人隐花色素蛋白I（hCRY1）的重组表达方法及其在制备放疗保护剂中的应用的制作方法[0002]癌症是人类健康的最大敌人，全世界每年死于癌症的人数接近1000万人。在癌症的临床治疗中，手术、放疗及化疗是三种最主要的治疗方法，其中放疗因其适应症比较宽泛，选择性较大，70%以上的恶性肿瘤患者在其治疗的某个阶段都需要接受放疗。[0003]放射治疗的目的是最大限度地将放射剂量集中到病变区(靶区)内，杀灭肿瘤细胞，而周围正常组织或器官少受或免受不必要的照射，一些重要器官如脑干、晶体、脊髓、肾、性腺等，则需要特别保护。无论是传统放疗技术还是现代精确放疗技术，都不能做到在治疗肿瘤的同时完全保护正常组织，例如需要照射的肿瘤周围存在较多的重要器官或正常组织；肿瘤与正常组织或重要器官相互交错；肿瘤组织包绕重要器官等。因此，寻找一些尽可能地保护正常皮肤、组织、器官的方法就成为了放疗过程中减轻患者痛苦、提高治疗效果的关键所在。为此本专利申请表达并纯化了重组hCRYl——一种具有修复紫外照射损伤功能的蛋白质，并初步验证了该蛋白在射线吸收、紫外损伤防护中的作用。[0004]现代时间生物学认为，在自然界中从单细胞动物到高等生物，以及人类的所有生命活动均存在着按照一定规律运行的、周期性的生命活动现象。经过大量的实验研究证明，这种生命活动现象是明显的节律性活动，称为生物节律。1993年所发现的隐花色素基因(Cry)就是目前人们所发现的节律基因之一。隐花色素是一种能够感受蓝光和近紫外光(330-390nm)区域的光受体，在几乎所有种类的植物中都有所发现，同时在昆虫、哺乳动物中都有编码隐花色素的同源基因。不同种类的隐花色素都是由接受光信号的生色团和应答光信号的脱辅基蛋白组成，脱辅基蛋白部分共有两个结构域。其中位于N端的PHR结构域是高度保守的，该结构域与光裂解酶十分相似，是生色团的结合区域，但其却并不具有光裂解酶活性；而(:端的DAS结构域则是一个在不同物种中长度变化较大的非保守区域，一般负责信号的输出。[0005]迄今为止，动物体内所发现的隐花色素主要有CRYl和CRY2两种，它们与光裂解酶家族共同调节生物体对于紫外线和蓝光小剂量照射的适应性反应，参与DNA光修复的调控，并与动物的生长、发育、磁感知及生理节律均有着密切的联系。与CRY2相比，CRYl参与的更多是光依赖型转录抑制，它与Bamll/CLOCK蛋白二聚体、Perl等节律相关蛋白直接作用，并在节律性生理周期中直接起负调控作用。[0006]紫外、X-ray等射线照射会导致细胞中产生DNA双链断裂，DNA双链断裂诱导细胞产生H2AX FOCI，后者在DNA双链断裂的修复中起重要作用，因此本实验通过免疫荧光的观察和量化细胞内H2AX FOCI的荧光强度来检测细胞的损伤程度，并进一步证实了 hCRYl在放射损伤防护中的功能。[0007]由于动物中天然状态的CRYl含量低，分离获得大量天然产物十分困难。而多肽合成成本过高，缺乏作为药物生产的应用前景。迄今为止，亦无文献报道过动物CRYl蛋白的原核表达纯化方法。因此本研究探寻了一套原核表达纯化hCRYl的技术路线，通过构建其原核表达载体pET28a(+)-hCRYl，在E.coliBL21 (DE3)中表达，并分离纯化出较高纯度的具有射线吸收及紫外损伤防护活性的重组蛋白，为进一步研究hCRYl提供了便利条件，也为将hCRYl开发成为新的放疗保护剂提供了理论基础。

[0008]本发明涉及一种重组hCRYl蛋白的表达方法，特别涉及一种重组hCRYl蛋白的原核表达方法。
[0009]本发明的重组hCRYl蛋白的原核表达方法包括以下步骤:构建表达质粒，诱导重组蛋白表达，纯化重组蛋白，重组蛋白活性及功能检测。
