一种与植物细胞周期相关的蛋白质和其编码基因制作方法

陈受宜, 张劲松, 沈义国, 张万科, 杜保兴

2003年10月15日

2002年4月2日

2002年4月2日

中国科学院遗传研究所

C12N15/29GK1448401SQ0210879

细胞周期 蛋白质 植物 相关

1.一种存在于植物中的参予细胞分裂G1期至S期与细胞周期相关的基因CCR所编码的蛋白质2.按照权利要求1所述的细胞周期相关蛋白质，它来自单子叶或双子叶植物3.按照权利要求1所述的细胞周期相关蛋白质，它来自禾本科、茄科、豆科、十字花科、藜科、杨柳科4.按照权利要求1所述的细胞周期相关蛋白质，它来自烟草、拟南芥、小盐芥、沙芥、大豆、苜蓿、菜豆、草坪草、棉花、油菜、蕃茄、杨树、胡杨、玉米、高粱、水稻、小麦和冰草5.按照权利要求1所述的蛋白质，它来自山菠菜，(Atriplexhortensis)，命名为AhCCR的蛋白质，它具有如下所示的氨基酸序列MSDDEREEKELDLSYPEVVTKYKSAADIVNRALQLVVGECKPKAKIVDLCEKGDNFIREQTGNMYKNVKKKIERGVAFPTCLSINNVVCHFSPLASDDSVLEEGDLVKIDMGCHIDGFIAVVAHTHVIQEGPVTGRKADVLAATNTAAEVALRLVRPGKNQYRCNQKQSQKXAAAYDCKIVEGVLSHQMKQFVIDGNKVVLSVSSPDVRVDDAEFEENEVYSVDIAASTGEGKPRMLDEKQTTIYKRAVDKNYHLKMKASRFIFSEINQKFPIMPFTARALEEKRARLGLVECVNHDLLQPYPVLYEKPGDYVAHIKFTVLLMPNGSDRVTSYPVQELQPTKSIDDPEIKAWLALGTKTKKKGGGKKKKAKKGEKSGAEESADAEPMDTSANGAAEN6.按照权利要求1所述的蛋白质，它来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)，命名为AtCCR的蛋白质，它具有如下所示的氨基酸序列MSSDDERDEKELSLTSPEVVTKYKSAAEIVNKALQVVLAECKPKAKIVDICEKGDSFIKEQTASMYKNSKKKIERGVAFPTCISVNNTVGHFSPLASDESVLEDGDMVKIDMGCHIDGFIALVGHTHVLQEGPLSGRKADVLAAANTAADVALRLVRPGKKNTDVTEAIQKVAAAYDCKIVEGVLSHQLKQHVIDGNKVVLSVSSPETTVDEVEFEENEVYAIDIVASTGDGKPKLLDEKQTTIYKKDESVNYQLKMKASRFIISEIKQNFPRMPFTARSLEEKRARLGLVECVNHGHLQPYPVLYEKPGDFVAQIKFTVLLMPNGSDRITSHTLQELPKKTIEDPEIKGWLALGIKKKKGGGKKKKAQKAGEKGEASTEAEPMDASSNAQE7.按照权利要求1所述的蛋白质，它来自水稻(Oryza sativa)，命名为OsCCR的蛋白质，它具有如下所示的氨基酸序列MSSDDEVREEKELDLSSSDVVTKYKDAADIINNALKLVVSLCKPKAKIVDICEKGDSYIREQTGNIYKNVKRKIERGVAFPTCVSVNNTVCHFSPLATDEAVLEENDMVKIDMGCHIDGFLAVVAHTHVIHDGAVTGKAADVLAAANTAAEVALRFVRPGKKNKDVTEAIQKVAAAYDSVSVEGVLSHQLKQFVIDGNKVVLSVSNADTKVDDAEFEENEVYAIDIVTSTGEGKPKLLDEKQTTIYKRAVDKNYHLKMKASRFIFSEISQKFPIMPFTARALEEKRARLGLVECMNHELLQPYPVLHEKPGDLVAHIKFTVLLLPSGSQRVTSHSLQVLQPTKSIFDHAEIKAWLALGTKTKKKSGAQKKKGKKGDAAEAVPMEEGSNDANKE8.