专利名称：一种防治辣椒疫病的短芽孢杆菌及生物制剂的制备方法与应用的制作方法辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一种世界性土传病害， 发病较轻的田块病株率为15 30%，造成产量损失为20 25%，严重的田块损失在50% 以上，甚至绝收。近年来随着保护地辣椒种植面积的增加，辣椒疫病的发生有逐年加重的趋势。目前生产中尚无理想的抗病品种，病害的防治主要依赖于化学药剂，长期单一使用甲霜灵等同类药剂，使辣椒疫霉的药剂抗药性显著提高，且化学农药对生态环境和人类健康造成危害，生防菌及其次生代谢产物对环境友好，有利于农业的可持续发展成为防治植物病害的重要手段。从辣椒疫霉生存的土壤环境中分离和筛选生防菌株是辣椒疫病生物防治技术产品开发的主要途径。短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的一些菌株，如短短芽孢杆菌 (Brevibacillusbrevs)具有广谱抗菌活性，其分泌的抗菌物质包括短杆菌肽S、脂肽类、磷脂类、多烯类和氨基酸类等多种化合物，它们具有抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等作用，是植物病害生防功能的重要组成部分，其抑菌机理包括拮抗、竞争、溶菌、诱导系统抗性等。目前关于短短芽孢杆菌生物防治的研究主要处于分离筛选及离体抑菌活性测定阶段，尚无用于辣椒生产的生防菌制剂。
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种防治辣椒疫病的细菌。本发明的另一目的在于提供包含上述防治辣椒疫病的细菌的发酵液干燥物的生物制剂及其制备方法与应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种防治辣椒疫病的细菌，名称为短芽孢杆菌Brevibacillus sp. 26-13，于2011年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC，湖北武汉大学内)，保藏编号为CCTCC M 2011009 ；所述的短芽孢杆菌26-13的形态及生理生化特性杆状，(0. 7 0. 9) μ mX (3 5) μπι，革兰氏阳性，以周生鞭毛运动，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢，菌落平、光滑、黄灰色、 无可溶性色素，可使淀粉水解，氧化酶和硝酸盐还原为阴性，可利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖和蔗糖。所述的短芽孢杆菌26-13的16S rDNA序列在GeneBank与Brevibacillus sp. DYJL-F比对，同源率100%，系统发育树与Brevibacillus sp. DYJL-F聚为一枝，但其形态有一定的差异；所述的短芽孢杆菌26-13根据其形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，故命名为 Brevibacillus sp. 26-13 ；一种防治辣椒疫病的生物制剂，含有上述短芽孢杆菌沈-13的发酵液干燥物；该发酵液干燥物包括短芽孢杆菌26-13的菌体和代谢物； 所述防治辣椒疫病的生物制剂还含有载体和保护剂；所述的载体为滑石粉、高岭土、粘土、膨润土、硅藻土或陶土中的至少一种；
所述的保护剂为可溶性淀粉、糊精、蔗糖或谷氨酸中的至少一种；
所述的防治辣椒疫病的生物制剂，更优选为包含以下按质量百分比计的成分
短芽孢杆菌沈-13的发酵液干燥物 3. 0 6. 0%
可溶性淀粉0.5 1.0%
糊精1 2%
蔗糖1 2%
谷氨酸钠0.2 0.5%;
所述的短芽孢杆菌26-13的发酵液干燥物的制备方法包括以下步骤 (1)菌种活化在灭菌的NA培养基中接入短芽孢杆菌26-13进行摇瓶培养；摇瓶培养条件如下30 32°C，转速为160 200转/min、培养时间为12 18小时；得到活化的菌种；NA培养基的组成为每升含有牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至 IOOOmL, pH 为 7. 2 7. 4 ；(2)菌体的大量繁殖连续放大发酵，首先将步骤(1)得到的活化的菌种按接种量为发酵培养基体积的8 10%接种入100L发酵罐，发酵16 20h后，将100L发酵罐的短芽孢杆菌沈-13发酵液转至1000L发酵罐中，补充发酵培养基，继续发酵培养M 30h ；整个发酵过程的发酵条件为发酵培养基为LA培养基，装液量为发酵罐体积的70%，泡敌量为0. 05 0. 1 %，初始pH为7. 0 7. 2，发酵温度30 32°C ；LA培养基的组成为每升含有玉米淀粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米浆25g、MnSO4 0. 0308mg、K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、MgSO4 0. 