专利名称：用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长因子-i和胰岛素样生长因子-ii的制作方法IGF-I是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是由肝产生的肽并在具有三个分子内ニ硫键的单链中包含70个氨基酸。IGF-I的分子量为约7，649Da，并且在血清中是高度蛋白结合的。通过生长激素刺激产生并可由于营养不足、生长激素不敏感性、缺乏生长激素受体或下游信号传导途径故障而阻止产生。IGF-I在儿童生长中起重要的作用并在成人中持续具有合成代谢作用。胰岛素样生长因子II (IGF-II)也是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是包含67个氨基酸的单链肽。IGF-II分子量为约7，505Da,并且在血清中是高度蛋白结合的。IGF-II在与生长激素相关病症的临床评估中用作胰岛素样生长因子I (IGF-I)的辅助物(adjunct)。IGF-II通过与IGF-I和不同細胞表面受体相互作用并使结合蛋白循环以调节组织生长，主要在胎儿生长和发育中起作用。由于生长激素缺乏或营养不良，IGF-II在儿童和成人中的水平降低。在肢端巨大症或IGF-I的外源给药可观察到増加的IGF-II血清水平。因此，测量循环的IGF-II水平(即血浆/血清中)是控制数种生长激素相关病症的重要工具。另外，在各种流行病学研究領域和临床试验中测量循环IGF-II也是有价值的工具。已经证实用“颠倒(bottmom up) ”方法(即，酶消化和量化ー种或多种所得肽) 量化分析IGF-I和IGF-II尤其是有挑战性的。例如，de Kock等报道典型的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶消化方法产生低的消化产量和非特异性酶卵裂。de Kock等，Rapid Commun. Mass Spectrom.，2001，15:1191-97。de Kock等建议，不令人满意的消化结果可能是因为由IGF-I的三个ニ硫键造成的蛋白水解酶的空间限制性。Id。已经努力开发分析IGF-I和IGF-II的方法，包括通过各种质谱技木。例如，已经报道了使用具有单离子监测(SIM)的LC-离子阱MS分析IGF-I。见，例如Id. ；Bobin等， Analyst, 2001, 126:1996—2001 ；禾ロ Popot 等，Chromatographia, 2001，54:737—741(Popot I)。这些參考文献公开了 SIM模式中电荷状态范围为4+至9+的完整IGF-I的LC-ESI-离子阱MS。最近，已经公开了使用多反应监测(MRM)的LC-MS/MS技木。Popot II报道使用具有SIM的LC-离子阱MS定量分析电荷状态范围为4+至9+的IGF-I，随后用LC-离子阱 MS/MS 使用 MRM 定性确认分析物。Popot 等 Anal Bioanal Chem, 2008, 390 1843-52 (PopotII)。MRM实验使用所选择的多电荷IGF-I离子(7+和8+)作为裂解实验中的前体离子。 Bredehoit等报道使用轨道阱质谱仪器定性測定IGF-I前体和产物离子的质荷比，并使用确定的离子使用LC-三重四极杆MS/MS用于随后的IGF-I定量。RredehdH等Rapid Commun. Mass Spectrom.，2008，22:477-485。类似地，已经报道了使用酶消化随后质谱分折消化产物来分折 IGF-II0 见，例如 Smith 等，J. Biol. Chem.，1989，16:9314-9321 ；和 Bayne 等 Peptide Research, 1990,6:271-273。已经报道了用于分析完整 IGF-II 质谱检测的其他研究。见，例如，Hampton 等 J. Biol. Chem.，1989, 32:19155-19160 ； Hayne %= J.Chromatog. 1991, 52:391-402 ；Waaensten Φ Biotech.and App. Biochem. , 1991，13:412—421 Jespersen 等 J. MassSpectrom. , 1996, 31:893-900 ；禾口 Nelson 等J. Proteome, 2004，3:851-855。这些參考文献报道用等离子体脱附和MALDI-T0F质谱技术检测完整的IGF-II。Hampton等检测范围从1+至3+的电荷状态。除了 Hampton等之外都检测到1+电荷状态的IGF-II。
本文描述的方法是用高分辨率/高准确度质谱法质谱测定样品中胰岛素样生长因子I (IGF-I)蛋白和/或胰岛素样生长因子II (IGF-II)蛋白的量。该方法具有简化的预分析步骤，其仅仅任选地包括蛋白质裂解、消化和/或检测蛋白质片段。优选地，样品收集后不进行一种或多种完整蛋白的裂解或消化。在本发明的第一方面，通过质谱法测定样品中IGF-I蛋白或其片段的量，所述质谱法包括使来自样品的IGF-I蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的ー种或多种IGF-I 离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定ー种或多种IGF-I离子的量。 所測定的ー种或多种IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白或其片段的量相关。在一些实施方式中，IGF-I蛋白或其片段源于样品。在一些实施方式中，IGF-I蛋白或其片段是完整的长R3IGF-I或其片段。在一些实施方式中，IGF-I蛋白是完整的长R3IGF-I。第二方面，通过质谱法测定样品中IGF-II蛋白或其片段的量，所述质谱法包括将样品中的IGF-II蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的ー种或多种IGF-II离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定ー种或多种IGF-II离子的量。所測定的一种或多种IGF-II离子的量与样品中IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选地，IGF-II蛋白源于样品并且是完整的。第三方面，IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段的量通过质谱法同时测定，所述质谱法包括将来自样品的IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的ー种或多种IGF-I离子和ー种或多种IGF-II离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定ー种或多种IGF-I离子和ー种或多种IGF-II离子的量。所測定的IGF-I和IGF-II离子的量与样品中IGF-I和IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选地，IGF-I和IGF-II蛋白源于样品并且是完整的。在一些实施方式中，样品可在电离之前通过固相提取(SP^纯化。在一些实施方式中，样品可在电离之前通过高效液相色谱法(HPLC)纯化。在相关实施方式中，样品可在电离之前用SPE和HPLC两者纯化，并且纯化可任选地用联机处理进行。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法用大于或等于约10，000的分辨本领(FWHM)进行，如大于或等于约15，000,如大于或等于约20，000,如大于或等于约25，000。 