水稻OsPAR1蛋白及其编码基因在调控植物百草枯抗性中的应用的制作方法[0002]百草枯(paraquat,I, I，-dimethyl-4, 4，-bipiridyl ； I, I，_ 二甲基-4, 4，-联批叮，分子量257.2)是一种非选择性的速效触杀型除草剂，它是继草甘磷之后的第二大除草剂。百草枯被广泛应用于防除各种一年生杂草；对多年生杂草有强烈的杀伤作用，但其地下茎和根能萌出新枝；对已木质化的棕色茎和树干无影响。同时，百草枯还适用于防除果园、桑园、胶园及林带的杂草，也可用于防除非耕地、田埂、路边的杂草，对于玉米、甘蔗、大豆以及苗圃等宽行作物，可采取定向喷施百草枯来防除杂草。百草枯自上世纪六十年代由原英国卜内门化学工业有限公司(ICI)研究开发，迄今在农业种植中的广泛应用已经有50多年的历史，目前在世界范围内有100多个国家使用百草枯。百草枯在1984年首次被引进中国市场，自上世纪90年代以来，随着农业生产技术的发展，我国很多农药企业先后开始大量生产百草枯原药，目前百草枯已经在我国的农业生产得到广泛应用。[0003]百草枯为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，植物对其吸收极其迅速，叶片接触百草枯以后，有效成分对叶绿体层膜破坏力极强，使光合作用和叶绿素合成很快中止，叶片着药后2-3小时即开始受害变色，百草枯对单子叶和双子叶植物绿色组织均有很强的破坏作用。在光下生长的植物中，百草枯主要作用于其叶绿体，叶绿体含有绿色植物的光合系统，能吸收光能并制造糖分。百草枯作用于光系统I (photosystem I )的光合膜系统,该系统能产生自由电子以推动 光合作用。光系统I产生的自由电子与百草枯离子发生反应，产生自由基结构。氧可以迅速将这些自由基还原，并在这一过程中产生过氧化物。产生的过氧化物具有极高的化学活性，它能攻击不饱和膜脂肪酸，迅速打开并分解细胞膜及组织。百草枯离子与自由基的反应过程中会反复产生更多的过氧化物，直至停止产生自由电子，植物将迅速枯萎死亡。因此，百草枯是光合作用的一种电子传递抑制剂。在光系统I中它还能竞争性地抑制NADP的还原，还原后的百草枯迅速再氧化产生一系列的超氧化物阴离子，活性氧自由基的毒害能引起脂质的过氧化反应和细胞膜的损伤。
[0004]本发明的目的是提供水稻OsPARl蛋白的新用途。该蛋白的氨基酸序列如序列表序列I所示，所述新用途即所述蛋白可用于调控目的植物的百草枯抗性，或调节序列表序列I所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物叶片的百草枯抗性。[0005]本发明提供一种发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及位于所述茎环序列两侧的序列A和序列B组成，所述序列A与所述序列B反向互补；所述序列A为序列表序列I所示蛋白的编码基因中200-500bp DNA转录得到的RNA序列。[0006]所述蛋白的编码基因中的200_500bp的DNA中含有所述蛋白的编码基因的5’UTR区或3’ UTR区的部分或全部。[0007]所述蛋白的编码基因具体可为序列表序列2所示的DNA分子，其中，所述5’UTR区为序列表序列2的自5’末端第I位至第127位核苷酸；所述3’ UTR区为序列表序列2的自5’末端第1781位至第2202位核苷酸。[0008]所述序列A具体可为序列表中序列3的自5’末端第I位至第430位核苷酸序列。
[0009]所述茎环序列具体可为序列表中序列3的自5’末端第431位至第908位核苷酸序列。
[0010]由上述任一所述发夹RNA衍生的小干扰RNA也属于本发明的保护范围。
[0011]本发明提供上述任一所述RNA (发夹RNA或小干扰RNA)的编码基因。
[0012]所述RNA的编码基因可为如下I)或2)的DNA分子:
[0013]I)式I所示的DNA片段，(I) SEQ正向-X-SEQ反向，
[0014]所述SEQtt是序列表序列2中包括第1763位至第2192位的核苷酸段，
[0015]所述SEQg的序列与所述SEQtt的序列反向互补，
[0016]所述X是所述SEQm与所述SEQg之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互补；
[0017]2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋白表达的DNA分子。
[0018]所述SEQ1^1的核苷酸序列具体可为序列表序列2中第1763位至第2192位核苷酸序列。
[0019]本发明保护下述3)或4)的DNA分子:
[0020]3)其核苷酸序列为序列表序列2的第1763位至第2192位核苷酸段；
[0021]4)在严格条件下与3)限定的DNA序列杂交的DNA分子。
[0022]本发明保护含有上述任一所述RNA的编码基因或DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
[0023]所述重组载体具体可为载体pTCK303-0sPARl_RNAi，所述载体pTCK303-0sPARl-RNAi为在载体pTCK303的SpeI和Kpn I的位点间插入了序列表序列4所示的DNA片段。
[0024]本发明提供一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表达，得到百草枯抗性高于所述目的植物的转基因植物。