[0010]其中优选的，上述构建表达质粒的步骤包括:将hCRYl连接入原核表达载体，如pET28a(+)。具体为:通过PCR扩增获得hCRYl基因，再与载体pET28a(+)分别用限制性内切酶XhoI与BamlI酶切后用T4DNA连接酶连接，最终获得重组表达质粒pET28a (+) -hCRYl。其中，优选的，hCRYl蛋白如SEQ ID N0:1所示。
[0011]其中优选的，上述诱导重组蛋白表达的步骤包括:将构建好的表达质粒转入宿主细胞后诱导表达，其中宿主细胞优选E.coli BL2KDE3);其中优选在转入宿主细胞后，通过SDS-PAGE筛选表达量高的克隆细胞。具体为:将pET28a(+)-hCRYl转入感受态细胞E.coli BL2KDE3)中并涂板培养，次日挑数个(5个)不同的单菌落克隆分别接入含卡那霉素的LB培养基中，摇菌过夜后以1:100转接到新鲜的含卡那霉素的LB培养基中进行放大培养；于三角烧瓶中摇菌并诱导6h后离心收菌；将所收菌体用PBS洗涤并重悬，加入蛋白酶抑制剂PMSF后进行超声破碎；从每份破碎样品中取20 μ I样品进行SDS-PAGE分析，挑选出目标蛋白条带较亮、杂蛋白条带较弱(即表达量高)的克隆，_80°C保菌储存并命名为BL21-hCRYl-b。
[0012]其中优选的，上述纯化重组蛋白的步骤包括，将诱导表达的菌株破碎，离心，获得包涵体，再将包涵体复性，经纯化后获得有活性的重组蛋白。其中，包涵体复性的步骤包括:洗漆包涵体，溶解包涵体，梯度透析，复性。具体为:用20ml新配置的包涵体洗漆液(溶液A)将包涵体重悬,离心保留沉淀；于洗漆后的沉淀中加入20ml新配置的包涵体溶解液(溶液B)，先将沉淀吹打成小块，再进行超声破碎助溶，破碎完毕后放置于24°C摇床、IOOrpm溶解2h，溶解完毕后离心分离并保留上清，沉淀则再用适量溶解液重复上述步骤溶解，直至沉淀体积不再明显减少；将蛋白溶液装入透析袋中，于5L烧杯中用2L含6M尿素、50mMTris-base、50mM NaCl的透析液透析，并逐渐将透析液中尿素浓度降至3M ;将装有蛋白溶液的透析袋从之前的透析液移至4L蛋白复性液(溶液C)中，于4°C环境室中搅拌透析24h ;此后再将装有蛋白溶液的透析袋移入2L上样缓冲液(溶液D)中于4°C环境室中搅拌透析，直到透析袋内有明显的白色絮状析出且数量不再增多(约24-48h)。其中，包涵体洗涤液(溶液 A)的配比为:50mM Tris_base、0.5mM EDTA、50mM NaCl、l%Triton X_100、2M 尿素，用NaOH调节pH至8.0 ;包涵体溶解液(溶液B)的配比为:50mM Tris_base、0.5mM EDTA,50mM NaCl、8M尿素、ImM PMSF，用NaOH调节pH至8.0，蛋白复性液(溶液C)的配比为:100mMTris-base、400mM精氨酸、2M尿素、5mM EDTA、5mM GSH、0.5mM GSSG，用 NaOH调节 pH至 8.0 ；上样缓冲液(溶液D)的配比为50mM Tris-base、50mM NaCl，用NaOH调节pH至8.0。其中，纯化的步骤包括:镍柱纯化后，超滤置换。镍柱纯化的操作过程具体为:将透析后的蛋白液离心保留上清，用IOKD超滤管浓缩蛋白体积，于4°C环境室中上样于预先用溶液D平衡好的Iml纯化镍柱中，收集流穿液并将其再次上样，重复多次以保证目的蛋白与镍柱充分结合，之后用上样缓冲液洗柱，将纯化柱侧壁上的残留样品洗净，用IOml含有40mM咪唑的上样缓冲液洗去纯化柱上结合的杂蛋白之后，再用IOml含有200mM咪唑的上样缓冲液洗脱目标蛋白，多次重复洗脱，以保证洗脱效率。