5g、FeSO4 0. lg、CaCO3Ig,水定容至 lOOOmL， pH7. 0 ；(3)短芽孢杆菌沈-13的发酵液干燥物的制备将步骤( 得到的发酵液进行喷雾干燥，得到发酵液干燥物。步骤(3)中所述的喷雾干燥的优选条件为温度为60 70 、ν$= 14 16m3/ min 禾口 V喷嘴=43 ；所述防治辣椒疫病的生物制剂的制备方法，包括以下步骤将短芽孢杆菌 Bacullices sp. 26-13发酵液干燥物与载体和保护剂混和得到；更优选混合后干燥至水分相对湿度小于10%、粉碎，得到防治辣椒疫病的生物制剂。所述防治辣椒疫病的生物制剂的使用方法可以是拌种或淋施，也可以是喷雾；所述防治辣椒疫病的生物制剂的使用时期是辣椒苗期和/或成株期。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明所述的防治辣椒疫病的生物制剂对环境友好，无农药残留问题，成本较低，生产工艺先进等特点；
(2)本发明所制成的防治辣椒疫病的生物制剂稀释400X防治辣椒疫病的防治效果达到85%以上。

得到的观察检测结果为杆状，0.7 0.9 μ mX3 5 μ m，革兰氏阳性，以周生鞭毛运动，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢，菌落平、光滑、黄灰色、无可溶性色素，可使淀粉水解，氧化酶和硝酸盐还原为阴性，可利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖和蔗糖。(2) 16S rDNA 序列分析采用细菌通用16S rRNA 扩增引物序列 27F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)、 1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)扩增16S rRNA基因片段，扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序后，将所测的16SrDNA(如下所示，1391bp)序列与GenBank数据库中所有已测定的原核生物16S rDNA序列进行比较，得出细菌沈-13系统发育地位。1 AGTCGAGCGA GGGTCTTCGG ACCCTAGCGG CGGACGGGTG AGTAACACGT AGGCAACCTG61 CCTCTCAGAC TGGGATAACA TAGGGAAACT TATGCTAATA CCGGATAGGT TTTTGGATCG121 CATGATCCGA AAAGAAAAGA TGGCTTCGGC TATCACTGGG AGATGGGCCT GCGGCGCATT181 AGCTAGTTGG TGGGGTAACG GCCTACCAAG GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG
241ACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT
301TTTCCACAATGGACGAMGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGA
361TTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGMTAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACG
421GTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG
481CMGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTG
541TTAAAGCCCGGAGCTCMCTCCGGTTCGCATCGGMACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGA
601GGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG
661CGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG
721GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTCM
781TACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAG
841TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGA
901AGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGACCGCTCTGGAGACAGAGCT
961TCCCTTCGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG
1021TTGGGTTAAGTCCCGCMCGAGCGCMCCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGC
1081ACTCTAGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCAT
1141GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTC
1201GCGAGAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCC
1261TACATGMGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG
1321GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGT
1381AACCGCAAGGA
所述细菌 26-13 的 16S rDNA 序列在 GeneBank 与 Brevibacillus sp. DYJL-F 比
对，同源率100%，系统发育树与Brevibacillus sp. DYJL-F聚为一枝，但其形态有一定的
差异；所述短芽孢杆菌沈-13根据其形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，故命名为短芽孢杆菌 Brevibacillus sp. 26-13。实施例2短芽孢杆菌沈-13生物制剂制备(1)菌种的活化配制NA培养基(每升的组成为牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨 5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH为7. 2 7. 4)后，每个规格为500mL的三角瓶中装NA 培养基lOOmL，121灭菌15min。在灭菌的NA培养基中接入短芽孢杆菌沈_13进行摇瓶培养；摇瓶培养条件如下30 32°C，转速为160 200转/min、培养时间为15小时；得到活化的菌种；(2)菌体的大量繁殖，为连续放大发酵过程。首先应用100L的发酵罐进行发酵，发酵液为LA培养基(每升的组成为玉米淀粉 3g、大豆蛋白粉 15g、玉米浆 25g、MnSO4 0. 0308mg、K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、MgSO4 0. 5g、 FeSO4 0. IgXaCO3 lg，水定容至1000mL，pH7. 0)，装液量为70L，将步骤(1)得到的活化的菌液9L接种至100L发酵罐，泡敌量(体积百分比)为0. 08 %，初始pH为7. 2，发酵温度30 32°C、发酵培养18小时；然后将100L发酵罐的短芽孢杆菌26-13发酵液转至1000L发酵罐中，发酵温度30 32 °C、发酵培养^h ；
(3)防治辣椒疫病的生物制剂的制备利用喷雾干燥仪将步骤(2)得到的发酵液进行喷雾干燥(温度为60 70°C、Vs ^= 14 16m7min和Veffi=中速)，得到发酵液干燥物，将发酵液干燥物、载体和保护剂进行混和，具体组成为发酵液干燥物5% wt、可溶性淀粉0. 8% wt、糊精1. 5% wt、蔗糖1. 5% wt、谷氨酸钠0. 4% wt、滑石粉20% wt和粘土 70. 8% Wt0然后干燥至水分相对湿度小于 10 %、粉碎，得到防治辣椒疫病的生物制剂。实施例3短芽孢杆菌沈-13生物制剂防治辣椒疫病试验(1)生物制剂实施例3获得的生物制剂，菌体含量约为5X IO11CFU/克。(2)辣椒疫霉病菌游动孢子悬浮液将辣椒疫霉病菌接种至V8培养液(V8蔬菜汁 IOOmLjCaCO3 0. 2g，水定容至IOOOmL)中，沈 培养5 7天，过滤菌丝得到孢子悬浮液，用血球计数板计数并稀释至浓度800cfu/mL。(3)温室试验在温室08 30°C )培养辣椒苗，直至辣椒苗长至3片叶。试验前 1天对供试辣椒苗进行充分灌水，保持基质湿润。用实施例2获得的短芽孢杆菌沈-13生物制剂400X、800X、1200X喷雾和淋根处理，以50%烯酰吗啉可湿性粉剂2000倍液为对照药剂，清水喷雾为空白对照(CK)，晾干，用辣椒疫病菌游动孢子悬浮液(浓度为SOOcfu/ mL)进行接种，接种时用针在幼苗茎接近基质表面处刺小孔，将IOmL的游动孢子悬浮液注入，接种后保湿12h，每处理为30棵苗，每处理重复三次，28-30°C培养7天后调查叶发病情况，记录病株数、死株数或明显枯萎的植株数，计算发病率和防治效果(表1)。表1短芽孢杆菌沈-13生物制剂防治辣椒疫病试验结果


本发明公开了一种防治辣椒疫病的短芽孢杆菌及生物制剂的制备方法与应用。该防治辣椒疫病的短芽孢杆菌为短芽孢杆菌26-13，于2011年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2011009。将该短芽孢杆菌26-13进行发酵，得到的发酵液干燥，再将发酵液干燥物与载体、保护剂混合，得到防治辣椒疫病的生物制剂。该生物制剂具有对环境友好，无农药残留问题，成本较低，生产工艺先进等优点，而且将其稀释400×防治辣椒疫病的防治效果达到85％以上。