按照权利要求5所述的AhCCR蛋白质的编码基因，它具有如下所示的核苷酸序列TGCACCGTTCACCTCTATTTTCCATTTTTCTGCTATTTACAAACGAAAGCGATAAACATTTTGATTACTTTGTTGAAGAATAATGTCGGACGATGAGAGAGAGGAGAAGGAGTTGGATCTTAGCTATCCTGAAGTTGTTACCAAATACAAGAGCGCTGCTGACATTGTCAACAGAGCTTTGCAGCTAGTTGTCGGAGAATGCAAGCCCAAAGCTAAAATTGTTGATTTGTGCGAGAAAGGGGATAATTTTATCCGAGAGCAAACTGGTAATATGTACAAGAATGTGAAGAAGAAGATTGAACGAGGTGTTGCTTTTCCAACTTGTTTATCTATCAACAATGTTGTTTGTCATTTCTCACCACTTGCCAGTGATGACTCAGTGCTTGAAGAAGGTGATTTAGTGAAAATTGATATGGGTTGTCATATTGATGGCTTTATTGCTGTTGTTGCACACACTCATGTCATTCAAGAAGGTCCGGTAACCGGTAGAAAAGCTGATGTTCTTGCAGCAACCAACACTGCTGCTGAGGTTGCTTTGAGGCTTGTGAGGCCTGGAAAAAACCAATATAGATGTAACCAGAAGCAATCCCAGAAAGKTGCTGCAGCATATGACTGTAAAATTGTTGAAGGTGTCCTTAGTCACCAAATGAAACAGTTCGTGATTGATGGAAACAAGGTGGTGTTGAGTGTATCAAGTCCTGATGTGAGAGTTGATGATGCTGAATTTGAGGAGAACGAAGTCTATTCTGTTGATATAGCTGCTAGTACGGGTGAGGGAAAGCCTAGAATGTTGGACGAGAAGCAAACAACTATTTACAAAAGAGCTGTGGACAAGAATTATCACTTGAAAATGAAAGCATCAAGATTTATTTTCAGTGAAATCAATCAGAAATTCCCTATCATGCCATTTACAGCAAGGGCGTTGGAGGAGAAGAGGGCTCGTCTTGGACTTGTAGAATGTGTCAATCACGACCTCTTGCAACCCTATCCTGTTTTGTATGAGAAACCTGGAGATTATGTTGCTCACATAAAATTCACTGTTCTTCTCATGCCAAATGGATCGGATCGTGTGACATCATATCCTGTGCAAGAATTGCAGCCAACTAAATCAATTGACGACCCTGAAATTAAAGCTTGGTTAGCATTGGGAACAAAGACAAAGAAGAAAGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAGCCAAGAAGGGTGAAAAATCTGGTGCCGAAGAGTCAGCTGATGCAGAGCCCATGGATACAAGTGCAAATGGTGCAGCTGAAAATTAAAAAGACAAAAAAGTTTGTTCAAATTTTGTTACTTGTTGATTCTCTTTTGTATTTGCTTGALAGGCAACTTAAACATGTTTAGATGTTGATCTTCAATATTTCATGTTGCCTCTCACCTGTGTAAAGTTTCTGGGTTTGAGCCCACAAAATGAATTTTTTCTTGATACAAAAACGACAGCAACGG9.按照权利要求6所述的AtCCR蛋白质的编码基因，它具有如下所示的核苷酸序列CATTTCTCTCCTTCTCCACCAGTTTTCCCCCAATCGTTCCTCCTTAAACCCTAACATTTTTGCTTCCCCTGTTTCGATTCTCGAGAGTTATCAGAGATGAGTTCGGACGATGAGAGAGACGAGAAGGAGCTGAGTCTTACCTCTCCTGAAGTCGTCACCAAGTACAAGAGCGCCGCTGAGATCGTTAACAAGGCGTTACAGGTTGTTTTAGCTGAATGCAAACCAAAAGCTAAGATTGTTGATATCTGTGAGAAAGGAGACTCTTTTATTAAAGAGCAAACAGCAAGCATGTACAAGAATTCTAAGAAGAAGATTGAGAGAGGTGTTGCGTTCCCTACATGCATTTCTGTGAACAACACTGTTGGTCATTTTTCACCGCTTGCTAGTGATGAGTCTGTGTTGGAAGATGGTGACATGGTTAAAATCGATATGGGATGTCATATTGATGGGTTCATTGCCCTTGTTGGTCACACACATGTTCTTCAAGAAGGGCCTCTTATAAGGCTGATGTTATCGCTGCCGCAAATACTGCAGCTGATGTTGCTCTAAGGCTCGTACGTCCTGGAAAAAAGAACACTGATGTAACTGAAGCTATTCAGAAGGTAGCTGCAGCTTATGACTGCAAAATTGTTGAAGGTGTTCTTTCCCACCAGCTGAAACAGCATGTGATAGATGGAAACAAGGTTGTGCTTAGTGTATCCAGCCCTGAAACAACTGTTGACGAAGTGGAATTTGAAGAGAATGAAGTCTATGCAATAGATATTGTGGCAAGTACTGGTGATGGCAAGCCAAAGCTATTAGACGAGAAGCAAACAACTATTTACAAGAAAGATGAAAGTGTTAACTATCAGTTGAAGATGAAGGCCTCCAGATTCATAATCAGCGAAATTAAACAGAACTTCCCCCGTATGCCATTCACTGCAAGGTCACTGGAGGAGAAAAGGGCACGGCTATTTCTTTGCTTGTCCTAATCTTATCTCATTCTCT10.按照权利要求7所述的OsCCR蛋白质的编码基因，它具有如下所示的核苷酸序列GCACGAGCGACCTCCCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCACCGCCACCGCCACCGCCACGTCCAGCCTCCGGTCGCCTGTTCGGATCGAAGCGATGTCGTCGGACGATGAGGTCAGAGAGGAGAAGGAGCTCGACCTCTCCTCCTCCGACGTCGTCACCAAGTACAAGGACGCCGCCGATATCATCAACAATGCTCTTAAGTTGGTAGTGTCTTTGTGCAAGCCGAAAGCCAAGATTGTTGACATCTGTGAGAAGGGCGATTCTTACATAAGAGAGCAAACTGGCAACATCTACAAGAATGTGAAGAGGAAGATTGAAAGAGGTGTTGCTTTTCCAACATGTGTNTCTGTGAACAACACAGTCTGCCATTTCTCTCCGCTAGCCACTGATGAGGCAGTCCTGGAGGAAAATGATATGGTCAAAATTGATATGGGATGTCATATTGATGGTTTTATTGCCGTGGTGGCTCATACACATGTTATCCATGATGGAGCAGTCACTGGGAAAGCAGCAGATGTTCTTGCTGCTGCCAACACAGCGGCAGAAGTTGCTCTGAGGTTTGTTAGACCTGGGAAGAAGAACAAGGATGTCACCGAAGCGATTCAGAAAGTTGCTGCTGCCTATGACTCCGTATCTGTTGAAGGAGTTCTCAGCCATCAGCTGAAACAGTTTGTCATTGACGGTAACAAAGTTGTACTTAGTGTGTCCAATGCTGATACGAAGGTGGATGATGCTGAATTTGAGGAAAATGAAGTGTATGCAATTGATATTGTCACCAGCACTGGAGAAGGGAAGCCCAAGTTATTGGATGAGAAGCAGACCACCATCTACAAGAGAGCTGTAGACAAGAATTATCACTTGAAGATGAAAGCATCTAGGTTCATTTTCAGTGAGATAAGCCAGAAGTTTCCTATCATGCCCTTCACTGCTAGGGCATTGGAAGAGAAGCGTGCACGCTTAGGTTTGGTGGAATGCATGAATCATGAATTATTGCAGCCGTACCCTGTCCTTCACGAGAAGCCAGGCGACCTTGTTGCACACATCAAGTTTACTGTGCTTCTGCTGCCATCTGGTTCACAGAGGGTAACATCGCATTCACTTCAGGTGTTGCAGCCCACTAAATCCATTGAAGACCACGCTGAGATCAAGGCATGGCTTGCTTTGGGGACCAAAACAAAGAAGAAAAGTGGTGCCCAAAAGAAGAAAGGTAAGAAAGGAGATGCAGCAGAAGCAGTGCCTATGGAGGAGGGTTCAAATGATGCAAACAAAGAATAACTGATTGTTCTTTTGAATTGCTTCCGTTAGTTTTGTACTTGCTCCACTGCATCTGATGCTATTATATCACATTCAGTTGTGGAAAATCGAGTACTTTTTCAAACTTCCTGGGAAATGATCCGTCCTGCTGCACACTCATTGTCCAAAAAA11.根据权利要求1、2、5、6或7所述的蛋白质或权利要求8、9、或10所述的基因任选其中之一在培育和改良植物品种中的应用

