mM DTT；1mM ATP)1μl；T4DNA连接酶1μl(5U/μl)，补H2O至总体积10μl。连接反应的条件为12℃10小时。
3.构建pVPH工程菌将上述连接反应产物以CaCl2法转化至感受态大肠杆菌DH5α中(详见分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002)连接产物10μl与DH5α(1～2×109细菌/ml)感受态细胞200μl混合，冰浴放置30分钟，42℃2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml 2YT液体培养基(16g蛋白胨/L；10g酵母抽提物/L；5g NaCl/L)，37℃培养45分钟后铺于含卡那霉素的琼脂平板。37℃培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含100μg/ml卡那霉素的3ml 2YT培养基中37℃培养过夜，6,000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小量抽提试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA。然后用Hind III和Xho I双酶切鉴定。反应体系为重组质粒1μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mMNaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H2O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见552bp的HE-P片段和2.9kb的pVAX1载体大片段。说明筛选到的该阳性转化子为重组pVPH的工程菌。
4.SARS病毒DNA疫苗pVPH的制备本发明的DNA疫苗是用上述重组工程菌株制备的。培养方式为液体培养。采用细菌发酵罐行高密度悬浮通气培养。选用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化钠，PH7.0)。发酵时添加矿物油等作为消泡剂。培养温度为37℃，培养时间为14小时。
从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，采用常规方法(分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002)。具体操作为100g湿菌中加入800mL溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl pH8.0，10mMEDTA)强裂振荡混匀。加入新鲜配制的1L溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)垂直轻柔混匀，室温5分钟。再加入冰预冷的0.75L溶液III(1M醋酸钾，7M醋酸铵pH4.8)垂直轻柔混匀，冰浴5分钟。连续流12000转/分钟4℃离心取上清。在上清中加入1.53L异丙醇室温10分钟，连续流12000转/分钟室温离心留沉淀。加70％乙醇450ml漂洗过夜。10000转/分钟4℃离心10分钟留沉淀。加1L PBS(pH7.4)溶解，加RNaseA(终浓度0.1％，华美生物工程有限公司)65℃消化30分钟。再加入等体积的PEG溶液(PEG8000 13％，氯化钠1.6M)沉淀，12000转/分钟4℃离心10分钟，留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1％体积Triton X114混匀，冰浴5-10分钟，37℃30分钟，37℃12000转/分钟离心10分钟，取上层水相。最后用0.45μm和0.22μm双层滤膜加压过滤，用PBS缓冲液稀释至1mg/ml，即为SARS病毒DNA疫苗pVPH，可用于肌肉注射。
当然，构建pVPH也可采用其他真核表达载体，如pCDNA3。
表1分泌型人冠状病毒HE蛋白抗原决定簇编码序列HE-P的核苷酸序列表AAGCTTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGATCTGAATTCACGCCTGTACAGGTTGTTGATTCCCGGTGGAACAATGCCAGGCAGTCTGATAACATGACGGCGGTTGCTTGTCAACCTCCGTACTGTTATTTTCGTAATTCTACTACCAACTATGTTGGTGTTTATGATATTAATCATGGAGATGCTGGTTTTACTAGCATACTTAGTGGTTTGCTGTATAATTCACCTTGTTTTTCCCAGCAAGGCGTTTTTAGGTATGATAATGTTAGCAGTGTCTGGCCTCTCTACCCCTATGGCAGATGTCCCACTGCTGCTGATATTAATAACCCTGATCTGCCCATTTGTGTGTATGATCCGCTACCAGTTATTTTGCTTGGCATTCTTTTGGGCGTTGCGGTCATAATTATTGTAGTTTTGTTGCTGTATTTTATGGTGGATAATGGTACTAGGCTGCATGATGCTTAGCTCGAG。


本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防严重急性呼吸道综合征的SARS病毒DNA疫苗pVPH。它由人冠状病毒HE蛋白抗原决定簇编码序列与纤溶酶原激活剂TPA的信号肽编码序列组成的分泌型HE蛋白抗原决定簇编码序列HE－P，插入真核表达载体所构成。该重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α就成pVPH工程菌，可用于制备疫苗pVPH。由于其表达的抗原蛋白能分泌到细胞外，从而增强了体液免疫，起到更好的预防SARS病毒感染的作用。本发明DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，可在真核细胞中表达HE－P抗原并可激活淋巴细胞。故可作为预防严重急性呼吸道综合征的DNA疫苗。