专利名称：菠萝叶提取物及其制备方法和用途的制作方法 菠萝，为凤梨科植物凤梨Ananas comosus(L.)Merr.[Bromelia comosa L.；A.sativusSchult.Et Schult.f.]的果实。原产美洲，现广植于热带地区，我国福建、广东、海南、广西、云南等地均有种植。本品始载于清.吴其睿《植物名实图考》，以露兜子为名。该书记载“露兜子产广东，一名波罗，生山野间，实如萝卜，上生叶一簇，尖长深齿，味色香具佳。果熟金黄色，皮坚如鱼鳞状，去皮食肉，香甜无渣，六月熟”。古时对于菠萝叶无明确记载，现代人们常用菠萝叶纤维作为编织和造纸的原料(《中国高等植物图鉴.第5册》科学出版社1976)。近时有记载菠萝叶具有消食和胃，止泻的功效，主治夏日暑泻，消化不良，胃脘胀痛等(《中华本草.第8卷》上海科学技术出版社1999)。菠萝叶作为药用的记载比较少见，尤其未见报道菠萝叶或菠萝叶提取物在制备治疗脂代谢紊乱，脑血管痉挛，体内过氧化物过多所引起的高脂血症，糖尿病餐后高脂，脑功能紊乱，脑血管供血不足等疾病的药物中的应用。本发明提供的菠萝叶提取物，其特征在于该提取物含有30～80％的总酚性成分，可用下述方法得到(1)先将药材重量的5～15倍水或醇溶剂加热或室温提取，得到提取液；(2)将提取液在30～100℃温度下常压或减压浓缩后，用药材重量1～10倍水溶解，离心或静止过滤，弃去沉淀，取上清液；(3)将上清液通过交换柱，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用浓度大于70％乙醇洗脱，将洗脱液在30～90℃温度下减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，得到菠萝叶提取物。本发明提供了一种菠萝叶提取物的制备方法，该方法包括如下步骤(1)先将药材重量的5～15倍水或醇溶剂在30℃～100℃进行加热或室温提取，得到提取液；(2)将提取液在30～100℃温度下常压或减压浓缩后，用药材重量1～10倍水溶解，离心或静止过滤，弃去沉淀，取上清液； (3)将上清液通过交换柱，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用浓度大于70％乙醇洗脱，将洗脱液在30～90℃温度下减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，得到菠萝叶提取物。上述步骤(1)中所述提取次数为3次，每次为1～3小时。本发明所述的交换柱采用大孔吸附树脂、离子交换树脂或聚酰胺。
本发明的技术方案还在于提供菠萝叶提取物的医药方面的新用途，该用途为菠萝叶提取物在制备治疗高血脂症的药物中的应用。
菠萝叶提取物在制备治疗糖尿病人餐后高脂的药物中的应用。
菠萝叶提取物在制备治疗体内过氧化物升高所引起的疾病的药物中的应用。
菠萝叶提取物在制备治疗治疗脑血管供血不足所引起的疾病的药物中的应用。
在治疗脂代谢紊乱、过氧化物升高、脑血管痉挛及其由此引起的疾病时，以菠萝叶提取物为活性成分，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物。
本发明的实验结果表明，菠萝叶提取物对小鼠脑膜血流量有明显增加的作用。静脉给药后3分钟即有脑血流升高，并表现出一定的量效关系。表明菠萝叶提取物对脑血管有直接地扩张作用，对于血管性痉挛所引起的疾病有较好的缓解作用。菠萝叶提取物具有一定地抑制糖尿病小鼠餐后血甘油三酯升高的作用，一般地使餐后血脂保持在一定的水平，而不明显的持续性升高，口服有效剂量为600mg/kg。同时菠萝叶提取物给大鼠口服可以明显抑制血清胆固醇和甘油三酯明显升高的作用。有效剂量为300mg/kg和150mg/kg。实验还表明，菠萝叶提取物体内、体外给药均能明显抑制脑过氧化物的升高，体外实验最低有效浓度为1.2×10-6g/ml。体内给药最低有效剂量为300mg/kg。上述结果提示菠萝叶提取物具有一定调血脂和抗氧化的作用。
菠萝叶提取物的成分采用紫外分光光度法、比色法等进行测定，总酚含量在30～80％之间。其中主要成分为酚酸和黄酮等。
在药剂应用上就是将菠萝叶提取物单独地或者加入复方中以常规的制剂工艺制备成药剂；其药剂可以是临床上能够使用的各种不同剂型，如散剂，丸剂，胶囊剂，片剂，微囊剂，软胶囊剂，膜剂，栓剂，注射剂，膏剂，酊剂，散剂，冲剂，气雾剂，各种外用制剂等。