超滤置换的操作过程具体为:将上步所得的蛋白样品稀释后，再用IOkD超滤管浓缩进行超滤置换，重复多次，以去除洗脱液中咪唑，最后将蛋白溶液浓缩至5ml。[0013]其中优选的，上述重组蛋白活性及功能检测的步骤包括，利用胞内FOCL荧光强度来检测hCRYl蛋白的功能性。具体为:将纯化获得的hCRYl与经过处理的BSA(对照蛋白)分别以相同浓度加入含有Hela细胞的培养基中,X-ray照射后,先后用抗体Phospho-HistoneH2A.X、山羊抗兔IgG/FITC孵育细胞后，制片观察，在完全相同的观察条件下，肉眼可见两组细胞中形成的FOCI荧光强度差异十分显著。其中对BSA的处理为用咪唑配置一定浓度的BSA，经镍柱上样流出以及与hCRYl样品处理时完全相同的超滤置换后，稀释至与hCRYl浓度相同作为对照(cBSA)。
[0014]此外，为进一步证实细胞内FOCI的减少是由于hCRYl的射线防护作用，在HaCaT细胞中进行hCRYl浓度梯度实验并设立未经X-ray照射的对照组，结果表明，当细胞培养基中的hCRYl浓度达到50μ g/ml时，FOCI的荧光强度明显降低。此外，还分别检测了 hCRYl和对照BSA对细胞凋亡的影响，分别用相同浓度的hCRYl和处理后的BSA处理两组相同细胞，Ih后与另一组未加任何蛋白的细胞一起检测细胞凋亡情况，用细胞凋亡检测试剂盒对细胞进行双染后用流式细胞仪进行分析；结果表明Ih之内，不论是hCRYl还是BSA都不会造成细胞凋亡，该结果进一步证明FOCI荧光强度的降低是因为细胞内DNA所受损伤的减少而非细胞的凋亡。
[0015]目前，大肠杆菌表达系统广泛用于重组蛋白的生产，其优点是表达水平较高、操作简单。本研究选用pET28a(+)作为表达载体，通过上述原核表达纯化方法，平均每升菌液可收获hCRYl约20-25mg，产率远高于目前所已知的其他方法，而由于该原核表达纯化方法所需要的培养基及后续纯化原料相对廉价，成本经计算远低于真核表达纯化方法和化学合成多肽方法。在大规模生产应用中，该方法提供了复性原料进行重复利用的可能性，这也将极大地降低成本。另外此方法操作过程简单，容错率高，操作人员不需要大量的专业知识即可进行生产工作。并且由本方法纯化获得的蛋白产物经验证具有预期的射线吸收功能和放射损伤防护活性，是具有开发成为放疗保护类药物潜质的活性蛋白。
[0016]由于通过实施例验证了添加有hCRYl的细胞在受到射线损伤时所产生H2AX FOCI明显减少，并且该减少并非由hCRYl对细胞造成了损伤所引起的，因此可以证实hCRYl对细胞有紫外损伤防护作用。因此本发明制备的重组hCRYl可用作放疗保护剂，如制备成放疗保护剂类药物，特别是皮肤放疗保护剂。本发明还提供一种组合物，该组合物含有本发明制备的重组hCRYl以及药学上可接受的载体或辅料，该组合物可用于放疗保护相关方面。



[0018]图1:原核表达质粒pET28a(+)_hCRYl的构建流程图；
[0019]图2:左图为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，右图为原核表达质粒的酶切检测结果，其中M为DNA Marker ；
[0020]图3:高效表达hCRYl菌株的筛选结果，上图为不同单菌落诱导表达效果检测结果，下图为对应条带灰度值以及目标蛋白与杂蛋白比例结果，其中M为蛋白质Marker ；
[0021]图4:BL21-hCRYl_b的诱导表达结果，上图为SDS-PAGE结果，下图为Western blot结果;
