一种蕲蛇提取物及其应用的制作方法(-)[0002]蕲蛇属蜂科五步蛇[Agkistrodon ac μ t μ s (G μ enther)]的干燥体，味甘，咸，性温，具有祛风，通络，止痉的功效。将蛇入药自古有之，《开宝本草》载:“主中风湿痹不仁，筋脉拘急，口面喁斜，半身不遂，骨节疼痛，大风疥癞及暴风瘙痒，脚弱不能久立”。化学成分研究表明，蕲蛇主要化学成分有脂肪、脂质、挥发油、脂肪酸类、维生素类、磷脂及氨基酸及小分子类化合物，另外还含有3种毒蛋白和大量的稀有氨基酸类，并含透明质酸酶、精氨酸脂酶及阻凝剂等(王贵金，孙佳明，王丹，等.蝮蛇肉中肌苷的HPLC-MS/MS鉴定与含量测定.世界科学技术-中医药现代化，2007.9 (5) 68-71)。[0003]现代研究认为，蛇组织有强烈的生物活性，应用得当，疗效确切，诸如止痛、抗炎、扶正等方面都有着独特的效验。诸蛇之功效多近似，我们利用风湿病研究平台临床应用发现，蕲蛇 在治疗风湿性疾病中可以有效减少糖皮质激素的使用量，起到类激素样作用，而且无副作用(司徒忠，谢冠群，谢志军，范永升教授治疗风寒湿痹经验.浙江中医药大学学报，2008.第32: (2)，300-301)。方炳福等报道，用中药虫、蛇类药物治疗风湿性关节炎50例，总有效率分别为90%和97%(方炳福，类风湿性关节炎治疗现状与展望.实用中医内科杂志，1998.12: (2)，13-14)。张海等报道，采用白蛇参附汤治疗类风湿性关节炎患者52例，获得满意疗效(张海，白蛇参附汤治疗类风湿性关节炎52例疗效观察，中华中医药杂志，2008.23 (7) ,651-652)。另外，通过小鼠试验，我们发现蕲蛇的水、醇提取液均有明显的抗炎作用，而且蕲蛇提取物明显抑制佐剂及胶原诱导的大鼠足肿胀(张纪达，等，蕲蛇水提取物对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10的影响，中华中医药杂志，2012.27(5)，1407-1409.谷恒存，等，蕲蛇水提液对佐剂性关节炎大鼠的免疫调节作用，中华中医药杂志，2012.27(10), 2676-2678)。[0004]目前对于风湿疾病患者而言，使用糖皮质激素(glucocorticoid)是常用的治疗方法，但是长期使用高剂量的糖皮质激素容易增加感染风险并引起骨质疏松和骨坏死等(Schacke H, et al, Mechanisms involved in the side effects of gl μ cocorticoids.Pharmacology&Therape μ tics, 2002.96, (I), 23-43)。筛选副作用小和治疗作用显著的类糖皮质激素药物而提高体内治疗指数是一个非常有前景的工作。Reichardi等观察至1J，糖皮质激素受体(gl U cocorticoid receptors, GR) 二聚体化区域氨基酸发生突变的转基因小鼠(GRdim/dim)不能形成二聚体(Reiehar dt HM, Kaestner KH, T μ ekermannJ, et al.DNA bingding of the glμ cocorticoid for receptor is not necessary forsurvival, cell, 1998.93 (4)，531-541)，但地塞米松在GRdim/dim小鼠及正常小鼠的炎症模型中，均表现出良好的抗炎活性。受此启发，大家开始寻找和开发选择性糖皮质激素受体调节剂(SGRMS )。SGRMS在与GR特异性结合后，主要发挥抑制核转录因子(η μ c I eartranscription factor, NF- κ B)和激活蛋白(activator protein-1, AP-1 等促炎症因子转录作用(非基因组效应)，对涉及糖异生、脂肪和氨基酸代谢等相关基因的转录激活作用减弱(基因组效应)，进而在产生抗炎效应的同时，降低其副作用(Cindy Stahn&FrankB μ ttgereit Genomic and nongenomic effects of glμ cocorticoids Nat μ re ReviewsRhe μ matology2008.7 (4)，525-533)。Ravindran等对糖皮质激素使用的剂量和治疗效果及安全性进行了统计，表明临床使用大剂量糖皮质激素抗炎时，主要以非基因组效应起作用，但不能抑制糖皮质激素的基因组效应，提出开发只保留非基因组效应的新型糖皮质激素的必要?生(Vinod Ravindran, Newer gl μ cocorticoids: Overcoming mechanistic h μ rdles.1ndian Jo μ rnal of Rhe μ matology, 2012.7 (4), 221 - 225)。此后，AL-4388、LGD5552、ZK216348和CpdA等化合物的相继出现，提示开发低毒副作用类糖皮质激素成分具有很大的可行性(Schacke H, et al, Dissociation of transactivation from transrepression bya selective gl μ cocorticoid receptor against leads to separation of therape μ ticeffects from side effects, Proc Natl Acad Sci MSA, 2004.101 (I), P227-32;Miner JN, etal, Antiinflammatory gl μ cocorticoid receptor ligand with red μ ced side effectsexhibits an altered protein-protein interaction Proc Natl Acad SciMSA, 2007.104 (49)，19244-19249)。