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法以小于或等于约50ppm的准确度进行，如小于或等于约20ppm，如小于或等于约lOppm，如小于或等于约5ppm ；如小于或等于约3ppm。 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法以大于或等于约10，000的分辨本领(FWHM) 和小于或等于约50ppm的准确度进行。在一些实施方式中，分辨本领大于约15，000并且准确度小于或等于约20ppm。在一些实施方式中，分辨本领大于或等于约20，000并且准确度小于或等于约IOppm ；优选地分辨本领大于或等于约25，000并且准确度小于或等于约 5ppm，如小于或等于约3ppm。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法可用轨道阱质谱仪、飞行时间 (TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时候称为傅里叶变换质谱仪)进行。 在一些实施方式中，样品可包括生物学样品；优选血浆或血清。在一些实施方式中，通过质谱法可检测的ー种或多种IGF-I离子是选自m/z在 850. 8士2、957. 1 士2、1093. 7士2和1275. 8士2范围内的离子的ー种或多种离子。这些范围内的离子分别对应于电荷为9+、8+、7+和6+的IGF-I离子，并主要落在所述的m/z值士 1的范围内。优选地ー种或多种IGF-I离子包括选自m/z在957. 1 士2和1093. 7士2范围内的 IGF-I离子的ー种或多种离子。1093. 7士2范围内IGF-I离子优选地包括选自具有下列m/ ζ 的 IGF-I 离子的ー种或多种 IGF-I 离子约 1091. 94士0. 1,1092. 80 士0. 1,1092. 94士0. 1、 1093. 09 + 0. 1, 1093. 23 + 0. 1, 1093. 37 + 0. 1 , 1093. 52 + 0. 1, 1093. 66 + 0. 1,1093.80 + 0. 1, 1093. 95 + 0. 1 , 1094. 09 + 0. 1, 1094. 23 + 0. 1, 1094. 38 + 0. 1 ,1094.52士0. 1、1094. 66士0. 1和1095. 37士0. 1。在一些实施方式中，使通过质谱法检测的 ー种或多种IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白的量相关联包括与内标比较；如人IGF-I 蛋白或非人IGF-I蛋白(例如，完整重组小鼠重组小鼠IGF-I)。内标可任选地被同位素标记。在一些实施方式中，质谱法可检测的ー种或多种IGF-II离子是选自具有下列m/ ζ 范围的 IGF-II 离子的ー种或多种 IGF-II 离子约 934. 69士2、1068. 07士2、1245. 92士2 和1494. 89 士 2。这些范围内的离子分别对应于具有电荷8+、7+、6+和5+的IGF-II离子， 并且主要落在所述的m/z值士 1的范围内。优选地ー种或多种IGF-II离子包括选自具有下列 m/z 的 IGF-II 离子的 IGF-II 离子约 1067. 36士0. 1,1067. 51 士0. 1,1067. 65士0. 1、1067.80 + 0. 1 , 1067. 94 + 0. 1, 1068. 08 + 0. 1, 1068. 23 + 0. 1, 1068. 37 + 0. 1 ,1068.51 士0. 1,1068. 65士0. 1,1068. 80士0. 1,1068. 94士0. 1 和 1069. 08士0. 1 ；优选地，一种或多种IGF-II离子选自具有下列m/z的离子约1067. 94士0. 1和1068. 08士0. 1。在一些实施方式中，使通过质谱法检测的ー种或多种IGF-II离子的量与样品中IGF-II蛋白的量相关联包括与内标比较；如人IGF-II蛋白或非人IGF-II蛋白(例如，完整重组小鼠 IGF-II)。在一些实施方式中，样品中天然完整IGF-I和/或IGF-II的量通过质谱法測定， 所述质谱法包括使完整的源于样品并通过固相提取(SPm和高效液相色谱法(HPLC)纯化的IGF-I和/或IGF-II，在适合产生质谱法可检测的ー种或多种IGF-I和/或IGF-II离子的条件下电离。如果天然完整IGF-I的量被測定，ー种或多种IGF-I离子包括选自具有下列范围内m/z的IGF-I离子的ー种或多种IGF-I离子约850. 8士2、957. 1 士2、1093. 7士2 和1275. 8士2。如果天然完整IGF-II的量被測定，ー种或多种IGF-II离子包括选自具有下列范围内m/z的IGF-II离子的ー种或多种IGF-II离子约934. 69士2、1068. 07士2、 1M5. 92士2和1494. 89士2。再一次，对于IGF-I和IGF-II，上述范围内的离子主要落在所述的m/z值士 1的范围内。ー种或多种IGF-I和/或IGF-II离子接着通过高分辨率/高准确度质谱法測定；其中ー种或多种IGF-I和/或IGF-II离子的量用于测定样品中天然完整IGF-I和/或IGF-II的量。在这些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法用轨道阱或 TOF质谱仪进行，并且SPE和HPLC可以以联机方式进行。上面列出的实施方式的特征可以没有限制地在本发明的方法中结合使用。在某些优选的实施方式中，质谱法以阳离子模式进行。可选地，质谱法以阴离子模式进行。本文描述的方法中使用的优选的电离技术是电喷雾电离(ESI)。电喷雾电离可以例如用热的电离源进行。在优选的实施方式中，一种或多种分别可检测的内标提供在样品中，其在样品中的量也被測定。在这些实施方式中，两种关注的分析物和一种或多种内标的所有或部分被电离以产生多个质谱仪可检测的离子，并且通过质谱法检测从每种物质产生的ー种或多种离子。内标可选自完整的非人IGF-I (例如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠 IGF-I)、同位素标记的完整人IGF-I蛋白、完整的非人IGF-II蛋白(例如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠IGF-II)和同位素标记的完整人IGF-II蛋白。在其他实施方式中，样品中完整的IGF-I和/或IGF-II蛋白的量可通过与ー种或多种外部參考标准进行比较而被測定。示例性外部參考标准包括用同位素标记的或未标记的、完整人或非人IGF-I和/或IGF-II蛋白(例如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠IGF-I和或IGF-II)掺入的空白血浆或血清。在一些实施方式中，包括来自两种或多种分子同位素形式的分析物的质谱峰的同位素“签字”可用于确认被研究分析物的同一性。在其他实施方式中，来自ー种或多种同位素形式的质谱峰可用于量化关注的分析物。在ー些相关实施方式中，来自ー种同位素形式的单个质谱峰可用于量化感兴趣的分析物。在其他相关实施方式中，多个同位素峰可用于量化分析物。多个峰可经历任何合适的数学处理。数种数学处理是本领域已知的，包括但不限于对多重峰下面积的求和，或平均多重峰的响应。如本文所使用，除非另外指出，単数形式“ー个(a)”、“ー个(an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“蛋白质”包括多个蛋白质分子。如本文所使用，术语“IGF-I蛋白”指全长IGF-I多肽或其片段，以及全长IGF-I 变体的多肽或其片段。