下述实施例及药效实验资料使本发明所说的菠萝叶提取物的制备及其用途得以证实，同时又不应将下列实施例看作是对本发明的限制。
实施例1取菠萝叶1公斤用5倍量的水100℃加热提取3次，每次3小时，提取液减压(压力98Kpa)温度在100℃浓缩后，用药材重量的1倍水溶解，静止，取上清，通过聚酰胺柱。先用水洗脱，洗脱液废弃，再用70％乙醇洗脱，洗脱液减压(压力98Kpa)30℃浓缩，冷冻干燥，得到提取物。菠萝叶提取物的总酚性成分采用比色法进行测定，提取物中总酚性成分含量为30％左右。
实施例2取菠萝叶1公斤用15倍量的70％乙醇60℃加热提取3次，每次2小时，提取液减压(压力98Kpa)加热60℃浓缩后，用用药材重量的5倍水溶解，离心，取上清，通过大孔吸附树脂。先用水洗脱，洗脱液废弃，再用95％乙醇洗脱，洗脱液减压(压力98Kpa)90℃浓缩，减压(压力98Kpa)干燥，得到提取物。菠萝叶提取物的总酚性成分采用比色法进行测定，提取物中总酚性成分含量为80％左右。
实施例3取菠萝叶1公斤用5倍量的甲醇30℃加热提取3次，每次1小时，提取液减压(压力90-Kpa)加热30℃浓缩后，用用药材重量的10倍水溶解，离心，取上清，调PH值为弱酸性，通过阴离子交换树脂。先用水洗脱，洗脱液废弃，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压(压力98Kpa)30℃浓缩，减压(压力98Kpa)干燥，得到提取物。菠萝叶提取物的总酚性成分采用比色法进行测定，提取物中总酚性成分含量为60％左右。
实施例4取菠萝叶1公斤用15倍量的95％乙醇室温浸泡2天，提取液减压(压力90-Kpa)加热50℃浓缩后，用药材重量的5倍水溶解，离心，取上清，通过大孔吸附树脂。先用水洗脱，洗脱液废弃，再用80％乙醇洗脱，洗脱液减压100℃浓缩，冷冻干燥，得到菠萝叶提取物，提取物中的总酚性成分采用比色法进行测定，提取物中总酚性成分含量为50％左右。.菠萝叶提取物总酚性成分测定，采用比色法对其总酚性成分进行含量测定。
1、试药与仪器紫外分光光度计(TU-1800PC)；分析天平，咖啡酸对照品(购自中国药品生物制品检定所)，菠萝叶总酚提取物；其余试剂均为分析纯。
2、方法与结果
①测定波长的选择分别配置一定浓度的咖啡酸对照品及菠萝叶总酚提取物供试品，显色前后，分别在200-800nm内记录吸收光谱。结果表明，咖啡酸对照品及菠萝叶总酚提取物供试品显色后在720nm处均有最大吸收。故选择720±nm作为测定波长。
②测定条件中反应时间的考察吸取一定浓度的咖啡酸对照品，加入甲醇3.5ml，0.3％十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀暗处静置5min。用0.1mol/L的稀盐酸稀释至10ml。在720nm处，不同的时间测定其吸收度，结果表明，30min基本反应完全，所以选择反应为30min。
③对照品溶液的配置精密称取咖啡酸对照品10mg，放入10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀。精密吸取1ml，置50ml容量瓶中加入甲醇定容，摇匀即得20ug/ml的标准品。
④标准曲线的绘制精密称取咖啡酸对照品溶液0，1ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，3.5ml，分别置10ml棕色容量瓶中，分别加甲醇3.5ml，2.5ml，2.0ml，1.5ml，1ml，0.5，0ml，再加0.3％十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀暗处静置5min，再用0.1mol/L的稀盐酸稀释至10ml。摇匀暗处静置30min。以零号管作对照，置1cm的比色杯中，在720nm处测定其吸光度，绘制标准曲线。咖啡酸对照品浓度分别为2ug，3ug，4ug，5ug，6ug，7ug/ml，吸光度分别为0.21，0.34，0.47，0.58，0.65，0.79。由于咖啡酸在2-7ug/ml范围内的吸光度为一通过原点的直线，故采用对照比较法计算菠萝叶总酚提取物中总酚含量。结果见

图1。