本发明属于基因工程领域，具体地讲涉及植物中的一类新的细胞周期相关基因及其所编码的蛋白质在细胞周期调控中，G1到S相是最重要的在G1相至细胞分裂中已发现了许多基因涉及调控作用在酵母和动物中，这些基因的突变引起表型变化甚至死亡拟南芥中，cyclinD在G1到S相时表达并起作用以AhCCR基因序列从拟南芥基因组序列中查出其同源基因序列，据此设计引物，从拟南芥cDNA中克隆了AhCCR的同源基因AtCCR基因AtCCR cDNA全长1472bp，含有1179bp的ORF，编码392个氨基酸，5’-UTR为96bp，3’-UTR为197bp根据AhCCR基因序列从水稻基因组序列中检索到水稻CCR基因序列，据此设计引物，从水稻cDNA中克隆了水稻CCR基因OsGCROsCCRcDNA含1422bp，其中ORF为1182bp，编码393个氨基酸，5’-UTR为90bp，3’-UTR为150bp转基因研究表明，无论将AhCCR基因转入烟草还是将AtCCR基因转入拟南芥，转基因植株在正常条件下的长势明显优于对照且提前开花结实而以反义AtCCR转化的拟南芥生长缓慢AtCCR和AhCCR基因过量表达的转基因植株比对照有明显高的耐逆性该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的产量及耐逆性，以进行植物品种改良综上所述，本发明人提供的CCR基因是植物中的一类新基因，其参予植物细胞周期的调控因而，本发明的一个目的是提供一种新的参予植物细胞周期调控的基因的核苷酸序列，此类基因中的三种，AhCCR、AtCCR和OsCCR分别如序列表1，2和3所示本发明所述的一种新的参予植物细胞周期调控的蛋白质(基因)可以是来自所有植物包括山菠菜、烟草、拟南芥、草坪草、杨树、大豆、小麦、水稻、棉花或蕃茄等这种蛋白质的氨基酸序列中的三种，AhCCR、AtCCR和OsCCR分别如序列表1，2和3所示本发明的再一个目的是提供一种培育耐逆植物品种的方法，包括将本发明所述的植物细胞周期相关基因导入植物细胞并使其表达的步骤在本发明的方法中，可利用CCR基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物本发明的CCR基因的受体植物包括单子叶和双子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蔬菜、树木和草坪草等根据AhCCR基因序列，在GeneBack数据库中从拟南芥基因组全序列中检索到相应的基因AtCCR的序列，据此，用PCR方法从拟南芥cDNA中扩增并克隆了AtCCR基因其氨基酸和核苷酸序列列于序列表2根据序列检索表明AtCCR基因在拟南芥基因组中也仅有一个拷贝上述实施例表明本发明中克隆的这一类新的植物细胞基因CCR具有与细胞周期相关的特征，与人类中的同类蛋白p38-2G4的相似性为51％，此类基因在植物中的功能迄今未经描述，为一类新基因实验例5、6表明该基因与植物的生长、发育以及对逆境的耐性相关此类基因可作为目的基因用以改良植物的品种序列表1-81 TGCACCGTTCACCTCTATTTTCCATTTTTCTGCTATTTACAAACGAAAGCGATAAACATTTTGATTACTTTG-9 TTGAAGAATAATGTCGGACGATGAGAGAGAGGAGAAGGAGTTGGATCTTAGCTATCCTGAAGTTGTTACCAAM S D D E R E E K E L D L S Y P E V V T K64 ATACAAGAGCGCTGCTGACATTGTCAACAGAGCTTTGCAGCTAGTTGTCGGAGAATGCAAGCCCAAAGCTAAY K S A A D I V N R A L Q L V V G E C K P K A K136 AATTGTTGATTTGTGCGAGAAAGGGGATAATTTTATCCGAGAGCAAACTGGTAATATGTACAAGAATGTGAAI V D L C E K G D N F I R E Q T G N M Y K N V K208 GAAGAAGATTGAACGAGGTGTTGCTTTTCCAACTTGTTTATCTATCAACAATGTTGTTTGTCATTTCTCACCK K I E R G V A F P T C L S I N N V V C H F S P280 ACTTGCCAGTGATGACTCAGTGCTTGAAGAAGGTGATTTAGTGAAAATTGATATGGGTTGTCATATTGATGGL A S D D S V L E E G D L V K I D M G C H I D G352 CTTTATTGCTGTTGTTGCACACACTCATGTCATTCAAGAAGGTCCGGTAACCGGTAGAAAAGCTGATGTTCTF I A V V A H T H V I Q E G P V T G R K A D V L424 TGCAGCAACCAACACTGCTGCTGAGGTTGCTTTGAGGCTTGTGAGGCCTGGAAAAAACCAATATAGATGTAAA A T N T A A E V A L R L V R P G K N Q Y R C N496 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