IGF-I变体包括，例如长R3IGF-I，其是IGF-I的83个氨基酸的类似物，其包括完全的人IGF-I序列——在3位(因此R3)具有Arg (R)对Glu (E)的取代，和在 N末端的13个氨基酸延伸肽(extension peptide)。为了提高IGF-I肽的生物活性，已经生产了 IGF-I的该类似物。该类似物的质量为约9111.4道尔顿，因此多电荷长R3IGF-I离子可观察到具有的m/z比为约1014. 1 士 1、1140. 7士 1、1303. 5士 1禾ロ 1520. 6士 1。本领域技术人员容易理解其他IGF-I变体多肽，包括例如已经被化学改性的全长IGF-I多肽或其片段。示例性化学改性可包括减少ー个或多个ニ硫键或烷基化一个或多个胱氨酸。这些示例性化学改性导致IGF-I变体多肽的质量相对于对应的未改性IGF-I多肽的质量増加。减少一个或多个ニ硫键产生分子质量相对较少的改变，所得质荷比落在本文描述的质荷比范围内。导致质量偏离未改性的IGF-I多肽的其他化学改性也包括在IGF-I蛋白的意义之内。 本领域技术人员理解通过化学改性添加原子至IGF-I蛋白导致观察到质谱法期间质荷比的増加。因此，化学改性产生的IGF-I蛋白变体包括在IGF-I蛋白的意义内并根据本发明的方法可检测。如本文所使用，术语“IGF-II蛋白”指全长IGF-II多肽或其片段，以及全长IGF-II 变体多肽或其片段。本领域技术人员容易理解IGF-II变体多肽，包括例如已经被化学改性的全长IGF-II多肽或其片段。示例性化学改性可包括减少ー个或多个ニ硫键或烷基化一个或多个胱氨酸。这些示例性化学改性导致IGF-II变体多肽的质量相对于对应的未改性 IGF-II多肽的质量増加。减少ー个或多个ニ硫键产生分子质量相对较少的改变，所得m/z 落在本文描述的m/z范围内。导致质量偏离未改性的IGF-II多肽的其他化学改性也包括在IGF-II蛋白的意义之内。本领域技术人员理解通过化学改性添加原子至IGF-II蛋白导致观察到质谱法期间质荷比的増加。因此，化学改性产生的IGF-II蛋白变体包括在IGF-II 蛋白的意义内井根据本发明的方法可检测。如这里所使用，术语“完整”当描述多肽时指全长(即，未裂解的)多肽。例如，完整IGF-I是包含70个氨基酸残基的多肽，并且完整长R3IGF-I是IGF-I的83个氨基酸的类似物，其包括全部人IGF-I序列——在3位具有Arg (R)对Glu (E)的取代(因此R3)，和在 N末端的13个氨基酸延伸肽。非完整形式的IGF-I和/或IGF-II蛋白(S卩，片段)也可通过本文描述的方法检测。例如，具有约1，000道尔顿或更大分子量的IGF-I和/或IGF-II 蛋白片段可通过本文描述的方法检测，如约1500道尔顿或更大，如约2000道尔顿或更大， 如约2500道尔顿或更大，如约3000道尔顿或更大，如约4000道尔顿或更大，如约5000道尔顿或更大，如约6000道尔顿或更大、如约7000道尔顿或更大。术语“纯化”(“purification”或“purifying”)指相对于样品中可能干扰关注分析物检测的其他组分富集一种或多种关注分析物的量的方法。虽然不是必须的，“纯化” 可完全清除所有干扰成分，或甚至除了关注分析物之外的所有材料。通过多种方法纯化样品可使ー种或多种干扰物质——例如可能干扰或可能不干扰通过质谱法(质谱分析法)检测选择的母离子或子离子的一种或多种物质——相对減少。当使用该术语吋，相对减少并不要求在待被纯化的物质中与关注分析物一起存在的任何物质通过纯化被完全除去。术语“样品，，指可包含关注分析物的任何样品。如本文所使用，术语“体液”意思是指可从个体的身体分离的任何流体。例如，“体液”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液等。在优选的实施方式中，样品包括体液样品；优选血浆或血清。术语“固相提取”或“SPE”指ー种方法，其中化学混合物由于溶解或悬浮在溶液 (即，流动相)中的组分对溶液所经过或围绕的固体(即，固相)的亲和カ被分成组分。在一些情况下，随着流动相经过或围绕固相，不需要的流动相组分可被固相保留，导致流动相中分析物的纯化。在其他情况下，分析物可被固相保留，允许不期望的流动相组分经过或围绕固相。在这些情况下，第二流动相接着用于洗脱保留的分析物离开固相用于进ー步处理或分析。SPE可经单ー或混合模式机制操作。如本文所使用，例如，SPE可用提取柱或管如湍流液相色谱(turbulent flow liquid chromatography, TFLC)柱进行。混合的模式机制使用同一柱中的离子交換和疏水保留；例如，混合-摸式SPE柱的固相可展示强的阴离子交换和疏水保留；或可展示强的阳离子交換和疏水保留。术语“色谱法”指如此方法，其中当由液体或气体携帯的化学混合物流过固定的固相吋，由于化学个体的差別分布，它们被分离成组分。术语“液相色谱法”或“LC”意思是指当流体均勻渗滤通过细分物质的柱或通过毛细管路径时，流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的方法。延迟是当流体相对于固定相 (ー种或多种)移动时，由混合物组分在ー种或多种固定相和主体流体(即，流动相)之间的分布产生的。采用“液相色谱”的分离技术的例子包括反相液相色谱(RPLC)、高效液相色谱(HPLC)和湍流液相色谱(TFLC)(有时称作高湍流液相色谱(HTLC)或高通量液相色谱法)。在一些实施方式中，SPE柱可结合LC柱使用。例如，样品可用TFLC提取柱纯化，随后用HPLC分析柱另外纯化。术语“高效液相色谱法”或“HPLC”(有时称作“高压液相色谱法”)指通过在压力下迫使流动相通过固定相——通常为致密填充柱——増加分离程度的液相色谱。术语“湍流液相色谱法”或“TFLC” (有时称作高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)指这样的色谱法形式，其利用物质的湍流，通过作为进行分离的基础的柱填充分折物质。在通过质谱法以前，TFLC已应用于含有两种不知名药物的样品的制备。參见， 例如 Zimmer 等人，J Chromatogr A 854:23-35(1999)；也參见美国专利号 5，968，367、 5，919，368,5, 795，469和5，772，874，其进ー步解释TFLC0本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢且平稳地流动时，流体被称为“层流”。例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层流的。在层流中，流体的颗粒运动是有序的，其中颗粒大体上以直线移动。在较快的速度下，水的惯性克服了流体摩擦力，并且湍流产生。不与不规则边界接触的流体比被摩擦减慢或被不均勻表面转向的流体“移动更快(outruns)”。当流体湍流地流动时，其以旋涡和回旋(或涡流)流动，其比流动为层流时具有更大的“阻力(drag)”。许多參考文献可用于帮助确定何时流体流动为层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis Measurement and Prediction, P. S. Bernard &J. M. Wa丄lace, Jonn Wiley &Sons, Inc.，(2000) ；An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu &Julian Scott, Cambridge University I^ress O001))。术语“气相色谱”或“GC”指如此色谱法，其中样品混合物被汽化并且注入移动通过含有由液体或颗粒固体組成的固定相的柱的载气流(如氮气或氦气)中，并且样品混合物根据化合物对固定相的亲和カ被分离成其组分化合物。