⑤样品含量的测定精密称取菠萝叶总酚提取物10mg，放入10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀。精密吸取0.05ml，分别加甲醇3ml，再加0.3％十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀暗处静置5min，再用0.1mol/L的稀盐酸稀释至10ml。摇匀暗处静置30min。在720nm处测定其吸光度，吸光度为0.35。按对照品比较法计算含量为62％。
药效实验例1对小鼠脑膜血流量的作用观察本发明菠萝叶提取物对小鼠脑膜血流量的作用。菠萝叶提取物，批号030311-2。用时以生理盐水配制成所需浓度。试验动物为雄性ICR小鼠，非近交系封闭群，体重18-22g，由北京维通利华实验动物中心提供。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼8只，每三日清扫笼舍一次。
取小鼠乌拉坦(1.0g/kg)麻醉后，固定头部，切开皮肤，于大脑皮质运动区(AP-1，L2)安置激光探头(JI-200激光微循环仪，天津南开大学生产)，待稳定5-10分钟后开始测试脑血流，记录给药前后脑膜血流量的变化。
本试验观察指标及指标表达所测结果直接经JI-200软件处理，脑膜血流量以KHz(千赫兹)表示，脑膜血流量增加百分值[＝(给药后血流量-给药前血流量)/给药前血流量]。
本试验给药剂量分别为25mg/kg，12.5mg/kg和6.25mg/kg；给药途径为尾静脉给药；给药体积为0.05ml/10g小鼠。
本试验空白对照为等体积生理盐水，阳性药对照为川芎嗪注射液，40mg/2ml。北京市永康制药厂生产，批号9811191，京卫药准字(1996)第157008号，小鼠用量为25mg/kg。
本试验数据均以Excel软件处理。
表1菠萝叶提取物对正常小鼠脑血流量的作用(x±s)分组 剂脑血流量(KHz)量(mg/01 3 5 10 15(分kg) 钟)对照组 31.3231.84 31.42 31.58 31.58 31.45±2.71 ±3.03 ±2.86 ±3.02 ±2.51 ±2.52川芎嗪 25 31.0132.74 33.833.733.57 33.17±2.37 ±1.99 ±1.94* ±2.12* ±1.9* ±2.02*提取物 100 31.6334.28 36.53 34.737.31 36.42±2.6±3.46 ±5.23* ±3.76* ±3.18* ±3.18*提取物 50 31.6733.835.88 37.18 36.65 36.21±3.18 ±2.89 ±2.72* ±2.43* ±3.7* ±1.9*提取物 25 33.1734.84 37.07 38.03 38.05 36.76±6.61 ±7.35 ±8.24 ±7.85* ±8.39* ±8.43*与同时间对照组相比，P＜0.05。n＝8表2菠萝叶提取物对正常小鼠脑血流量增加百分比值(x±s)分组剂量 脑血流量增加百分比值(％)(mg/ 0 1 3 5 1015(分kg) P钟)对照组0 1.72± 0.49± 0.78± 0.92±0.36±5.54 3.54 2.19 3.19 2.49川芎嗪 250 5.77± 9.17± 8.86± 8.52± 7.17±2.97 3.77* 3.75* 4.38*4.32*提取物 100 0 8.31± 15.28± 18.18± 18.0± 15.2±3.78*9.83**4.94** 3.36** 4.79**提取物 500 6.91± 13.71±17.99± 16.18± 14.96±3.62*7.16* 9.01* 7.86** 8.31*提取物 250 4.96± 11.52±14.69± 14.57± 10.59±3.43 5.06* 4.3** 5.6* 6.28*与同时间对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝8实验结果显示，菠萝叶提取物对小鼠脑膜血流量有明显增加的作用。一般在给药后1分钟即有脑血流升高，并表现出一定的量效关系；表明菠萝叶提取物对脑血管有直接地扩张作用，提示对于血管性痉挛所引起的疾病有较好的缓解作用。
药效实验例2对糖尿病小鼠餐后血脂的影响观察本发明菠萝叶提取生对糖尿病小鼠餐后高甘油三酯的抑制作用。本发明所用菠萝叶提取物，批号030311-2。用时以生理盐水配制成所需浓度。试验动物为雄性ICR种小鼠，非近交系封闭群，体重18-22g，由北京维通利华实验动物中心提供。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼8只，每三日清扫笼舍一次。
