专利名称：棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用的制作方法自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就。但随着“传统抗生素”的持续使用，不断产生出诸多新问题。目前，微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难题，三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌、肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。研究发现，多肽抗生素具有广谱的抗菌活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性如在最小作用浓度时，快速而广谱地杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)；对真菌也有抑制作用；不会诱导抗药菌株的产生；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗菌剂，其研制目前受到广泛重视。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的抗菌肽，而且有些已进入临床治疗。如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验；Applied Microbiology公司与Astra公司合作用抗菌肽nisin治疗胃溃疡的临床试验也取得良好的疗效。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。棕点湍蛙(Amolops loloensis)主要分布于四川、云南省，是我国特色资源动物之一。发明人将本发明的棕点湍蛙抗菌肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的棕点湍蛙抗菌肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌，真菌)的棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用。为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案棕点湍蛙抗菌肽棕点湍蛙抗菌肽是中国两栖类棕点湍蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量2666.4道尔顿，等电点9.70，多肽全序列一级结构为Phe Leu Pro Met LeuAla Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。棕点湍蛙抗菌肽基因的克隆包括棕点湍蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选棕点湍蛙抗菌肽基因。扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的5’PCR Primer引物，其序列为5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码棕点湍蛙抗菌肽的基因由442个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aaccacccga gcccaaagat gttcaccttg120aagaaatcca tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgtgagcaa180gagagaaatg cagatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccaatgtt ggccggtctg gctgctaatt tcttgccaaa attattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgga attggaaatc atctgatgtg gaatatcatt360tagctaaatg cacatcagat gtcttataaa aaaataaaga tatctcaaac atcaaaaaaa420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa442编码棕点湍蛙成熟抗菌肽为第247-318位核苷酸，其氨基酸序列为Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe1 5 10 15Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
20棕点湍蛙抗菌肽基因作为基因工程制备棕点湍蛙抗菌肽的应用。
棕点湍蛙抗菌肽的制备方法根据编码棕点湍蛙抗菌肽的基因推断棕点湍蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自动多联合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。
本发明的有益效果在于由棕点湍蛙抗菌肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用。该棕点湍蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为棕点湍蛙皮肤总RNA。
II，棕点湍蛙皮肤mRNA的纯化棕点湍蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的PolyATtract?mRNA Isolation Systems试剂盒。
A.取棕点湍蛙皮肤总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。
B.磁珠((SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。
C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的棕点湍蛙皮肤mRNA。
D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III，棕点湍蛙皮肤cDNA文库构建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl棕点湍蛙皮肤mRNA、1μl SMARTIV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃保温2分钟。
3.将离心管在冰上孵育2分钟。
4.在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。
5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温1小时。
6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。
7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链1.95℃预热PCR仪。
2.将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3.在PCR仪中按以下程序扩增①95℃ 20秒钟②22个循环95℃ 5秒钟68℃ 6分钟4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
C.PCR产物用PROMEGA公司的Wizard?SV Gel and PCR Clean-UpSystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
3.重复步骤2。
4.16,000g离心5分钟。
5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当D600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
E.酶切、连接以及连接产物的转化1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl棕点湍蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。
2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
3.16℃反应2小时。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。
8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×106个单独克隆。
IV，棕点湍蛙抗菌肽基因克隆筛选
扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的5’PCR Primer引物，其序列为5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’。
PCR反应在如下条件下进行94℃30秒钟，52℃45秒钟和72℃2分30秒钟，35个循环。
首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
V，棕点湍蛙抗菌肽基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBESTTMSequencingPrimer RV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47。BcaBESTTMSequencingPrimer RV-M序列5’GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M 13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列为taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aaccacccga gcccaaagat gttcaccttg120aagaaatcca tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgtgagcaa180gagagaaatg cagatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccaatgtt ggccggtctg gctgctaatt tcttgccaaa attattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgga attggaaatc atctgatgtg gaatatcatt360tagctaaatg cacatcagat gtcttataaa aaaataaaga tatctcaaac atcaaaaaaa420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa442棕点湍蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表为序列长度为442个碱基，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源棕点湍蛙皮肤。
编码棕点湍蛙成熟抗菌肽为第247-318位核苷酸，其氨基酸序列为Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe1 5 10 15Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
20棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。
实施例二
制备棕点湍蛙抗菌肽I、棕点湍蛙抗菌肽的制备方法根据编码棕点湍蛙抗菌肽的基因推断棕点湍蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
II、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
III、纯化的棕点湍蛙抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
棕点湍蛙抗菌肽是中国两栖类动物棕点湍蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量2666.4道尔顿，等电点9.70，多肽氨基酸全序列一级结构为苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸--亮氨酸-脯氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-酰胺化半胱氨酸(Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu PheCys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION)。
实施例三棕点湍蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.1-0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。
表1，棕点湍蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用


由表1可见，合成的棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌生长的作用。
棕点湍蛙抗菌肽抑制真菌生长的作用抗真菌活性检测采用杯碟法，培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯5个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于云南大学微生物研究所，此实验做三个平行，取几何平均值，结果如表2。
表2.棕点湍蛙抗菌肽抑制真菌生长的作用

由表2可见，合成的棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制真菌生长作用。
棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用-序列生成表SEQUENCE LISTING<110>南京农业大学<120>棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>442<212>DNA<213>棕点湍蛙(Amolops loloensis)<400>1taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aaccacccga gcccaaagat gttcaccttg 120aagaaatcca tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgtgagcaa 180gagagaaatg cagatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa 240aaacgatttt taccaatgtt ggccggtctg gctgctaatt tcttgccaaa attattttgt 300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgga attggaaatc atctgatgtg gaatatcatt 360tagctaaatg cacatcagat gtcttataaa aaaataaaga tatctcaaac atcaaaaaaa 420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 442<210>2<211>24<212>PRT<213>棕点湍蛙(Amolops loloensis)<220>
<221>AMIDATION<222>(24)<400>2Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ash Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION20


本发明涉及一种棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。该抗菌肽是从中国两栖类动物棕点湍蛙基因编码的一种单链多肽，分子量2666.4道尔顿，等电点9.70，多肽全序列一级结构为Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys－AMIDATION。编码棕点湍蛙抗菌肽的基因由442个核苷酸组成，其中编码成熟棕点湍蛙抗菌肽为第247－318位核苷酸。人工合成的棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。