术语“联机(on-line)”或“在线(inline) ”，例如如在“联机自动方式”或“联机提取”中使用的，指不需要操作员介入而进行的过程。相反地，如本文使用的术语“脱机的 (off-line) ”指要求操作员手动介入的过程。因此，如果样品经历沉淀并且然后将上清液手动加载到自动采样器中，那么沉淀和加载步骤是与接下来的步骤脱机的。在该方法的不同实施方式中，一个或多个步骤可以以联机自动方式进行。术语“质谱法”或“MS”指通过其质量鉴定化合物的分析技木。MS指基于其质荷比或“m/z”的过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)电离化合物以形成帯电化合物；和( 检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的方法电离并检测。“质谱仪” 一般包括电离器和离子检测器。一般而言，一种或多种关注分子被电离，并且随后将离子引入质谱仪，在那里由于磁场和电场的組合，离子遵从空间中沿依赖于质量(“m”)和电荷(“ζ”)的路径。參见例如美国专利号6，204，500，其名称为“Mass Spectrometry From Surfaces，，；6，107，623,其名祢为“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry";6, 268, 144, ^^^^"DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry，，；6, 124，137,其名禾尔为 “Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes，，；Wright 等人，Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999，2:264-76 ；禾ロ Merchant 禾ロ Weinberger, Electrophoresis 2000，21:1164-67。如本文所使用，“高分辨率/高准确度质谱法”指用能够测量带电种质荷比的质量分析器进行的质谱法，具有足够的精确度和准确度以确认独特化学离子。当来自该离子的单个同位素峰容易分辨时，可能确认离子的独特化学离子。确认独特化学离子所需要的具体分辨本领和质量准确度随着离子的质量和电荷状态而变化。如本文所使用，术语“分辨本領”或“分辨本领(FWHM)，，(本领域也称为“m/ Δ m50%") 指观察到的质荷比除以在50%最大高度时质量峰的宽度(半宽度，极大值半处的全宽度， “FWHM”)。分辨本领的差异效果图解在图IA-C中，其显示m/z为约1093的离子的理论质谱。图IA显示来自分辨本领为约3000(常规四极质量分析器典型的操作条件)的质量分折器的理论质谱。如图IA中所显示，没有单个同位素峰是可分辨的。相较而言，图IB显示来自分辨本领为约10，000的质量分析器的理论质谱，其具有清楚可分辨的单个同位素峰。 图IC显示来自分辨本领为约12，000的质量分析器的理论质谱。在该最高分辨本领下，单个同位素峰包含离基线小于1%的分布。如本文所使用，就质谱法而言，“独特化学离子”指具有単一原子结构的单个离子。 该单个离子可以是单电荷的或多电荷的。如本文所使用，就质谱法而言，术语“准确度”(或“质量准确度”)指仪器响应与所研究离子真实m/z的可能偏差。准确度典型地表示为百万分之一(ppm)。质量准确度的差异效果图解在图2A-D中，其显示m/z为1093. 52094的理论峰所检测的m/z和真实m/z之间的可能差异的边界。图2A显示在准确度120ppm时所检测的m/z可能范围。相对照，图 2B显示在准确度50ppm时所检测的m/z的可能范围。图2C和2D显示在准确度20ppm和 IOppm时所检测的m/z的甚至更窄的可能范围。本发明的高分辨率/高准确度质谱法方法可在能够以大于10，000、15，000、 20，000、25，000、50，000、100，000或甚至更大的FWHM进行质量分析的仪器上进行。同样，本发明的方法可在能够以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更小的准确度
进行质量分析的仪器上进行。具有这些性能特点的仪器可结合某些轨道阱质量分析器、飞行时间(“T0F”)质量分析器、或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器。在优选的实施方式中，用包括轨道阱质量分析器或TOF质量分析器的仪器执行方法。术语“轨道阱”描述由外部桶样电极和同轴内部电极组成的离子阱。离子切线注入电极之间的电场，并且当离子围绕同轴内部电极轨道飞行吋，因为离子和电极之间的静电作用被离心カ平衡而使离子被捕获。当离子围绕同轴内部电极轨道飞行吋， 捕获的离子的轨道路径沿着中心电极的轴以相对于离子质荷比的谐振频率震动。探测轨道震动频率允许轨道阱被用作高准确度(低至l_2ppm)和高分辨本领(FWHM)(高至约200，000)的质量分析器。基于轨道阱的质量分析器详细描述在美国专利号 6，995，364中，通过參考以其整体并入本文。已经报道使用轨道阱分析仪用于定性和定量分析各种分析物。见，例如美国专利申请公开号2008/0118932(2007年11月9日提交)；Bredehoft 等 Rapid Commun. Mass Spectrom. , 2008, 22 477-485 ； Le Breton Φ , Rapid Commun. Mass Spectrom. , 2008, 22:3130-36;Thevis %= , Mass Spectrom. Reviews, 2008，27:35—50 ；Thomas 等，J. Mass Spectrom.，2008，43:908—15 ；Schenk 等，BMC Medical Genomics, 2008, 1:41 ；和 Olsen 等，Nature Methods，2007，4:709—12。术语“以阴离子模式操作”指其中生成并检测阴离子的那些质谱法。如本文使用的，术语“以阳离子模式操作”指其中生成并检测阳离子的那些质谱法。术语“离子化(ionization)”或“电离(ionizing) ”指生成具有等于ー个或多个电子单位(electron unit)的净电荷的离子的过程。阴离子是具有一个或多个电子単位的净负电荷的那些，而阳离子是具有一个或多个电子単位的净正电荷的那些。术语“选择性离子监测”是其中只有在相对窄、通常约ー个质量单元或更少的质量范围内的离子被检测的质谱仪器的检测模式。“多反应模式”，有时称作“选择反应监测”是其中前体离子和ー种或多种片段离子被选择性检测的质谱仪器的检测模式。术语“量化的低限”、“定量的低限”或“LL0Q”指其中测量是量化上有意义的点。在该LLOQ下，分析物的反应是可鉴定的、离散的和可重现的，相对标准偏差(RSD%)小于20% 和准确度为85%至115%。术语“检测限”或“ L0D”是如此点，在该点下測量值大于与其測量相关的不确定度。 LOD被定义为4乘以0浓度下平均值的RSD。术语“同吋”，当应用至同时检测来自样品的两个或多个分析物的量，意思是获得反映来自同一样品注入的样品中两个或多个分析物的量的数据。每个分析物的数据可顺序或平行获得，这取决于所使用的仪器技木。例如，包含两个分析物如完整IGF-I和IGF-II 蛋白的单个样品可被注入HPLC柱，然后其可ー个接着另ー个洗脱每个分析物，这导致将分析物顺序引入质谱仪。为了本文的目的，当两个分析物源自注入HPLC的同一样品吋，同时測定这两个分析物的每ー个的量。体液样品中分析物的“量”一般指反映样品体积中可检测分析物的质量的绝对值。 然而，量也考虑与其他分析物的量相比的相对量。例如样品中的分析物的量可以是大于对照或正常存在于样品中的分析物的正常水平的量。如本文使用的，涉及定量測量——不包括离子质量測量——的术语“大约”指所示出的值加或减10%。质谱仪在測定给定分析物的质量时可以稍微变化。在离子质量或离子质/荷比的情况中，术语“大约”指+/-0. 50原子质量单位。上述的发明内容是非限制性的，并且根据下面的
