专利名称：棕点湍蛙抗病毒多肽及其在制药中的应用的制作方法 获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是一种由人免疫缺陷病毒引起，使全身免疫系统严重损害的传染性疾病，感染者终生携带病毒，且缺乏治愈该病的有效方法。艾滋病被视为“超级癌症”和“世纪瘟疫”，已成为威胁全人类的重大传染病。据联合国艾滋病规划署统计，从1981年美国发现首例艾滋病至今，全世界约有5600万艾滋病患者和HIV感染者，并已造成1390万人死亡，每天新增感染者16000例。自1987年3月第一种抗艾滋病病毒药物齐多夫定(AZT)问世以来，已通过美国食品与药物管理局(FDA)批准用于艾滋病临床治疗的药物达4大类27种，包括核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)和融合抑制剂(Fusion Inhibitors)。HIV/AIDS患者的抗病毒治疗方案也从最初的AZT单药治疗，过渡到AZT、ddI、D4T、3TC的二联组合治疗，到现在的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)，白1996年HAART用于临床以来，艾滋病的发病率和死亡率明显下降，患者的免疫功能得到重建，生存质量得到了显著改善。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。从南美叶泡蛙(Phyllomedusa sauvagi)皮肤得到的抗菌多肽dermaseptin对疱疹病毒也显示强烈的抑制作用；从中国大蹼铃蟾皮肤得到的抗菌多肽maximin 3显示抗艾滋病病毒活性。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。
本发明的目的在于提供一种新的棕点湍蛙抗病毒多肽。本发明的目的还在于提供一种棕点湍蛙抗病毒多肽在制药中的应用，特别是该多肽在制备治疗艾滋病药物中的应用。本发明的目的是这样实现的。由于两栖类动物除了具有生物碱等一系列有机药用小分子外，其皮肤还含有大量的活性肽类物质，这是新药发现的一个重要来源。本发明从分布于中国四川、云南省的两栖类动物棕点湍蛙(Amolops loloensis)皮肤分泌液中分离得到一种单链多肽，并将其命名为棕点湍蛙抗病毒多肽，其分子量为1335.7道尔顿，等电点8.75，多肽全序列为亮氨酸—亮氨酸—脯氨酸—异亮氨酸—缬氨酸—甘氨酸—赖氨酸—亮氨酸—亮氨酸—丝氨酸—甘氨酸—亮氨酸—亮氨酸—酰胺化；或表示为Leu Leu Pro Ile Val Gly Lys Leu Leu Ser Gly Leu Leu-NH2。1 5 10发明人将本发明的棕点湍蛙抗病毒多肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较，未发现有任何相同的多肽。上述棕点湍蛙抗病毒多肽的制备方法是用乙醚刺激棕点湍蛙，将收集的皮肤分泌液离心去除沉淀，冷冻干燥后经一系列的生物化学手段分离纯化得到该多肽，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构，根据所得到的氨基酸序列合成该多肽。采用飞行时间质谱法测定分子量，等电聚焦测定等电点，自动氨基酸测序仪确认氨基酸序列结构。
本发明的棕点湍蛙抗病毒多肽是从天然生物资源得到的产物，实验证明具有很好的抗艾滋病毒的作用，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备治疗艾滋病的药物。
本发明取得的技术效果是利用我国两栖类动物资源，为制备治疗艾滋病药物提供了新的选择。

下面实施例用来进一步说明本发明。但本发明的内容并不局限于此。
实施例一、棕点湍蛙抗病毒多肽的制备将采白中国四川的两栖类动物棕点湍蛙活体用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从棕点湍蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后保存，并经以下制备过程(1)Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，按上述方法获得的原材料棕点湍蛙皮肤分泌液冻干粉300mg溶解于5ml纯净水，10000rpm 4℃离心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝胶过滤柱(长1000mm，直径26mm)用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0缓冲液平衡，充分后将样品上于该柱。用同样缓冲液洗脱，收集活性峰。
(2)反相高压液相色谱为Sephadex G-50凝胶过滤得到的活性成分的峰上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(长300mm，直径5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从0％至100％的梯度洗脱。收集具有抗病毒作用的活性峰。
(3)纯化的棕点湍蛙抗病毒多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用飞行时间质谱法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的棕点湍蛙抗病毒多肽的分子量为1335.7道尔顿，等电点8.75，多肽全序列为亮氨酸—亮氨酸—脯氨酸—异亮氨酸—缬氨酸—甘氨酸—赖氨酸—亮氨酸—亮氨酸—丝氨酸—甘氨酸—亮氨酸—亮氨酸—酰胺化；或表示为Leu Leu Pro Ile Val Gly Lys Leu Leu Ser Gly Leu Leu-NH21 5 10
二、棕点湍蛙抗病毒多肽抑制HIV-1繁殖作用的实验在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100μl，同时设置正常细胞对照，HIV感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200 TCID50的HIV-1IIIB，即感染复数为0.007，每孔的总体积为200μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。
表1 棕点湍蛙抗病毒多肽抑制HIV-1繁殖的作用

上述实验表明本发明的棕点湍蛙抗病毒多肽具有显著的抑制HIV-1繁殖作用，可用于制备治疗艾滋病的药物。


本发明涉及棕点湍蛙抗病毒多肽及其应用。本发明的棕点湍蛙抗病毒多肽是一种单链多肽，分子量1335.7道尔顿，等电点8.75，多肽全序列为亮氨酸—亮氨酸—脯氨酸—异亮氨酸—缬氨酸—甘氨酸—赖氨酸—亮氨酸—亮氨酸—丝氨酸—甘氨酸—亮氨酸—亮氨酸—酰胺化。通过常规的生物化学手段，从棕点湍蛙皮肤分泌液中分离纯化得到该多肽并测定其序列，按照所得的序列可以合成该多肽。本发明的棕点湍蛙抗病毒多肽用于制备抗病毒药物，具有很好的抗艾滋病毒的作用，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点。