发明人拟制备GR亲和层析柱，依据受体-配体理论从蕲蛇单方中富集可以和GR专一性结合的类似糖皮质激素的配体成分。[0005]天然药物的物质基础研究常用的方法是采用硅胶柱分离、鉴定、药理筛选等方式，这类方法存在试剂消耗量大、目标成分不明确等缺点。在本发明中，发明人利用GR亲和层析柱专一性筛选蕲蛇水提液中可以结合糖皮质激素受体的蕲蛇提取物，这样目标更明确而且需要的药材量更少，也为其他中药有效成分的获得提供了一种新的思路。(三)
[0006]本发明目的是提供一种新的从蕲蛇中筛选可与糖皮质激素受体结合的物质及应用；该方法筛选成分目标明确，使用的药材量少；所得到的蕲蛇提取物可以快速用于高效低毒的糖皮质激素受体选择性调节剂的筛选靶标。与传统化合物的分离鉴定相比，筛选出的化合物的特异性和有效性都更强。[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008] 本发明提供一种蕲蛇提取物，所述蕲蛇提取物的制备方法以糖皮质激素受体作为固定相，蕲蛇水煎剂作为流动相，收集蕲蛇水煎剂中可与糖皮质激素受体结合的蕲蛇提取液成分即蕲蛇提取物，具体所述蕲蛇提取物按如下方法制备:(1)糖皮质激素受体蛋白表达:向含糖皮质激素受体基因的重组工程菌经发酵培养获得的发酵液中加入IPTG (即异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导培养(优选IPTG的终浓度为ImM)，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀经超声破碎后提取蛋白，获得糖皮质激素受体蛋白；所述糖皮质激素受体基因的核昔酸序列为SEQ ID NO:1所不；(2)靳蛇提取物的制备:将步骤(1)制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到N1-NTA Agarose柱作为固定相，再将蕲蛇水煎剂作为流动相流过偶联糖皮质激素受体蛋白的N1-NTA Agarose柱，蕲蛇水煎剂中能和糖皮质激素受体结合的物质会结合到N1-NTA Agarose柱上，然后PBS洗漆N1-NTA Agarose柱两次，加入IgG ElutionBuffer洗脱液(优选购自21004PIERCE公司)进行洗脱进行洗脱，直接收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备:将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1:100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液冷冻干燥后用pH值为7.0的磷酸缓冲液溶解(缓冲液的体积用量多少对本发明没有影响，通常根据所需蕲蛇水煎剂的量定)，过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。
[0009]本发明所述蕲蛇水煎剂具体按如下步骤制备:蕲蛇干燥体20g，打碎，加双蒸水2000ml (即2000g)，煎药罐煎煮至100ml，过滤后将溶液在_20°C冷冻干燥，粉碎成固体粉末，用PH值为7.0的磷酸缓冲液溶解，过滤(优选用0.25 μ M微孔滤膜过滤)，滤液即为蕲蛇水煎剂。进一步，步骤(1)所述重组工程菌发酵培养的方法为:将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37°C、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100 μ g/ml的氨苄青霉素(々111?1(^111114111?)，在371:、200印111条件下培养至OD6tltl达到0.6~0.8，获得发酵液。
[0010]进一步，步骤(1)所述发酵液诱导培养的条件为:向发酵培养液中加入终浓度ImM的IPTG，在15°C、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液。
[0011]进一步，步骤(1)所述蛋白提取方法为:将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度ImM的苯甲基磺酰氟(Phenylmethanes μ lfonyl f I μ oride, PMSF),在功率 300W、温度 4°C条件下超声破碎，超声10s，间隔10s，超声lOmin，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和PMSF (尿素溶解液的用量能够溶解沉淀即可，通常为离心获得沉淀体积的10倍，PMSF的用量通常在尿素溶解液中的终浓度ImM)，吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，离心，取沉淀，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为:尿素24.04g,氯化钠0.8766g,磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL。更进一步，本发明所述蕲蛇提取物按如下方法制备:(1)糖皮质激素受体蛋白制备:将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37°C、200 rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为lOOμg/ml的Amp，在37°C、200rpm条件下培养至0D_达到0.6~0.8，向培养液中加入终浓度ImM的IPTG，在15°C、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度ImM的PMSF，在功率300W、温度4°C条件下超声破碎10s，间隔10s，超声lOmin，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和PMSF，吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，离心，取上清液，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为:尿素24.04g,氯化钠0.8766g,磷酸钠0.9503g,加蒸懼水定容至50mL ; (2)蕲蛇提取物:将步骤(1)制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到N1-NTA Agarose柱作为固定相，将蕲蛇水煎剂作为流动相流经偶联受体蛋白的N1-NTA Agarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备:将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1:100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液在_20°C冷冻干燥后粉碎成粉末，然后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，用0.25 μ M微孔滤膜过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。
[0012]本发明还提供一种所述蕲蛇提取物在制备糖皮质激素类抗炎药物中的应用。糖皮质激素主要通过与糖皮质激素受体结合，激活糖皮质激素受体与NF-κ B互作，从而起到抗炎作用，糖皮质激素受体主要通过与NF- κ B和AP-1等相互作用，抑制NF- κ B和AP-1促炎症因子转录作用，从而产生抗炎效应。通过细胞学实验检测表明本发明所分离的蕲蛇提取物可以显著增强糖皮质激素受体与NF-K B的相互作用，提示该结合物具有抗炎活性。
[0013]本发明所述蕲蛇提取物的制备流程为:
[0014](I)基于NCBI网站上糖皮质激素受体全序列，采用RNA逆转录的方法扩增糖皮质激素受体全基因，并进行核苷酸改造，使其适合原核表达体系，改造后的核苷酸序列为SEAID NO:1所示，所翻译的氨基酸序列为SEA ID NO: 2所示。
[0015](2)将步骤(1)中合成的全基因构建在原核表达载体中。
[0016](3)将构建好的原核表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导糖皮质激素受体蛋白表达，筛选高效表达糖皮质激素受体的原核表达体系。
[0017](4)制备偶联糖皮质激素受体的镍柱。
[0018](5)已偶联的镍柱作为固定相，蕲蛇水煎剂作为流动相，富集可与糖皮质激素受体结合的化合物，采用蛋白洗脱液(即IgG Elution Buffer洗脱液)进行洗脱，收集蕲蛇提取物，获得的蕲蛇提取物经过液质联用色谱进行结构分析，结果表明在IOmin和Ilmin时均有峰出现。
[0019]本发明步骤(1)所述的糖皮质激素受体全基因的克隆方法为本领域公知技术，可以采用相关商品化试剂盒进行克隆扩增，但是在本发明中我们针对克隆的核酸序列通过合成拼接的方式使之更适合于原核表达，获得SEQ ID NO:1所示的序列。
[0020]与现有技术相比， 本发明有益效果主要体现在:本发明涉及一种以蕲蛇水煎剂为流动相，以偶联糖皮质激素受体蛋白的N1-NTA Agarose柱为固定相，以IgG Elution Buffer洗脱液作为洗脱剂，制备蕲蛇提取物的方法，该方法将蛋白原核表达技术和层析柱分离有效成分结合起来，可以更加有效的分离蕲蛇水煎剂中可与糖皮质激素受体结合的目标成分；糖皮质激素主要通过与糖皮质激素受体结合，激活糖皮质激素受体与NF-κ B互作，从而起到抗炎作用。本发明制备的蕲蛇提取物，可以增强糖皮质激素受体与NF-κ B相互作用，具有潜在的抗炎效应，为糖皮质激素的替代品提供了依据。
(四)


[0021]图1:糖皮质激素受体全基因(GRa )PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道I为糖皮质激素受体全基因PCR扩增产物，泳道M为Marker。