和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是明显的。附图简述图IA-C显示m/z为约1093的离子的理论质谱，如通过分辨本领为约3000 (

图1A)、 约10，000(图1B)和约12，000(图1C)的质量分析器所分析的。图2A-D显示，对于m/z为1093. 52094、120ppm的质量准确度(图2A)、50ppm的质量准确度(图2B)、20ppm的质量准确度(图2C)和IOppm的质量准确度(图2D)的理论峰， 仪器响应与所研究离子的真实m/z的可能偏差。图3显示用轨道阱质谱仪产生的完整IGF-I的m/z范围为约800至1300的示例性光谱。细节在实施例2中讨论。图4显示用轨道阱质谱仪产生的完整IGF-I的m/z范围为约1091至1096的示例性光谱。细节在实施例2中讨论。图5显示完整IGF-I各种柱上数量的分析结果的图。细节在实施例2中讨论。图6A显示m/z范围为约1090至1098的约40fmol (柱上)完整IGF-I的示例性光谱。图6B显示相应的提取离子色谱图(EIC)。细节在实施例3中讨论。图7A显示m/z范围为约1090至1098的约650fmol (柱上)完整IGF-I的示例性光谱。图7B显示相应的提取离子色谱图(EIC)。细节在实施例3中讨论。图8A和8B显示观察的和计算的m/z范围为约1092至1095. 3的完整IGF-I光谱。 细节在实施例3中讨论。图9A-B显示完整IGF-I各种柱上量的分析结果图。测试的全浓度范围描绘在图 9A中，浓度范围的下端的放大图描绘在图9B中。细节在实施例3中讨论。图10显示对在浓度范围从15ng/mL至2000ng/mL的完整IGF-I响应的线性图。细节在实施例4中讨论。图11显示用高分辨率/高准确度TOF质谱仪产生的完整IGF-II的m/z范围为约 500至1900的示例性光谱。细节在实施例11中讨论。图12显示用高分辨率/高准确度TOF质谱仪产生的完整IGF-II的m/z范围为约 1066至1070的示例性光谱。细节在实施例11中讨论。图13显示完整IGF-II在浓度范围从15ng/mL至2000ng/mL线性响应的图。细节在实施例11中讨论。图14显示通过即时LC-MS方法量化完整IGF-II的分析结果与通过IRMA分析的比较。细节在实施例15中讨论。图15A、15B和15C显示来自同时量化IGF-II和IGF-I的示例性总离子色谱图 (TIC)和提取离子色谱图(EIC)。图15A显示TIC，图15B显示IGF-II的EIC，和图15C显示IGF-I的EIC。细节在实施例18中讨论。

通过质谱法检测和定量使用质谱仪进行质谱法，所述质谱仪包括用于电离样品和产生带电分子以进行进一歩分析的离子源。在各种实施方式中，IGF-I和/或IGF-II蛋白可通过技术人员已知的任何合适的方法电离。例如，样品的电离可通过如下进行电子电离、化学电离、电喷射电离 (ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快原子轰击 (FAB)、液体次级电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场解吸、热喷射/ 等离子体喷射电离、表面增强的激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离。本领域普通技术人员将理解选择电离方法可基于待被测量的分析物、样品类型、检测器类型、正对负模式的选择等进行确定。根据使用的具体电离方法和条件，IGF-I和IGF-II 蛋白可被电离为许多不同的电荷状态。可选择电离源以使所产生的电荷状态的分散最小化。在一些实施方式中，ESI (任选地加热)被用作电离源，并且电离条件被最优化以使观察到的多电荷IGF-I和/或IGF-II蛋白离子的分配最小化。可以以正模式或负模式电离IGF-I和/或IGF-II蛋白。在优选的实施方式中， ー种或多种IGF-I和/或IGF-II蛋白以正模式被电离。在一些实施方式中，产生m/z比在下列范围内的多电荷完整IGF-I离子约850. 8士2、957. 1 士2、1093. 7士2禾Π 1275. 8士2。 在一些实施方式中，产生m/z比在下列范围内的多电荷完整IGF-II离子约934. 69 士 2、 1068. 07士2、1245. 92士2和1494. 89士2。大部分产生的在这些范围内的多电荷离子可落在更窄的子范围内，如所述的m/z 士 1。在质谱法技术中，一般而言，样品已经被电离之后，从而产生的带正电的离子或带负电的离子可被分析以检测质荷比(m/z)。用于测定m/z的各种分析仪包括四极分析仪、 离子阱分析仪，和飞行时间分析仪，和轨道阱分析仪。根据本发明的方法，高分辨率/高准确度质谱法用于定量分析IGF-I和/或IGF-II蛋白。即，质谱法用对于关注的离子能够展示至少10，000的分辨本领(FWHM)、约50ppm或更小的准确度的质谱仪进行；优选地用展示下列分辨本领和准确度的质谱仪进行分辨本领(FWHM)为20，000或更好和准确度为约 20ppm或更小；如分辨本领(FWHM)为25，000或更好和准确度为约5ppm或更小；如分辨本领(FWHM)为25，000或更好和准确度为约3ppm或更小。对于IGF-I和/或IGF-II蛋白离子能够展示性能必要水平的三个示例性质谱仪是包括轨道阱质量分析器、某些TOF质量分析器或傅里叶变换离子共振质量分析器的那些。在生物活性分子中出现的元素，如碳、氧和氮以许多不同的同位素形式自然存在。 例如，大部分碳以1V出现，但所有天然存在的碳的约1%以"C存在。因此，一部分天然存在的含碳分子包含至少ー个1V原子。分子中包含天然存在的元素同位素产生多重分子同位素形式。分子同位素形式的质量差是至少1个原子质量单位(amu)。这是因为元素同位素至少有ー个中子的不同(ー个中子的质量 lamu)。当分子同位素形式被电离为多电荷状态，同位素形式之间的质量差别可变得难以区分，因为质谱检测基于质荷比(m/z)。例如， 都被电离为5+状态的质量差別Iamu的两种同位素形式，它们的m/z差仅为0. 2 (Iamu的差别/5的电荷状态)。高分辨率/高准确度质谱仪能够在高度多重带电荷离子的同位素形式 (如带电荷士5、士6、士7、士8、士9或更高的离子)之间进行区分。由于天然存在元素同位素，多重同位素形式通常存在于每种分子离子中(如果用足够灵敏的质谱仪器分析，其每个可产生可分开检测的光谱峰)。多重同位素形式的m/z比和相对丰度共同包括分子离子的同位素“签字”。在一些实施方式中，两种或多种分子同位素形式的m/z比和相对丰度可用于确认所研究的分子离子的同一性。在一些实施方式中， 来自ー种或多种同位素形式的质谱峰用于量化分子离子。在ー些相关实施方式中，来自ー 种同位素形式的单个质谱峰用于量化分子离子。在其他相关实施方式中，多个同位素峰用于量化分子离子。在这些后面的实施方式中，多个同位素峰可进行任何合适的数学处理。数种数学处理是本领域已知的，包括但不限于对多重峰下面积的求和，或对来自多重峰的响应平均。表明m/z范围为约1091-1095. 5的这种多重同位素形式的IGF-I离子的示例性光谱见图4。如在示例性光谱中所见，来自各种同位素形式的峰在m/z约1091.9447、 1092.8031,1092.9445,1093. 0881,1093. 2308,1093. 3740,1093. 5167,1093. 6597, 1093. 8028,1093. 9458,1094. 0889,1094. 2319,1094. 3754,1094.5185,1094.6606、和 1095. 3717被观察到。但是，注意因为仪器的不同，观察到的任何离子的同位素变体的精确质量可能稍微不同(例如，士0. 1)。表明m/z范围在约1067. 0-1069. 5内的、这种多重同位素形式的IGF-II离子的另一示例性光谱见图12。如示例性光谱所见，在下列m/z观察到来自各种同位素形式的峰 约 1067. 36,1067. 51,1067. 65,1067. 80,1067. 94,1068.08,1068.23,1068.37,1068.51、 1068. 65、1068. 80、1068. 94和1068. 08。再一次，因为仪器的不同，观察到的任何离子的同
