专利名称：水稻花期干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用的制作方法随着世界环境的变化和人口数目的增多，粮食问题越来越突出，尤其是对于人口基数大的发展中国家。水稻是在亚洲地区广泛种植的一种主要粮食作物，已经有上千年的种植历史。但是水稻的种植对淡水资源的需求量很大。随着全球气候的不断变化，在一些地区已经出现了气候的异常，如雨季，河流汛期的改变等等，会造成一些水稻主要产区的水资源的短缺，对水稻的产量影响很大。在我国的北方地区温度条件已经可以满足水稻的生长， 而且由于北方地区昼夜温差大的气候特点反倒会促进水稻糖分的积累，种出的水稻具有口感好，糖粉积累多等优点，只是因为水资源不够丰富而没办法大力推广种植，所以在全国范围内对于耐旱品种的研究和推广就很有必要。水稻作为一种淡水资源依存度比较高的农作物，对干旱非常敏感。与其他植物相比，水稻对水分胁迫更为敏感，水分亏缺会使植株发育受阻，分蘖减少，花粉败育，产量减少等。植物生理学家和育种专家对水稻的长期种植实践和观察发现，生殖发育时期有几个阶段对外界逆境非常敏感，此时遭受胁迫可能会导致产量的大幅度下降，比如说水稻的第一苞分化至颖花原基分化始期(决定花的个数)，减数分裂期(决定雌雄育性)，灌浆期(决定种子饱满程度，千粒重)。这些时期遭受干旱胁迫会使得花的个数减少、颖花退化、空瘪等(杨弘远编著.水稻生殖生物学.2005，浙江大学出版社)。近年来对于植物对干旱响应过程的研究表明，植物遭遇干旱逆境时，植物体迅速感知外部信号，并迅速传导到细胞内部，进而激活许多干旱胁迫应答基因的表达，在植物体内产生大量的特异性蛋白，协同调节植物生理生化一级代谢的变化，从而提高对干旱的耐性。同时随着水稻全基因测序工作的完成，针对水稻组织的全基因组表达技术如基因芯片、 蛋白质组分析等的不断发展和完善，使得我们分析克隆水分亏缺条件下的响应基因，进而从中发现新的抗旱基因和抗旱调控元件成为可能。
本发明的目的是提供一个来源于水稻的可应答干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及该编码基因的调控元件在报告水稻干旱程度中的应用。本发明对处于花期的水稻进行干旱胁迫处理，利用基因芯片技术进行转录谱分析，筛选出一个干旱胁迫后诱导表达的基因0s01g0702500。0s01g0702500是一个脱水素蛋白，能稳定细胞膜和许多大分子的结构以避免脱水对细胞造成的伤害，在抗旱过程中起到重要作用。对基因彻似冰进一步分析后发现，该基因的表达图谱具有非常高的专一性，且该基因的启动子为诱导型启动子，故0s01g0702500仅在受到干旱胁迫的水稻花穗中特异表达，以抵御干旱逆境。利用这一特性，本发明在该基因的启动子3’端连接一个报告基因GUS，在植物受到干旱逆境胁迫时，报告基因便开始表达，经过一种便捷有效的染色方法就可以估量植物水分的缺失，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。flsiV冰蛋白及其编码基因的特性让我们对此基因在研究抗旱功能方面有很高的期望，对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。而该基因的启动子不仅可以通过驱动报告基因表达提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的手段，同时这个启动子还可以驱动其他抗旱基因，使植物受到干旱胁迫时超量表达特定的抗旱蛋白，以抵御干旱的伤害。因而本发明涉及的这种可以有效应答水稻干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及这种基因的有效的专门响应干旱刺激的启动元件在水稻抗旱中应用前景广阔。本发明所提供的可应答干旱的基因，名称为0s01g0702500,来源于水稻 sativa ssp. japonica)；是下述氨基酸残基序列之一1)序列SEQ ID No 1 ；2)将序列SEQID No :1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。序列SEQ ID No: 1由188个氨基酸残基组成。编码本发明0s01g0702500,是下述核苷酸序列之一1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；2)编码序列SEQID No: 1蛋白质序列的DNA ；
3)与序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
4)在高严谨条件下可与序列SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为用0. IX SSPEO^O. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在65 °C下杂交
并洗膜。序列SEQ ID No:2由567个碱基组成，其编码框为自5’端第1位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No: 1的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明所提供的可应答干旱的基因OsOl的702500的调控元件为该基因的启动子区域，是是下述核苷酸序列之一
1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；
2)与序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
3)在高严谨条件下可与序列SEQID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为用0. IX SSPEO^O. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在65 °C下杂交
并洗膜。本发明还提供含有本发明基因及其专门响应干旱刺激的启动子元件的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该序列中任一片段的引物对。本发明还提供一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法。在实际应用中，将0s01g0702500的启动子(promoter)与报告基因Gtt 融合，将该构建0s01g0702500p-GUS转化水稻，可以估量植物水分的缺失。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。本发明的flsiV冰是一个抗旱基因，可以在水稻花期受到干旱胁迫时大量表达，以抵御干旱逆境。而0s01r0702500d-GUS的转基因植株可以报告水稻水分的缺失。本发明不但提供了一种抗旱基因，更提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法，同时也对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。即本发明基因的调控元件可在水稻抗旱中的获得应用。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。