取小鼠随机分为4组，每组12只，禁食24h后，尾静注四氧嘧啶(批号971201，北京西中化工厂生产。化学纯)(50mg/kg)，三日后隔夜禁食(约8h后)眼眶采血测血糖和血甘油三酯(TG)。取血糖在9mmoml/L以上者为试验对象。然后灌胃不同药物，给药后0.5小时，开始给小鼠灌橄榄油(化学纯，批号980428，北京芳草医药化工研制公司)0.15ml/10g，并开始计时，分别于灌胃橄榄油后1，2，4和8小时经眼眶采血，离心分离血清，检测血糖和甘油三酯。每次采血后均定量经胃肠道补充生理盐水(0.1ml/10g体重)。所测结果经Excel软件处理。
本试验给药剂量为600mg/kg；给药体积为0.2ml/10g小鼠。灌胃给药。
本试验空白对照为等体积生理盐水，阳性药对照为吉非罗齐，批号010401，浙江越洲制药有限公司生产，小鼠用量为600mg/kg。
表3菠萝叶提取物对高血糖小鼠高脂餐后血糖的影响(x±S)分组药物 剂量 血糖(mmol/L)Mg/k 012 4 8(小g 时)正常组 生理5.21 7.24 6.602 6.081 6.615盐水 ±2.91 ±3.42 ±3.041 ±1.649 ±1.735模型组 生理12.0216.3314.38 13.27 11.55盐水 ±7.82 ±7.94* ±7.47 ±9.73 ±9.61模型组 吉非 600 11.8616.1812.67 9.485.58罗齐 ±6.79 ±9.85* ±10.03 ±9.07 ±2.45模型组 提取 600 12.6318.3818.32 14.44 8.74物±3.51 ±7.52* ±6.33 ±5.68 ±3.01与正组相比，*P＜0.05。n＝12表4菠萝叶提取物对高血糖小鼠高脂餐后血甘油三酯的影响(x±S)分组 药物 剂量 甘油三酯(mmol/L)Mg/kg 0 1 2 48(小时)正常组生理1.038 1.972± 2.298 1.626±1.605±盐水 ±0.226 0.591±0.471 0.675 0.668模型组生理0.912 1.202± 1.881 2.682± 3.992±盐水 ±0.347 0.352* ±0.746 1.423* 2.886*模型组 吉非6000.742 0.948±1.5451.525± 2.654±罗齐 ±0.17 0.417 ±1.263 1.533* 2.314模型组 提取6000.746 0.972±1.5731.775± 1.736±物 ±0.181 0.358 ±0.725 0.499# 1.382#与正常组相比，*P＜0.05。与模型组相比，#P＜0.05。n＝10实验结果显示，在喂饲甘油三酯饮食后1-2小时，正常小鼠血中甘油三酯升高，以后下降，4小时后恢复正常。模型组则喂饲甘油三酯后血中甘油三酯逐渐升高，4小时达高峰，以后维持在这一高水平。菠萝叶提取物给药后可以明显抑制餐后血中甘油三酯升高，从喂饲后1-8小时，血中甘油三酯均处于较低水平。与模型组相比，有明显差异(p＜0.05)。表明菠萝叶提取物有明显的抑制餐后高甘油三酯的作用，而对血糖无明显的影响。
药效实验例3对脂代谢紊乱大鼠血脂的调节作用本发明所用雄性Wistar大鼠，非近交系封闭群，体重180-220g。购自中国医科院实验动物研究所。合格证号京动许字(036)号。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼5只，每三日清扫笼舍一次。
本发明所用菠萝叶提取物，批号030311-2。阳性对照药为非诺贝特胶囊(利旨平，phenofibrate)，100mg/粒。批号0012162。粤卫药准字(1996)第153001号。所用测试仪器为HITACHI-7060全自动生化分析仪。大鼠高脂饲料(配方10％蛋黄粉，5％大油，0.5％胆盐，0.2％胆固醇，84.3％基料)，购自中国医学科学院实验动物研究所。
取大鼠共60只，随机分为6组，每组10只。给高脂料2周，第15天眼眶静脉丛采血，分离血清，测TC，TG。根据TC和TG做组间均匀调整。同时给不同剂量的药物。于给药后第14天眼眶静脉丛采血，分离血清，测血总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。菠萝叶提取物分为大剂量300mg/kg，中剂量组为150mg/kg，小剂量为75mg/kg，非诺贝特为70mg/kg，相当于临床等效量的2倍。模型对照组给等体积蒸馏水。正常对照组给普通饲料，并给等体积蒸馏水。