[0022]图5:上图为质谱鉴定目标蛋白条带结果，下划线部分为与hCRYl氨基酸序列相匹配的部分，下图为以上序列在NCBI数据库中比对结果，其中hCRYl得分最高；
[0023]图6:左图为镍柱纯化前后蛋白浓度的测量结果，右图为镍柱纯化过程中，上样前、上样流穿液、50mM咪唑洗杂液和300mM咪唑洗脱液的SDS-PAGE分析结果，其中M为蛋白质 Marker ；
[0024]图7:左图为超滤置换前后蛋白浓度的测量结果，右图为超滤置换前后的SDS-PAGE分析结果，其中M为蛋白质Marker ；
[0025]图8:左图为经X-ray照射后的对照组(cBSA)与实验组(hCRYl)细胞内FOCI荧光强度比对结果，右图为以上两组细胞荧光强度量化结果(***P〈0.001)；
[0026]图9:左上图为加入不同浓度梯度hCRYl的HaCaT细胞未经X_ray照射时细胞内的FOCI荧光强度结果，左下图为加入不同浓度梯度hCRYl的HaCaT细胞经X-ray照射后细胞内的FOCI荧光强度结果，右图为每组细胞荧光强度量化结果(#P〈0.05，*#P〈0.001)；
[0027]图10:hCRYl和处理之后的BSA对细胞凋亡的影响比对结果。

[0028]实施例
[0029]本发明下面所述是以实施例对本发明进一步说明，本发明并不限于以下实施例。对于本发明所述方法的实施例如下:
[0030]1、原核表达质粒pET28a(+)_hCRYl的构建:
[0031]以实验室保存的hCRYl真核表达质粒pcDNA3.Ι-hCRYl为模版，根据hCRYl的编码区序列设计特异性引物:上游引物为hCRYlFW (5’ -ATACTCGAGGCTAAGCCTTCC-3’)，下游引物为hCRYlRV(5’ -CGCGGATCCTACGTTTATACT-3’)(上下游引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成)。PCR扩增出所需目的片段(总体系25uL，94°C预变性3min，32个循环:940C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，最后72°C延伸10分钟)。用限制性内切酶XhoI与BamlI(TAKARA)酶切目的片段与原核表达载体pET28a(+)，然后用T4DNA连接酶连接带有粘性末端的载体与目的片段，最终获得原核表达质粒pET28a(+)-hCRYl，如图1所示。
[0032]用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，得到大小约为1900bp的条带，如图2左图所示，证实目的片段已成功扩增。用电泳检测酶切产物，可得到大小约为1900bp的目的片段条带和大小约为5300bp的载体条带,如图2右图所示,证实原核表达质粒构建成功。
[0033]2、诱导重组蛋白表达
[0034]2.1优秀克隆的筛选[0035]将上述重组质粒pET28a(+)_hCRYl转化至感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中，涂板培养，次日挑取5个不同的单菌落克隆，分别接入含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，摇菌过夜后以1:100转接到新鲜的含50mg/L卡那霉素的LB培养基中进行放大培养。于三角烧瓶中摇菌至菌液0D600值0.6-0.8之间(最好约为0.6)后，加入ImM诱导剂IPTG，24°C、200rpm诱导6h后离心收菌。将所收菌体用PBS洗涤并重悬于30ml PBS中，加入ImM蛋白酶抑制剂PMSF后进行超声破碎。从每份破碎样品中取20 μ I样品进行SDS-PAGE分析，电泳结果如图3上图所示，分别测量目标蛋白与杂蛋白条带灰度值并计算比例，挑选目标蛋白比例最高的b克隆(即目标蛋白条带较亮、杂蛋白条带较弱的克隆)(图3下图)，-80°C保菌储存并命名为BL21-hCRYl-b。之后的所有实验均使用该菌株完成。