[0025]所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表达可通过将上述任一所述RNA的编码基因导入目的植物中表达上述任一所述RNA实现；
[0026]所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；
[0027]所述单子叶植物具体为水稻。
[0028]本发明还提供另一种培育转基因植物的方法，是将序列表序列I所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到百草枯抗性低于所述目的植物的转基因植物；
[0029]所述序列表序列I所示蛋白的编码基因可为如下5) -9)中任一所述基因:
[0030]5)序列表序列5所示的DNA分子；[0031]6)序列表序列2中第128位至1780位所示的DNA分子；
[0032]7)序列表序列2所不的DNA分子；
[0033]8)与5)或6)或7)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0034]9)在严格条件下与5)或6)或7)或8)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0035]所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；
[0036]所述单子叶植物具体为水稻。
[0037]所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.1 X SSC,
0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 1XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0038]实验证明，过表达株系在0.5 μ M百草枯浓度下就有白化的表型且叶绿素含量明显下降，野生型在5μ M百草枯浓度下会出现白化表型且叶绿素含量明显下降，而干扰株系在0.5 μ Μ^5 μ M百草枯浓度下无白化表型且叶绿素含量无明显变化。两叶一心期，使用200 μ M百草枯水溶液对水稻叶片进行喷洒(每200cm2面积内喷洒15mL)，2天后干扰株系植株叶片大部分都保持绿色，叶绿素分解较少；野生型植株部分叶片发白枯死；过表达株系植株叶片全部发白枯死。与野生型植株叶片相比，过表达株系植株分蘖期离体叶片经100 μ M百草枯水溶液浸泡后叶绿素降解明显。本发明为提高植物百草枯抗性或培育抗百草枯作物品种提供了一种新的途径，在农业生产上具有重要意义。



[0039]图1为转基因水稻的PCR鉴定电泳图。其中，M为分子量标准，Vect为载体pTCK303阳性对照。
[0040]图2为转基因水稻的实时荧光定量PCR检测结果。其中，图B为对图A中野生型和干扰株系的放大图。
[0041]图3为转基因水稻的芽期对不同浓度百草枯水溶液的敏感性表型。
[0042]图4为不同浓度百草枯水溶液处理后的转基因水稻叶绿素含量结果。
[0043]图5为转基因水稻在两叶一心期对百草枯的抗性表型。
[0044]图6为分蘖期转基因水稻离体叶片的百草枯抗性表型。其中，图A为野生型水稻和过表达株系的对比图，图B为野生型水稻和干扰株系的对比图。
[0045]图1-6中，WT为野生型水稻日本晴，0X1和0X2为过表达株系，L1、L2和L3为干扰株系。
[0046]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048]野生型水稻日本晴(OryzaSativa L.cv.Nipponbare):参考文献:SaotomeA, Kimura S，Mori Y, Uchiyama Y, Morohashi K, SakaguchiK..Characterization of fourRecQ homologues from rice(Oryza sativa L.cv.Nipponbare).BiochemBiophys ResCommun.2006, 345(4): 1283-1291.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0049]载体pTCK303:参考文献:Wang, Z.，Chen, C.B.，Xu, Y.Y.，Jiang, R.X., Han, Y., Xu, Z.Η., and Chong, K.A practical vector for efficient knockdown ofgene expression in rice (Oryza sativa L.).Plant Mol Biol Rep, 2004, 22, 409-417.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0050]实施例1、水稻OsPARl蛋白及其编码基因的获得
[0051]拟南芥中AtPARl基因突变体会导致拟南芥增加对百草枯的抗性。根据NCBI提供的拟南芥和水稻的PARl同源基因序列，利用DNAMAN软件对其进行进化树分析，选取与拟南芥AtPARl (Atlg31830)同源关系最近的水稻基因0s03g0576900，命名为OsPARl，其基因组序列如序列表序列5所示，全长cDNA序列如序列表序列2所示，其中自序列表序列2的第128位至1780位为开放阅读 框，编码序列表序列I所示的蛋白OsPARl。