给药体积为1mL/kg。灌胃给药途径，每天1次。所得数据由Excel软件处理，组间t检验。
本实验结果如表5表5给药后2周大鼠TC.TG变化(x±s)分组 药物剂量(mg/kg) TC(mg/dl)TG(mmol/L)正常组 104.12±19.041.028±0.219模型组 172.97±25.65# 1.967±0.391#模型组 非诺贝特70153.15±11.53* 1.448±0.349*模型组 菠萝叶提取 300 140.69±26.82* 1.458±0.369*
物模型组菠萝叶提取 150 149.63±26.83* 1.58±0.362*物模型组菠萝叶提取 75160.56±33.741.609±0.372*物与模型组相比，*P＜0.05。与正常组相比，*P＜0.05。n＝10给药2周时，各组药物均血TC和TG均表现出明显的活性。菠萝叶提取物大、中剂量组能够明显抑制TC和TG的升高(P＜0.05)。阳性药非诺贝特对TC和TG也有明显的抑制作用。提示菠萝叶提取物具有一定调血脂的作用。
药效实验例4对脑MDA生成的影响观察本发明菠萝叶提取物对小鼠脑MDA生成的抑制作用。本发明所用菠萝叶提取物，批号030311-2。用时以生理盐水配制成所需浓度。实验所用动物为雄性二级ICR小鼠，非近交系封闭群，北京维通利华实验动物中心提供，体重为18-22g。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼10只，每三日清扫笼舍一次。
取正常小鼠，处死后取脑，加入生理盐水做匀浆液(与脑比例为5∶1)。4℃冰箱静置5分钟，取上部均匀混浊液。每管加入脑组织液150uL，加入不同浓度药液50ul，37℃水浴孵育30分。依次加入10％SDS 0.1ml，50％冰醋酸硫代巴比妥酸液0.5ml和1％盐酸液2ml。沸水浴15分钟，取出后冷水置10分钟，1500转离心15分钟，取上清于532nm处测吸光度A值。每组做三复管。计算抑制率＝[(对照组A-给药组A)/对照组A×100％]。
所得数据经EXCEL软件处理。组间t检验。
本试验菠萝叶提取物给药终浓度分别为1.2×10-6g/ml，1.2×10-5g/ml，1.2×10-4g/ml，1.2×10-3g/ml，1.2×10-2g/ml。
本试验为体外实验。本试验空白对照为等体积生理盐水.阳性药对照为维生素E，购自Sigma公司，实验终浓度为1.2×10-2g/ml。
本试验数据均以Excel软件处理。
表6菠萝叶提取物体外对脑MDA生成的抑制作用(x±s)分组 药物终浓度 吸光值(532nm)(g/ml)生理盐水 0.598±0.012维生素E1.2×10-20.273±0.009**菠萝叶提取物 1.2×10-20.32±0.012**菠萝叶提取物 1.2×10-30.391±0.011**菠萝叶提取物 1.2×10-40.422±0.01**
菠萝叶提取物1.2×10-50.481±0.015*菠萝叶提取物1.2×10-60.554±0.019*与生理盐水组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3表7菠萝叶提取物对小鼠脑MDA生成的影响(x±s)药物剂量(mg/kg)吸光值532nm/g蛋白生理盐水 0.604±0.177维生素E 50 0.422±0.134*提取物 6000.396±0.125*提取物 3000.437±0.104*提取物 1500.525±0.125与生理盐水组相比，*P＜0.05。n＝10本实验结果显示，菠萝叶提取物体外有较强地抑制缺糖缺氧脑组织MDA生成的作用，最低有效浓度为1.2×10-5g/ml。口服给药也能明显抑制小鼠脑MDA的生成。提示菠萝叶提取物具有一定的抗氧化的的作用。


菠萝叶提取物及其制备方法和用途，涉及一种以菠萝叶为原料制备的含有多种活性成分的中药提取物及其用途。本发明经过分离提取，得到含有30～80％的总酚成份的菠萝叶提取物。经实验研究表明，菠萝叶提取物对脑血管有直接地扩张作用，对于血管性痉挛所引起的疾病有较好的缓解作用，并有一定调血脂和抗氧化的作用。具体的说，该提取物可在制备治疗高血脂症、糖尿病餐后高脂、脑缺血、体内过氧化物升高及由此引起的一些疾病的药物中应用。