[0036]2.2融合蛋白的诱导表达及鉴定
[0037]使用b克隆重复诱导表达实验并放大诱导体系至1L，菌体破碎后上清与沉淀分别用SDS-PAGE分析，电泳结果如图4上图所示,用His抗体进行Western Blot,结果如图4下图所示，证明大部分目的蛋白以包涵体的形式表达。将目标条带切下，交由中科院微生物所仪器中心进行质谱鉴定。质谱鉴定结果如图5上图所示，hCRYl蛋白的氨基酸序列如SEQID N0:1所示。与NCBI数据库比对结果如图5下图所示，证实该蛋白确实为hCRYl。
[0038]3、纯化重组蛋白
[0039]3.1包涵体的洗涤
[0040]用20ml新配置的包涵体洗漆液(溶液A,配方为:50mM Tris_base、0.5mM EDTA、50mM NaCl、l%Triton X_100、2M尿素，用NaOH调节pH至8.0)将包涵体重悬，超声破碎，离
心保留沉淀。
[0041]3.2包涵体的溶解
[0042]于洗漆后的沉淀中加入20ml新配置的包涵体溶解液(溶液B,配方为50mMTris-base,0.5mM EDTA、50mM NaCl、8M 尿素、ImM PMSF，用 NaOH 调节 pH 至 8.0)，先将沉淀吹打成小块，再进行超声破碎助溶。破碎完毕后放置于24°C摇床，IOOrpm溶解2h。溶解完毕后离心分离并保留上清，沉淀则再用适量溶解液重复上述步骤溶解，直至沉淀体积不再明显减少。最后将多次溶解后上清收集在一起，去除沉淀。
[0043]3.3梯度透析复性
[0044]透析全程在4°C环境室中进行并保持磁力搅拌。将上步所得蛋白溶液装入IOkD透析袋中，于5L烧杯中用2L含6M尿素、50mM Tris-base、50mM NaCl的透析液透析，并逐渐将透析液中尿素浓度降至3M。将装有蛋白溶液的透析袋从之前的透析液移至4L蛋白复性液(溶液 C，配方为 IOOmM Tris-base、400mM 精氨酸、2M 尿素、5mM EDTA、5mM GSH.0.5mM GSSG,用NaOH调节pH至8.0)中透析24h。此后再将装有蛋白溶液的透析袋移入2L上样缓冲液(溶液D，配方为50mM Tris-base、50mM NaCl，用NaOH调节pH至8.0)中进行透析，直到透析袋内有明显的白色絮状析出且数量不再增多(约24-48h )。
[0045]3.4镍柱纯化
[0046]将透析后的蛋白液离心保留上清。用IOKD超滤管将蛋白溶液总体积浓缩至20ml。取少量复性后的总蛋白样品稀释10倍，用Bradford蛋白含量检测试剂盒(由南京凯基生物物质发展有限公司购买)测量蛋白浓度。于4°C环境室中上样于预先用溶液D平衡好的Iml纯化镍柱(由上海七海复泰生物科技有限公司购买)中，收集流穿液并将其再次上样,重复多次(至少5次)以保证目的蛋白与镍柱充分结合。之后用上样缓冲液(溶液D)洗柱，将纯化柱侧壁上的残留样品洗净。用IOml含有40mM咪唑的上样缓冲液洗去纯化柱上结合的杂蛋白之后，再用IOml含有200mM咪唑的上样缓冲液洗脱目标蛋白，多次重复洗脱以保证洗脱效率。蛋白经过镍柱纯化后，从IOml洗脱液中取少量样品稀释10倍后再次测量蛋白浓度(如图6左图所示)，可得镍柱纯化后的总蛋白回收率约为22.2%。将镍柱纯化前蛋白溶液样品与镍柱纯化过程中收集的流穿液、洗杂液、洗脱液共同进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后如图6右图所示，可见杂蛋白已被显著去除，蛋白纯度已达到95%以上。