位素变体的精确质量可能稍微不同。在质谱技术中，一般而言，可使用数种检测模式检测离子。例如，所选择的离子可被检测，即，使用选择性离子监测模式(SIM)，或可选地，可使用扫描模式检测离子。当以扫描模式操作吋，质谱仪通常向使用者提供离子扫描；即，具体质量/电荷在给定范围(例如，100至IOOOamu)的每种离子的相对丰度。进一歩，当使用能够成倍増加质谱事件(mass spectrometric event)的仪器如某些离子阱或三重四极仪器吋，源自碰撞诱导的离解或中性损失的质量转移可被监测，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。分析物分析的結果，即，通过本领域已知的许多方法，质量光谱可与初始样品中分折物的量相关。例如，假设取样和分析參数被小心地控制，给定离子的相对丰度可与将该相对丰度转换为初始分子的绝对量的表相比较。可选地，内标或外标可与样品一起过柱，并且基于从这些标准所产生的离子构建标准曲线。使用这种标准曲线，给定离子的相对丰度可转换成初始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，一种或多种标准用于产生标准曲线， 用来计算IGF-I和/或IGF-II蛋白的数量。产生和使用这种标准曲线的方法是本领域已知的并且技术人员能够选择合适的内标。例如，在优选的实施方式中同位素标记的或未标记的完整非人IGF-I和/或IGF-II (例如，重组小鼠IGF-I和/或IGF-II)或同位素标记的完整人IGF-I和/或IGF-II可用作标准。将离子的量与初始分子的量关联的许多其他方法是本领域技术人员熟知的。如本文所使用，当通过质谱技术分析吋，“同位素标记”在标记的分子中相对于未标记的分子产生质量移动。合适的标记的例子包括氘(2H) .1 和15N。同位素标记可结合在分子的ー种或多种位置上并且ー种或多种类型的同位素标记可用在相同的同位素标记的分子上。方法的一个或多个步骤可使用自动化机器实施。在某些实施方式中，ー种或多种纯化步骤联机实施，并且更优选地所有纯化和质谱法步骤可以以联机方式进行。在一些实施方式中，如下使用MS检测和/或量化样品中的完整IGF-I和/或 IGF-II。样品进行液相色谱法，优选地HPLC ；来自色谱柱的液体溶剂流进入ESI电离源的加热的喷雾器界面；和在界面的加热的带电管中，将溶剤/分析物混合物转变为蒸汽。通过施加大电压至溶剂/分析物混合物，包含在溶剂中的分析物(例如，完整IGF-I和/或IGF-II) 被电离。随着分析物离开界面的带电管，溶剤/分析物混合物雾化并且溶剂蒸发，留下各种电荷状态的分析物离子。接着收集ー种或多种离子的強度的定量数据。接着收集ー种或多种离子的信号強度的定量数据并且与样品中完整IGF-I和/或IGF-II的数量相关联。对于完整IGF-I，可观察下列m/z范围的各种电荷状态的离子约850. 8士2 (9+)、 957. 1 士2 (8+)、1093. 7士2 (7+)和 1275. 8士2 (6+)。在一些实施方式中，收集 m/z 在约 1093. 7士2范围内的ー种或多种IGF-I离子的数据并用于定量。该m/z范围内的示例性离子包括下列 m/z 的 IGF-I 离子约 1091. 9 士0. 1,1092. 8 士0. 1,1092. 9 士0. 1,1093. 1 士0. 1、
1093.2 + 0. 1,1093. 4 + 0. 1,1093. 5 + 0. 1,1093. 7 + 0. 1,1093. 8 + 0. 1,1093. 9 + 0. 1,
1094.1 士 0. 1,1094. 2 士 0. 1,1094. 4 士 0. 1,1094. 5 士 0. 1,1094. 7 士 0. 1 和 1095. 4 士 0. 1。 该列举并不意味着是限制性的。许多其他离子可适合用于该即时方法(instant method)，如显示在图3中的光谱所表明(其表明检测m/z为下列的同位素离子组约 828. 0509 + 2,850. 7373 士 2,871. 8730 + 2,920. 5544士 2,939. 6930 士 2,956. 9532 士 2、 975.4576士2、1034.8128士2、1051.6337士2、1073.9335士2、1093.6597士2、1114. 5219士2、 1207. 9401 士2、1226. 5705士2、1252. 5871 士2 和 1275. 6019士2 ；但是，注意如上在这些范围内单个同位素的离子主要落在所叙述m/z士 1的范围内。而且，在该精确度水平上，因为仪器的不同，观察到的任何离子的质量可能稍微不同，例如士0. 1)。对于完整IGF-II，可观察m/z在下列范围内的各种电荷状态的离子约 934. 69 士 2 (8+)、1068. 07 士 2 (7+)、1245. 92 士 2 (6+)和 1494. 89 士 2 (5+)。在一些实施方式中，收集来自m/z范围在约1068. 07士2内的ー种或多种IGF-II离子的数据并用于定量。该m/z范围内的示例性离子包括具有下列m/z的IGF-II离子约1067. 36 士 0. 1、
1067.51 + 0. 1, 1067. 65 + 0. 1 , 1067. 80 + 0. 1 , 1067. 94 + 0. 1, 1068. 08 + 0. 1,
1068.23 士 0. 1,1068. 37 士 0. 1,1068. 51 士0. 1,1068. 65 士0. 1,1068. 80 士0. 1,1068. 94士0. 1 和1069. 08士0. 1。在一些实施方式中，ー种或多种IGF-II离子选自m/z为约1067. 94士0. 1 和1068. 08士0. 1的IGF-II离子。该列举并不意味着是限制性的，并且其他离子可适合用于该即时方法。在一些实施方式中，使用高分辨率/高准确度质谱仪可允许选择来自单个离子单个同位素形式的峰的信号強度(如显示在图4中单个IGF-I离子峰的m/z为约1093. 66，或显示在图12中的单个IGF-II峰的m/z为约1067. 80)用于获取数据。可选地，来自单个离子的ー种或多种同位素形式(如图4和12中所表明的ー种或多种IGF-I或IGF-II同位素形式)的信号強度的定量数据，或窄m/z范围的信号強度(如m/z范围为约1093. 7士 1的所有IGF-I信号強度，或m/z范围为约1068. 2士 1的所有IGF-II信号強度)可被收集并与样品中完整IGF-I和/或IGF-II的数量相关联。在一些实施方式中，收集来自至少两个不同电荷状态的ー种或多种IGF-I和/或 IGF-II离子的信号強度的定量数据。这些离子的強度可接着用于量化评估样品中的完整IGF-I和/或IGF-IL·例如，IGF-I可用ー种或多种8+电荷状态的IGF-I离子(即，m/z范围为约957. 1 士2内的IGF-I离子)和ー种或多种7+电荷状态的IGF-I离子(S卩，m/z范围1093. 