图1为水稻幼苗(seedling)、未进行干旱处理的水稻花序(flower)和进行干旱处理后的水稻花序(drought-induced flower)中As似冰的表达水平。图2为pCAMBIA1301-flsi 7冰转化水稻植株与野生型水稻经过干旱处理后花苞中的⑶S染色结果。

)和 5’- CAAACCCAACACACAACGCTA-3’ (SEQ ID No:5)。反应按照下列程序进行预变性95°C 3分钟，1个循环；变性95°C 10秒，退火与延伸60°C 30秒，40个循环。对比该基因的在幼苗时期(seedling)、未受干旱胁迫的花期(flower)和受到干旱胁迫的花期 (drought-induced flower)的表达量，我们发现0s01g0702500的表达具有非常高的专一性，仅在受到干旱胁迫后的水稻花穗中特异表达(图1)。实施例2. AsiV冰洲启动子的克隆。提取水稻总DNA，以水稻总DNA为模板，PCR扩增0s01ff0702500的启动子部分。(引物序列分别为5，-AAGCTTTTTGCACTGTTGTATTTTTTGA-3，(SEQ ID No:6)， 5，-CCATGGTGGTTGGTGTCGTCGAGTTGCT — 3，( SEQ ID No:7 )。50ul PCR 反应体系包含模板 2ul，高保真酶 KOD plus (Τ0Υ0Β0) lul，10X 缓冲液 5ul，2. 5uM dNTP 8ul，20uM 的 5， 和3，引物各lul，水32ul。反应条件为94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，55°C退火1分钟，68 °C延伸2分30秒，共30个循环。，然后将PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到2040bp的扩增片段。PCR产物经历id III和AfcoI酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体 pCAMBIA1301 杆菌表达质粒 OCkM&lkl30l-0s01ff0702500p-GUSo实施例3.重组质粒PCAMBIA1301- fe似冰7似颁伽-g依转化水稻植株。将重组质粒pCAMBIA1301_fe似冰依转化到水稻中。参照Hiei等(PlantMol Biol, 1997,35 :205 — 218)的方法转化水稻。将质粒dCAMBIA1301 -Qs01s0702500d-GUS 通过电激法转入根瘤农杆菌EH105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒 pCAMBIA1301-fe似冰依的农杆菌EH105接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28°C摇菌培养至对数生长期晚期，再1 :100扩大培养到0D600为0.5左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至IOcm 左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得Tl代种子。实施例4.质粒x^kWAkY^l-OsOlg0702500d-GUS转基因水稻棺株报告干旱胁迫效果的检测。将得到的转基因水稻Tl代种子与野生型水稻正常种植，在花期初期对两组水稻进行为期1周的干旱处理。取两组水稻的花序浸于⑶S染色中，于37°C放置24h后，70%乙醇浸泡Mh以洗脱杂色，观察经过干旱处理与对照组的花器染色程度。图2即为转基因水稻植株和野生型水稻花序的GUS染色结果。未受干旱处理的转基因水稻植株，其花序里报告基因⑶S的表达水平非常之低，而受过干旱处理的转基因水稻植株，其报告基因却呈现了高度表达，因而证明了的启动子为一种干旱诱导型的启动子，在植物受到干旱胁迫后在花器官中诱导表达。同时我们的结果还提供了一种检测植株水分缺亏的方法，即通过便捷有效的染色就可以估量植物水分的缺失，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。


本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种水稻花期干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用。本发明的蛋白的氨基酸残基序列如SEQIDNo1所示；编码所述蛋白的干旱胁迫应答蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；本发明还提供一个水稻抗旱基因及建立于此基因调控元件基础上的有效检测植物所受干旱胁迫程度的方法。经检测，该方法具有快速、有效估量水稻植株所受干旱的特点。本发明为植物缺水检测提供了一种快速、便捷、有效的方法，并为植物抗旱研究及干旱育种提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。