[0047]3.5超滤置换
[0048]将上步所得的蛋白样品用上样缓冲液稀释10倍，再用IOKD超滤管浓缩至原体积，重复多次(至少3次)，以去除洗脱液中咪唑，最后将蛋白溶液浓缩至5ml，得到可溶性hCRYl蛋白溶液成品。置换前后分别取少量样品稀释10倍后用Bradford蛋白含量检测试剂盒(由南京凯基生物物质发展有限公司购买)测量蛋白浓度，如图7左图所示，蛋白回收率约为93.8%。分别将超滤置换前后样品进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，如图7右图所示。[0049]4、重组蛋白活性及功能检测
[0050]取纯化后的蛋白溶液稀释至500 μ g/ml以作备用，同时用300mM咪唑配置lmg/mlBSA蛋白，经镍柱上样流出以及与hCRYl样品完全相同的超滤置换后，稀释至500 μ g/ml作为对照(cBSA)。将Hela细胞爬片铺板培养至约80%_90%细胞密度时换液，三小时后，分别将备好的hCRYl与对照蛋白按照与培养基1:1的比例加入细胞培养液，使每个孔内液体总体积为2ml,加入蛋白终浓度为250 μ g/ml ο之后立刻将两组细胞置于X_ray照射机内进行照射，每分钟剂量为1.132/Gy，照射时间530s，总剂量为10Gy。照射之后立刻将细胞培养液均换为实验前的培养基(DMEM)继续培养45分钟后收细胞爬片。用PBS洗片3次，100%甲醇_20°C固定细胞5min，再用PBS洗3次，5%BSA封闭过夜后，用抗体Phospho-Histone H2A.X于37°C孵育细胞lh，再用PBS洗3次，再用抗体山羊抗兔IgG/FITC于37°C孵育细胞lh，PBS3次洗后封片，激光共聚焦显微镜观察两组细胞内磷光体亮度，在完全相同的拍摄条件下每片分别取3个不同视野统计平均荧光强度。在完全相同的观察条件下，肉眼可见两组细胞中形成的FOCI荧光强度差异十分显著(图8左图)，随机选取3个视野并将荧光强度量化，两组之间差异极其显著(P〈0.001)(图8右图)。由此可知，本专利申请制备的hCRYl降低了细胞中FOCI的荧光强度，对细胞起到了一定的保护作用，减少了 X-ray的侵害。
[0051]为进一步证实细胞内FOCI的减少是由于hCRYl的射线防护作用，本专利申请中，在HaCaT细胞中进一步进行hCRYl浓度梯度实验并设置未经X_ray处理的对照组细胞，用上述经处理后的BSA溶液稀释hCRYl溶液来设立浓度梯度，用同样方法处理细胞，制片并观察。结果表明，当细胞培养基中的hCRYl浓度达到50 μ g/ml时，FOCI的荧光强度明显降低(图 9)。
[0052]本专利申请还分别检测了 hCRYl和处理之后的BSA对细胞凋亡的影响。在两组细胞中分别加入250 μ g/ml hCRYl和250 μ g/ml处理后的BSA，Ih后与另一组未加任何蛋白的细胞一起检测细胞凋亡情况，用细胞凋亡检测试剂盒(由南京凯基生物物质发展有限公司购买)对细胞进行双染后用流式细胞仪进行分析。结果表明Ih之内，不论是hCRYl还是BSA都不会造成细胞凋亡，该结果进一步证明FOCI荧光强度的降低是因为细胞内DNA所受损伤的减少而非细胞的凋亡(图10)。[0053]表1:蛋白纯化表
[0054]经统计，每升菌液可获得约25mg hCRYl ;得率=每个步骤总hCRYl/前一步骤总蛋白量
[0055]