7士2内的IGF-I离子)的信号强度量化。在收集两个或多个离子的信号強度的定量数据的实施方式中，该强度可结合本领域任何数学方法(如求和，或平均曲线下面积)， 用于量化评估样品中完整IGF-I和/或IGF-II。当离子碰撞探测器吋，它们产生电子脉冲，其被转变成数字信号。获得的数据依赖于计算机，其绘制所收集离子的计数对时间的图。所得质量色谱图类似于传统HPLC-MS方法产生的色谱图。可測量对应于具体离子的峰下面积，或这种峰的振幅，并使之与关注分折物的量相关联。在某些实施方式中，測量曲线下面积，或峰的振幅以确定IGF-I和/或 IGF-II蛋白或片段的量。如上述，可基于内分子标的ー种或多种离子的峰，使用校准标准曲线将给定离子的相对丰度转化为初始分析物的绝对量。在一些实施方式中，IGF-I和IGF-II同时被量化。在这些实施方式中，IGF-I和 IGF-II每个可通过上面提供的任何方法量化。在某些优选的实施方式中，对于IGF-I，定量的下限(LLOQ)在约15. Ong/mL至 200ng/dL 范围内，包括 15. Ong/mL 和 200ng/dL ；优选地在约 15. Ong/dL 至 100ng/mL 范围内，包括15. Ong/dL和100ng/mL ；优选地在约15. Ong/mL至50ng/mL范围内，包括15. Ong/ mL 和 50ng/mL ；优选地在约 15. Ong/mL 至 25ng/mL 范围内，包括 15. Ong/mL 和 25ng/mL ；优选地在约15. Ong/mL至15ng/mL范围内，包括15. Ong/mL和15ng/mL ；优选地在约15. Ong/ mL 至 10ng/mL 范围内，包括 15. Ong/mL 和 10ng/mL ；优选地约 15. Ong/mL。在某些优选的实施方式中，对于IGF-II，定量的下限(LLOQ)在约30. Ong/mL至 200ng/dL 范围内，包括 30. Ong/mL 和 200ng/dL ；优选地在约 30. Ong/dL 至 100ng/mL 范围内，包括30. Ong/dL和100ng/mL ；优选地在约30. Ong/mL至50ng/mL范围内，包括30. Ong/ mL和50ng/mL ；优选地在约30. Ong/mL至25ng/mL范围内，包括30. Ong/mL和25ng/mL ；优选地在约30. Ong/mL至15ng/mL范围内，包括约30. Ong/mL和15ng/mL ；优选地在约30. Ong/ mL 至 10ng/mL 范围内，包括 30. Ong/mL 和 10ng/mL ；优选地约 30. Ong/mL。在某些优选的实施方式中，对于IGF-I，检测限(LOD)在约4. 9ng/mL至200ng/mL 范围内，包括4. 9ng/mL和200ng/mL ；优选地在约4. 9ng/mL至100ng/mL范围内，包括4. 9ng/ mL和100ng/mL ；优选地在约4. 9ng/mL至50ng/mL范围内，包括4. 9ng/mL和50ng/mL ；优选地在约4. 9ng/mL至25ng/mL范围内，包括4. 9ng/mL和25ng/mL ；优选地在约4. 9ng/mL至 20ng/mL 范围内，包括 4. 9ng/mL 和 20ng/mL ；优选地约 4. 9ng/mL。在某些优选的实施方式中，对于IGF-II，检测限(LOD)在约8. 2ng/mL至200ng/mL 范围内，包括8. 2ng/mL和200ng/mL ；优选地在约8. 2ng/mL至100ng/mL范围内，包括8. 2ng/ mL和100ng/mL ；优选地在约8. 2ng/mL至50ng/mL范围内，包括8. 2ng/mL和50ng/mL ；优选地在约8. 2ng/mL至25ng/mL范围内，包括8. 2ng/mL和25ng/mL ；优选地在约8. 2ng/mL至 20ng/mL 范围内，包括 8. 2ng/mL 和 20ng/mL ；优选地约 8. ^g/mL。下列实施例用于图解本发明。这些实施例绝不打算限制本方法的范围。尤其，下列实施例通过使用具体内标的质谱法表明IGF-I和IGF-II蛋白或片段的量化。使用所指出的内标并不意味着以任何方式是限制性的。容易被本领域人员测定的任何合适的化学种类可用作内标。
实施例实施例1 富集IGF-I蛋白或片段使用简单制备和随后的联机SPE的组合从血清样品中提取完整的IGF-I。如下进行酸乙醇提取。100 μ L的每个血清样品用400 μ L的酸/乙醇(87. 5%Et0H/12. 5%2M HCl)处理以形成沉淀。混合物进行离心以获得上清液和颗粒状物(沉淀，pellet)。接着取出400yL 的上清液并与60 μ Li. 5M Tris碱混合。添加Tris碱形成的任何沉淀被滤除并丢弃。滤出液通过联机稀释系统用水中5%的甲酸稀释以降低乙醇浓度至溶液中的IGF-I可结合至提取柱的足够水平。稀释的提取样品被注入Cohesive LC系统用于联机SPE和HPLC处理，然后进行质谱分析。使用Wienomenex单片Onyx C18保护柱体(10 X 4. 6mm)作为联机SPE柱完成IGF-I 的联机提取和富集。通过HPLC用Wienomenex Onyx单片C18柱(50X2. Omm)完成分析分
肉ο^MM 2 用高分辨率/高准确度轨i首阱MS检测丨和量化·^整IGF-I使用Thermo Exactive MS系统(Thermo Electron公司)进行MS。该系统采用具有高分辨率/高准确度MS的轨道阱MS分析仪。当测量完整IGF-I吋，该仪器展示的分辨本领为约25，000FWHM,并且质量准确度为约lppm。用ESI源以阳离子模式，进行电离。用约851、957、1094和1275的m/z，对应于 [IGF-I+nH]n+(n分別=9+、8+、7+和6+)的离子，观察多电荷完整IGF-I离子的种类。显示 1094离子的同位素“签字”的全扫描光谱和该光谱的放大部分分別出现在图3和4中。单个同位素形式的两个最强离子——对应于m/z为约956. 9532和1093. 6592的离子同位素形式——所收集的数据被求和并用于量化评估样品中完整IGF-I的量。从柱上 31fmol至4000fmol的完整IGF-I制作的校准曲线中，观察到了线性。该曲线显示在图5 中。天然完整IGF-I的拟合优度(R2)值是0.9984。实施例3 用高分辨率/高准确度TOF MS检测和量化完整IGF-I也使用 Agilent 6530Accurate_Mass Q-TOF MS 系统(Agilent Technologies, he.)进行MS。该系统采用具有高分辨率/高准确度MS的高分辨率/高准确度TOF MS 分析仪。当测量完整IGF-I吋，该仪器展示的分辨本领为约25，000FWHM，并且质量准确 iS%^]3ppm。 Τ"歹:Agilent MassHunter Workstation Acquisition B.02.01 ；Agilent MassHunter Quantitative Software B.03. 02 ；Agilent MassHunter Qualitative software B. 02. 00 ；禾ロ Cohesive Aria OS v. 1. 5. 1。100 μ L空白血清中40fmol和650fmol样品产生的、m/z范围为约1090至1098的示例性光谱分别显示在图6A和7A中。对应图6A和7A中所示光谱的提取离子色谱图(EIC) 分别显示在图6B和7B中。收集m/z为约1093. 7士2的同位素形式的IGF-I离子的数据，并定性和定量评估样品中完整IGF-I的量。通过比较观察到的m/z范围为约1092至1095. 3的光谱与根据天然存在的同位素分布计算的光谱，进行定性评估(即，基于同位素“签字”确认IGF-I的同一性)。观察的和计算的光谱分别显示在图8A和8B中。用来自单同位素形式(对应的理论m/z为约1093. 5209)的数据和来自多同位素形式的求和数据进行量化评估。来自单同位素形式的数据用于产生柱上20fmol至 2600fmol完整IGF-I的线性校准曲线。这对应于样品浓度为约8. 2ng/mL至约105^g/ mL(样品大小为100 μ L)的线性观察。完整IGF-I和内标收集的数据呈现在下面表1中。 校准曲线显示在图9Α(测试的整个浓度范围)和9Β (浓度范围下端的放大图)。完整IGF-I 的拟合优度(R2)值为0. 9996。表1.用于校准曲线的完整IGF-I和内标(完整重组小鼠IGF-I)測定