[0022]图2:基因改造过的糖皮质激素受体核苷酸序列(构建在克隆载体PMC57中，经测序鉴定)与原核酸序列比对图谱。
[0023]图3:提取糖皮质激素受体全基因载体质粒琼脂糖凝胶电泳图，泳道1-3为提取糖皮质激素受体全基因载体质粒酶切鉴定，泳道I =BamH I/EcoR I酶切，预期条带1502bp、746bp ;泳道 2:Hind ΙΙΙ/Xho I 酶切，预期条带 1071bp、554bp、368bp ;泳道 3 =BamH I/Xho I酶切，切出 GRa CDS 全长约 2360bp ；M1 =Marker0
[0024]图4:鉴定IPTG诱导的糖皮质激素受体原核表达的SDS-PAGE电泳图，泳道M:Marker,泳道1:E4空载表达，泳道2 =IPTG诱导空载，泳道3:E4-GR α，泳道4 =IPTG诱导E4-GRα，蛋白 Marker 分子量从上之下依次为:170KD、130KD、100KD、70KD、55KD、40KD、35KD和 25KD。
[0025]图5:鉴定纯化的糖皮质激素受体蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道I为BSA (2.0yg),泳道2为镍柱纯化的糖皮质激素受体蛋白；泳道Ml为Marker,蛋白Marker分子量从上之下依次为:94KD、66KD、36KD、14KD。
[0026]图6:蛋白免疫印迹鉴定纯化的糖皮质激素受体蛋白电泳图，泳道M为Marker ;泳道I为镍柱纯化的糖皮质激素受体表达蛋白；Marker分子量从上之下依次为:120KD、85KD、60KD、40KD。
[0027]图7:中低压色谱分离蕲蛇水煎剂中与糖皮质激素受体结合的蕲蛇提取物图谱，峰I为尿素峰，峰2和3分别为蕲蛇提取物的洗脱峰。
[0028]图8:2号洗脱峰的质谱鉴定图谱。
[0029]图9:3号洗脱峰的质谱鉴定图谱。
[0030]图10:蕲蛇提取物调节的糖皮质激素受体与NF-κ B的相互作用的蛋白免疫印迹图。从左至右在6孔板的细胞培养液中添加蕲蛇提取物的剂量分别为O μ 1、1 μ 1、2 μ 1、5μ 1、10 μ 1、100 μ 1，A卿IB:NF_ κ B)表示的是与糖皮质激素受体结合的NF_ κ B含量。B(即IB =GRa )显示的是糖皮质激素受体的含量，表明各组是一致的。C (即IB:NF_kB)显示的是NF- κ B表达量。结果表明添加10 μ I蕲蛇提取物可以增强糖皮质激素受体与NF- κ B的相互作用。
(五)
[0031]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0032]如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》((美)M.R.格林//J.萨姆布鲁克科学出版社)、《液相色谱-质谱分析技术标准汇编/分析测试技术系列标准汇编》(中国标准出版社，2013年)等手册以及本发明所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
[0033]实施例1:基于亲和层析的方法富集蕲蛇水煎剂中蕲蛇提取物
[0034]1、糖皮质激素受体(gl μ cocorticoid reccptor, GR)全基因的克隆
[0035]淋巴细胞分离液(LTS1077 TBD公司)分离正常人血液白细胞，Trizol法提取白细胞总RNA。然后将总RNA逆转录成cDNA，逆转录以TaKaRa公司的AMV逆转录酶提供的体系为标准(TaKaRa RNA LA PCRTM KiT(AMV)Ver.1.1Code No:DRR012A)。根据 GeneBank上提供的糖皮质激素受体的序列号ΝΜ_001020825.1，用Primer5.0设计一对含GR αCDS的远端引物扩增得到约2.8kb片段，上下引物序列为:5-TGTGCGAGAATGGGGAGG-3 ；5-GGGCACTGGTGGTTTAGG-3。PCR 反应条件:94 度 3 分钟，(94 度 35 秒，59 度 30 秒，72 度 3分钟)30个循环，72度10分钟，16度保存；PCR扩增得到的糖皮质激素受体α全基因经核酸电泳鉴定，大小正确，电泳结果如图1所示，箭头指示位置为所扩增的目的基因，I号泳道为GRa的PCR产物，标记M的泳道为Marker。将PCR产物连到克隆载体PMC57中，进行测序。测序在上海生工生物工程有限公司完成，将测序结果与NM_001020825.1上的序列进行比对，检测克隆的基因的准确性。以测序正确的pMD18-T-GRa 15号质粒为模板，使用引物扩增获取约2.4kb的GR α开放阅读框(氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示)，引物序列为:5-ATAcgcggatcc GCACTGATGGACTCCAAAGAATC-3 ；[0036]5-ATACCGctcgag CCATTCTTATTAAGGCAGTCAC-3 ；PCR 反应条件:94 度 2 分钟，(94 度15秒，64度15秒，72度2分30秒)30个循环，72度10分钟，16度保存；
[0037]将克隆正确的基因进行核酸改造，使之更适合于原核表达，改造后的核酸序列(SEQ IDNO:1所示)与原核酸序列的差异利用DNAman软件进行比对分析，比对分析结果如图2所示。
[0038]核苷酸序列SEQ ID NO:1:
[0039]