[0052]实施例2、水稻OsPARl基因过表达载体的构建
[0053]以野生型水稻日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的基因组DNA为模板,用引物Fl和BI进行PCR扩增，得到5.3kb的PCR产物，将该PCR产物纯化后，与经过EcoRV酶切的载体pBluescript SK (默克公司，ST212205)的载体骨架片段连接，获得重组载体SK-OsPARl,经测序证实,重组载体SK-OsPARI是在载体pBluescript SK的EcoRV位点间插入了序列表序列5的第1-5289位所示的序列。
[0054]将重组载体SK-OsPARI用BamH I和Nhe I双酶切，回收5.3kb的片段，与经过BamH I和Nhe I双酶切的植物诱导表达载体pTCK303的载体骨架片段连接，获得重组载体pTCK303-0sPARl，经测序证实，重组载体pTCK303_0sPARl是在载体pTCK303的BamH I和Nhe I位点间插入了序列表序列5第1-5289位所示的序列。
[0055]上述引物的序列如下:
[0056]引物Fl:5’-GGATCCAACCCAACTATTACCAACAA-3’ (带下划线的碱基为限制性内切酶BamH I识别序列)；
[0057]引物BI:5’-GCTAGCAGCAGAACGTATCCTACACA-3’ (带下划线的碱基为限制性内切酶Nhe I识别序列)。
[0058]实施例3、水稻OsPARl基因RNAi重组表达载体的构建
[0059]提取野生型水稻日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，用引物F2和B2进行PCR扩增，得到430bp左右的扩增产物，将该产物回收纯化后，与经过EcoRV双酶切的载体pBluescript SK的载体骨架片段连接，获得重组载体SK-OsPARl-RNAi,经测序证实,重组载体SK-OsPARl-RNAi是在载体pBluescriptSK的EcoRV位点间插入了序列表序列2的第1763位至2192位的序列。
[0060]上述引物的序列如下:[0061]引物F2:5’-GGGGTACCACTAGTATCCCACTTGTGTGCTGACC-3’ (带下划线的碱基为限制性内切酶Kpn I和Spe I识别序列);
[0062]引物B2:5’ -CGGGATCCGAGCTCAGCGGAATGGAATTGACTGA-3’ (带下划线的碱基为限制性内切酶BamHI和Sac I识别序列)。
[0063]将重组载体SK-OsPARl-RNAi用SpeI和SacI双酶切，回收430bp左右的酶切片段(命名为SEQ1^1),与经过SpeI和SacI双酶切植物诱导表达载体pTCK303的载体骨架片段连接，将DNA片段沿着SpeI到SacI的方向连接到pTCK303的SpeI和SacI位点间获得中间载体；将重组载体SK-OsPARl-RNAi用Kpn I和BamHI双酶切，回收430bp左右的酶切片段，与经过Kpn I和BamHI双酶切中间载体的载体骨架片段连接，将DNA片段沿着Kpn I到BamHI的方向连接到pTCK303的KpnI和BamHI位点间获得水稻OsPARl基因RNAi重组表达载体pTCK303-0sPARl-RNAi，经测序证实，载体pTCK303-0sPARl-RNAi的SpeI和Kpn I的位点间插入了序列 表序列4所示的DNA片段，其中，自序列表序列4的第1-430位为SEQ1^1片段，第431-908为间隔片段，第909-1338位为反向互补片段(命名为SEQi^片段)。
[0064]序列表序列4所示的DNA片段编码序列表序列3所示的具有茎环结构的发夹RNA(其中，自序列表序列3的第1-430位(序列A)与第909-1338位(序列B)的序列互补，第431-908为茎环序列)，可产生20bp左右的小干扰RNA，该小干扰RNA再与目的基因OsPARl的mRNA结合，最终沉默OsPARl的表达。
[0065]实施例4、利用重组载体培育转基因水稻
[0066]1、转基因水稻的获得
[0067]按照文献Hiroaki Saika, Wataru Sakamoto, Masahiko Maekawa, SeiichiToki, Highly efficient visual selection of transgenic rice plantsusinggreen fluorescent protein or anthocyanin synthetic genes.PlantBiotechnology.2011，28，107 - 110.的方法，将pTCK303、实施例2的得到重组载体pTCK303-0sPARl和实施例3的得到重组载体pTCK303_0sPARl-RNAi分别利用根癌农杆菌EHA105 (Biovector C0.，LTD, Biovector-375)介导转化野生型水稻日本晴成熟胚来源的愈伤组织，经过共培养、筛选、分化和生根培养，分别获得Ttl代转空载体pTCK303的转基因水稻(命名为转空载体对照株系)3株，T0代转pTCK303-0sPARl的转基因水稻(命名为过表达株系)2株，T0代转pTCK303-0sPARl-RNAi的转基因水稻(命名为干扰株系)8株。