1.用于测定样品中胰岛素样生长因子-1(IGF-I)蛋白的量的方法，所述方法包括a.使所述样品中的IGF-I蛋白在适合产生质谱法可检测的一种或多种离子的条件下电离；和b.通过高分辨率/高准确度质谱法测定ー种或多种所述离子的量；其中所述高分辨率/高准确度质谱法用FWHM大于或等于约10，000并且准确度小于或等于约50ppm的质量分析器进行；和其中所測定的一种或多种离子的量与所述样品中 IGF-I蛋白的量相关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述IGF-I蛋白是人IGF-I蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述IGF-I蛋白源于所述样品。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述IGF-I蛋白是完整的IGF-I蛋白。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述IGF-I蛋白是完整的长R3IGF-I或其片段。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述IGF-I蛋白是完整的长R3IGF-I。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述IGF-I蛋白在电离之前被化学改性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述化学改性包括减少所述IGF-I蛋白中的ー个或多个ニ硫键。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述化学改性包括烷基化所述IGF-I蛋白中的一个或多个半胱氨酸。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中来自所述样品的所述IGF-I蛋白用固相提取(SPm在电离之前纯化。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中来自所述样品的所述IGF-I蛋白通过高效液相色谱法(HPLC)在电离之前纯化。
12.根据权利要求10所述的方法，其中来自所述样品的所述IGF-I蛋白通过高效液相色谱法(HPLC)在电离之前进ー步纯化，并且所述SPE和HPLC用联机处理进行。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述高分辨率/高准确度质谱法用轨道阱质谱仪进行。
14.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述高分辨率/高准确度质谱法用飞行时间(TOF)质谱仪进行。
15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述高分辨率/高准确度质谱法用具有FWHM大于或等于约20，000和准确度小于或等于约IOppm的轨道阱或飞行时间质量分析器进行。
16.根据权利要求1-15任一项所述的方法，其中所述高分辨率/高准确度质谱法用具有FWHM大于或等于约20，000和准确度小于或等于约5ppm的轨道阱或飞行时间质量分析器进行。
17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中所述测定一种或多种离子的量的步骤包括收集来自ー个或多个峰的光谱数据，每个峰源自所述一种或多种离子的同位素形式。
18.根据权利要求17所述的方法，其中每个源自离子的不同同位素形式的两个或多个峰用于确认IGF-I蛋白的同一性。
19.根据权利要求17所述的方法，其中来自峰的光谱数据用于测定所述样品中IGF-I蛋白的量，所述峰源自离子的单个同位素形式。
20.根据权利要求17所述的方法，其中来自两个或多个峰的光谱数据用于测定所述样品中IGF-I蛋白的量，所述峰的每个源于离子的单同位素形式。
21.根据权利要求1-20任一项所述的方法，其中所述样品包括生物学样品。
22.根据权利要求1-21任一项所述的方法，其中所述样品包括血浆或血清。
23.根据权利要求1-22任一项所述的方法，其中质谱法可检测的所述ー种或多种离子包括一种或多种处于6+、7+、8+或9+电荷状态的IGF-I离子。
24.根据权利要求1-23任一项所述的方法，其中质谱法可检测的所述ー种或多种离子包括选自具有850. 8 士 2、957. 1 士 2、1093. 7士2和1275. 8士2范围内质荷比的离子的ー种或多种离子。
25.根据权利要求1-23任一项所述的方法，其中质谱法可检测的所述ー种或多种离子包括选自具有850. 8士 1、957. 1 士 1、1093. 7士 1和1275. 8士 1范围内质荷比的离子的ー种或多种离子。
26.根据权利要求I-M任一项所述的方法，其中质谱法可检测的所述ー种或多种离子包括选自具有下列质荷比的离子的一种或多种离子:1091. 9447士0. 1,1092. 8031 士0. 1、1092.9445 + 0. 1,1093. 0881 + 0. 1,1093. 2308 士 0. 1,1093. 3740 士 0. 1,1093. 5167 + 0. 1、1093.6597 + 0. 1,1093. 8028 + 0. 1,1093. 9458 + 0. 1,1094. 0889 士 0. 1,1094. 2319 士0. 1、1094.3754 士 0. 1,1094. 5185 士 0. 1,1094. 6606 士 0. 1 和 1095. 3717 士 0. 1。
27.根据权利要求I-M任一项所述的方法，其中质谱法可检测的所述ー种或多种离子包括选自具有下列范围内质荷比的离子的一种或多种离子828. 0509士 1、850. 7373士 1、 871. 8730+1,920. 5544士 1、939. 6930士 1、956. 9532士 1、975. 4576士 1、1034. 8128士 1、 1051. 6337 + 1,1073. 9335+1,1093. 6597 + 1,1114. 5219 + 1,1207. 940 1 + 1, 1226. 5705士1、1252. 5871士1 和 1275.6019士1。
28.測定生物学流体样品中天然完整胰岛素样生长因子(IGF-I)量的方法，所述方法包括a.将通过固相提取(SP^和高效液相色谱法(HPLC)纯化的源于所述样品的完整 IGF-I在适合产生质谱法可检测的一种或多种离子的条件下电离；其中质谱法可检测的所述ー种或多种离子包括一种或多种处于6+、7+、8+或9+电荷状态的IGF-I离子；b.通过高分辨率/高准确度质谱法测定ー种或多种所述离子的量；和c.使用所述测定的一种或多种离子的量測定所述样品中天然完整IGF-I的量，其中所述高分辨率/高准确度质谱法用FWHM大于或等于约10，000和准确度小于或等于约50ppm的轨道阱或飞行时间质量分析器进行。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述高分辨