专利名称：一种基于rna聚合酶结合位点的原核生物分子标记方法DNA分子标记是能够明确反映遗传多态性的生物特征，是生物体在DNA水平上变异的直接反映。它具有数量多、信息量丰富、多态性高、与基因表达无关、不受环境和个体发育进程影响等优点，已广泛应用于育种、资源与性别鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评价、 遗传作图、基因定位与克隆等等多个方面。自从1980年Botstein等首次提出RFLP (限制性片段长度多态性)标记以来，已经发展出十多种分子标记。RFLP是基于分子杂交的第一代分子标记，早期应用较多，但需要制备和标记探针，DNA需要量也多，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高，其它基于分子杂交的分子标记，如DNA指纹、小卫星DNA等标记技术也存在同样的缺陷。此后，发展出多种基于PCR技术的分子标记。RAPD(随机扩增多态性DNA)是1990年由Wiliam和 Welsh等两个研究小组几乎同时建立的一种标记，它技术简单，检测速度快，需要DNA量少， 成本低，但RAPD标记是显性标记，不能提供完整的遗传信息，稳定性和重复性差。ISSR(简单序列重复间区)和SSR(简单序列重复)标记也是基于PCR技术的标记，ISSR的扩增特点是随机的，多是显性标记；SSR是共显性标记，在基因组中分布比较均勻，数量丰富，多态性高。但这两种标记都需要预先知道DNA序列，传统开发成本较高。1992年Zbaeau和Vos将 RAPD与RFLP的优点结合起来发展出一种DNA新标记——AFLP (扩增片段长度多态性)，并于1993年申请欧洲专利(EP0534858A1)，该技术快速，分辨率高，重复性好，易于标准化，但技术繁琐，过程持续时间长，成本也相对较高。SSCP (DNA单链构象多态性)则是PCR技术与 DNA变性结合而产生的标记，它检测的扩增片段内部序列的差异，但检测的片段长度较短， 而且检测的敏感性也有待提高。随着测序技术的应用，Lander于1996年提出了 SNP(单核苷酸多态性)标记，SNP数量极多，遗传稳定性高于SSR，也可以进行高通量筛查，但建立SNP 标记需要做大量的前期工作，如测序、筛选等，因测序错误产生的SNP也难以确定。2001年 Li等发展了一种基于PCR的新型分子标记SRAP (相关序列扩增多态性)，在SRAP的基础上 Hu与Vick于2003年提出了 TRAP (靶位区域扩增多态性)标记，TRAP的任意引物与SRAP 所用的一样，固定引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来。这两种标记的优点是操作简便、产量中等、条带易于分离和测序，但也存在一个共同缺陷起始退火温度较低，可能产生假阳性。此外，还有一些针对上述某些标记改进而建立的衍生标记，如由从RFLP转化而来的CAPS (切割扩增多态性序列)和STS (序列标签位点)标记，由RAPD标记转化而来的 SCAR(序列特异性扩增区)等。由上所述可见，自上世纪九十年代以来，分子标记技术不断发展，新的标记不断出现，但现有的标记仍有一些缺陷，因此，开发简便、快速、稳定性高的新标记方法十分必要
本发明提供了一种基于RNA聚合酶结合位点的原核生物分子标记方法，该方法简便、快速、稳定。一种基于RNA聚合酶结合位点的原核生物分子标记方法，包括根据原核生物RNA 聚合酶结合位点设计并合成引物，提取原核生物基因组DNA作为模板，利用所设计的引物和所提取的DNA进行降落PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后检测原核生物RNA聚合酶结合位点间区的差异。所述的引物包括正向引物和反向引物。所述正向(前)引物是基于原核生物基因组启动子中-35区域的一段共同序列TTGACA设计的，引物序列长18bp，5’端的前Ilbp是一段填充序列，无任何特异组成，接着是TTGACA序列，这17bp组成核心序列，随后为3’端的1个选择性碱基。所述反向(后)引物是基于原核生物基因组中启动子- ο区域(又称 Pribnow区)的一段保守序列TATAAT设计的，引物序列长18bp，5，端的前Ilbp是一段填充序列，无任何特异组成，接着是TATA序列，这15bp组成核心序列，随后为3’端的3个选择性碱基。所述正向引物序列为5，GACTGCGTACGTTGACAN 3，，N = A/T/G/C ；所述反向引物序列为5，GACTGCGTACGTATANNN 3，，N = A/T/G/C。优选的技术方案中，所述降落PCR扩增的条件为94°C变性:3min，然后按94°C变性 30s、56°C退火45s、72°C延伸90s进行20个循环，每个循环退火温度降低1°C，退火温度降到36°C ；再按94°C变性30s、36°C退火45s、72°C延伸90s进行15个循环，最后在72°C延伸 10min，4°C 保存。本发明中，所述扩增产物经凝胶电泳分离后检测，是指将扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染，用扫描仪扫描或BiO-Rad成像系统拍照，保存图像和记录结果。本发明中，所述正向引物和反向引物可任意组合，通过降落PCR扩增，得到原核生物基因组启动子区域中RNA酶结合位点间序列的PCR产物，从而检测启动子保守序列间区的差异。这种标记在原核生物基因组中的位置已知，特异性高，数量丰富，几乎可覆盖整个基因组，操作简便、稳定性高、重复性好、条带易于分离和可测序，可应用于原核生物的遗传、种质鉴定、多样性分析、基因组学及辅助育种等研究。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果(1)本发明的基于RNA聚合酶结合位点的原核生物分子标记方法中，引物针对RNA 聚合酶结合位点高度保守序列设计，在扩增时采用的是降落PCR，克服了 SRAP和TRAP因起始退火温度较低而可能产生假阳性的缺陷，特异性高；(2)本发明的分子标记在基因组中的位置已知，数量丰富，几乎可覆盖整个基因组；(3)本发明的分子标记方法操作简便、条带易于分离并可测序，还具有稳定性高、 重复性好的优点。图1为2对引物组合(F1/R1和F2/R2)对3种植物(水稻、蚕豆、莴苣)根际土壤微生物DNA的重复扩增效果图。 图1中，泳道M为DNA分子量，左侧的数字(100bp、200bp、300bp)表示DNA片段的大小；泳道1、2、3分别为水稻、蚕豆和莴苣根际土壤DNA的扩增产物。根据图1的结果可见采用本发明基于RNA聚合酶结合位点的原核生物分子标记方法，可有效鉴别水稻、蚕豆和莴苣3种植物根际土壤微生物的遗传差异，重复结果稳定。

本发明公开了一种基于RNA聚合酶结合位点的原核生物分子标记方法，根据原核生物RNA聚合酶结合位点设计并合成引物，提取原核生物基因组DNA作为模板，利用所设计的引物和所提取的DNA进行降落PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后检测原核生物RNA聚合酶结合位点间区的差异。本发明分子标记方法特异性高，数量丰富，操作简便、稳定性高、重复性好、条带易于分离和可测序，可应用于原核生物的遗传、种质鉴定、多样性分析、基因组学及辅助育种等研究。