[0068]T0代表示转基因当代植株，T1代表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
[0069]2、转基因水稻植株的PCR鉴定
[0070]取步骤I的转空载体对照植株、过表达株系植株和干扰株系植株的叶片基因组DNA，用引物 5’ -TTTCTATCGCGTATTAAA-3’ 和 5’ -TGGCAATAAAGTTTCTTA-3’ PCR 扩增 NOS 终止子序列，预测产物大小为175bp，扩增的靶序列DNA序列如下序列:
[0071 ] 5’-TTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCA-3’，结果全部为阳性，部分扩增结果如图1所示。[0072]通过对转基因株系后代的PCR鉴定，将得到的上述株系中纯合阳性转基因后代进行下述步骤3和4的检测。
[0073]3、转基因水稻植株的荧光实时定量RT-PCR检测
[0074]取按步骤2的PCR鉴定为阳性的T2代纯合转空载体对照株系植株、过表达株系植株(株系编号为0X1、0X2)和干扰株系植株(株系编号为L1、L2和L3),以野生型水稻日本晴(WT)为对照，提取总RNA，反转录获得cDNA，用引物qF和qB进行荧光实时定量RT-PCR，以Actinll为内参,每个株系30株，实验重复三次，结果如图2所示。
[0075]上述引物qF和qB的序列如下:
[0076]引物qF:5’ -CCGAATCGAACCCTCAAGATG-3’(对应序列表序列 2 的第 919-939 位)；
[0077]引物qB:5’ -CGTCCAGAACTCCCGAACAACT-3’(对应序列表序列 2 的第 1144-1165位)；
[0078]上述Actinll的引物序列如下:
[0079]ACTIN2F:5’-TACTGTGTCTGGATAGGAGGGTC-3’ ；
[0080]ACTIN2B: 5，-ACCAACAATCCCAAACAGAGTAG-3，。
[0081]图2的结果表明，过表达株系中目的基因OsPARl的表达量明显高于野生型对照植株，分别为野生型的40倍和80倍；干扰株系中目的基因OsPARl的表达量明显低于野生型对照植株，为野生型的1/10 ;转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
[0082]4、转基因水稻植株的百草枯抗性鉴定
[0083]取按步骤2的PCR鉴定为阳性的1~3代纯合转空载体对照株系种子、过表达株系0X1和0X2种子和干扰株系L1、L2和L3种子，以野生型水稻日本晴(WT)为对照，按照如下方法进行处理(每个处理每个株系25株，实验重复三次):
[0084]I)芽期对百草枯敏感性分析
[0085]42°C催芽2天，然后30°C、16小时光照条件下，置于不同浓度百草枯水溶液(百草枯浓度分别为(^1、0.54 1、14 1、24 11和54 10中培养15天后，拍照，同时进行叶绿素含量测定，结果图3和图4所示。
[0086]上述叶绿素含量测定参考文献“Lichtenthaler HK.Chlorophyllsand carotenoids - pigments of photosynthetic biomembranes.MethodsEnzymol.1987，148:350-382”进行，具体如下:
[0087]选择种苗部分，称量鲜重并记录，再使用钢珠打碎小苗,加入100%的乙醇抽提3小时，取上清液，以100%的乙醇为参比溶液，利用BECKMAN COULTER公司的DU800分光光度计测定645nm和663nm下萃取液的吸光值，用以下公式进行计算叶绿素含量:叶绿素含量(mg/L) = (20.2 X A645nm + 8.02 X A663J X 稀释倍数。
[0088]结果表明:过表达株系在0.5 μ M百草枯浓度下就有白化的表型且叶绿素含量明显下降，野生型在5μ M百草枯浓度下会出现白化表型且叶绿素含量明显下降，干扰株系无白化表型且叶绿素含量无明显变化；转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
[0089]2)两叶一心期对百草枯的抗性分析
[0090]水培至两叶一心期,使用200 μ M百草枯水溶液对水稻叶片进行喷洒,喷洒量为每200cm2面积内喷洒15mL，2天后，观察植株叶片表型，结果如图5所示。[0091]结果表明:干扰株系植株叶片大部分都保持绿色，叶绿素分解较少；野生型植株部分叶片发白枯死；过表达株系植株叶片全部发白枯死；转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
[0092]3)离体叶片对百草枯的抗性分析
[0093]大田种植至分蘖期，取同一时期的第一片新叶，剪成2cm小段，分别用水和100 μ M百草枯水溶液浸泡48小时，拍照，结果如图6所示。
[0094]结果表明:与野生型植株叶片相比，干扰株系植株离体叶片叶绿素降解较少，而过表达株系植株离体叶片中的叶绿素降解较多，说明过表达株系更敏感，转空载体对照株系植株与野生型对照结果无显著差异。
[0095]实施例4的结果表明，水稻OsPARl蛋白及其编码基因具有调控植株百草枯抗性的功能。过表达OsPARl，可降 低转基因植物的百草枯抗性；抑制OsPARl的表达可提高转基因植物的百草枯抗性。