一种木枣多糖及其制备方法[0002]多糖，又称多聚糖，是由多个单糖分子缩合、失水的一类天然大分子化合物，由醛基或酮基通过糖苷键连接在一起的糖类物质。多糖具有很强的抗氧化作用，可通过抑制或清除自由基来避免机体的氧化损伤；多糖还是一种免疫调节剂，可以通过多途径、多层次对免疫系统发挥调节作用，具有吞噬细胞、提高机体免疫功能的作用；除此之外，多糖还具有降血糖、降血脂、抗病毒、控制细胞分裂和分化、调节细胞的生长与衰老等功能，且多糖毒性极小、安全性高。近十多年来，人们对多糖及其复合物进行分离提纯，并确定了其化学结构、物理化学性质、药理作用，尤其对多糖类化合物的抗肿瘤和免疫增强作用进行深入研究，如多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系。多糖已逐渐显示出越来越广泛的应用前景。[0003]近年来，随着枣种植面积的扩大，极大推动了枣加工业的发展。全国已开发出许多种产品，涉及食品、药品和化妆品等多个领域。目前，虽然枣品种繁多，但均为初级加工品，如蜜枣、枣酱、枣泥等，通常是对果品进行整体(或部分组织)加工，改善颜色、风味和形状，加工层次较低，附加值不高。随着加工水平的不断提高，逐步开发了一些新型的枣产品，如糖果类、冷饮类、饮料类、果酒类、果脯类等，但是这些枣产品的加工工艺多数是仿照其它水果的加工工艺得来的，而每种产品的加工工艺都是依照此类水果的成分特点和加工特性开发得到的，因此没有突出枣自身的特点。所以，枣精细加工技术的研究一直严重滞后，目前急需开发出具有枣自身特色，便于生产的功能性食品，以适应人们对枣产品的更高要求和充分利用枣果这一保健食品资源，同时带动区域经济的发展。[0004]木枣为鼠李科枣属植物的果实，又名吕梁木枣。广泛分布于山西吕梁地区，其特点为果肉厚核小，糖分高，储藏性能好，易运输。它是一种具有极高的营养价值和药用价值的保健食品，除了含有常见的营养素外，还含有一些含量较少但具有很高生理活性的特殊成分，如多糖、环磷酸腺苷、黄酮、皂甙、三萜类物质等，这些功能成分是木枣具有多种保健功能的物质基础。目前国内外对木枣活性多糖的作用研究尚未见报道。
[0005]本发明的目的是提供一种从木枣中提取分离纯化多糖的方法，该方法提取率高，操作简单，耗能较少，纯度高。[0006]本发明的技术方案如下:[0007]一种木枣多糖的制备方法，包括如下步骤:
[0008](I)将木枣预处理后，浸提处理，过滤得浸提液；
[0009](2)将步骤(1)的浸提液加乙醇沉淀，抽滤得絮状沉淀物；
[0010](3)将步骤(2)的絮状沉淀物洗涤、干燥获得木枣粗多糖(JP)；[0011]优选地，步骤(1)的预处理包括挑选合格、成熟度一致、没有腐烂、变质的木枣，经清洗、去核、粉碎处理；
[0012]优选地，步骤(1)的浸提处理为超声波辅助热水浸提处理或者酶法辅助热水浸提处理，优选地，热水浸提的料液比为1: 5-1: 25，浸提温度65-90°C，浸提时间2-4h，优选地，超声波功率为50-70W，超声时间10-30min ;优选地，酶是果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种；
[0013]优选地，步骤(2)为将步骤(1)的滤液用旋转蒸发仪在60_65°C下进行真空浓缩，浓缩至原体积的I / 2-1 / 3，浓缩后向提取液中慢慢加入3-5倍体积的无水乙醇，静置24h-36h。真空度为0.09-0.1MPa之间，抽滤得絮状沉淀物；
[0014]优选地，步骤(3)为将步骤(2)的絮状沉淀物添加1-3倍体积的丙酮洗涤，在鼓风干燥箱干燥得粗多糖，鼓风干燥温度50-70°C，鼓风干燥时间10-15h ；
[0015]进一步地，木枣多糖的制备方法还包括步骤(4)脱色处理，步骤(5)脱蛋白处理，步骤(6)脱盐处理，步骤(7)DE-52柱层析分离，步骤(8)干燥制得分离纯化后的多糖粉末；
[0016]优选地，步骤(4)脱色处理为将称取2_5g步骤(3)得到的木枣粗多糖配成一定浓度的溶液，分别采用大孔树脂、活性炭、双氧水一种或多种对其进行脱色；
[0017]更优选地，大孔树脂脱色具体操作为:采用静态吸附法，称取IOg处理好的吸附树脂于200mL的三角瓶中，加入70mL粗多糖溶液，恒温振荡(120r/min)3h。振荡结束后，用滤纸过滤的方法将树脂和溶液分离，测定溶液中脱色率和多糖保存率；
[0018]活性炭脱色的具体操作为:称取IOg活性炭于200mL的三角瓶中，同样，加入70mL粗多糖溶液，恒温振荡(120r / min)3h，过滤，测定溶液中的脱色率和多糖保存率；
[0019]双氧水脱色的具体操作为:70mL粗多糖溶液中，加入30%的过氧化氢5mL，搅拌混合均匀，40°C保温Ih，计算溶液中的脱色率和多糖保存率。
[0020]优选地，步骤(5)脱蛋白处理为将步骤⑷得到的经脱色后的木枣多糖溶液采用三氯乙酸法脱蛋白或者木瓜蛋白酶和三氯乙酸联用进行脱蛋白；
[0021]更优选地，三氯乙酸法脱蛋白的具体操作为:取5个小烧杯，加入经脱色后的粗多糖液各20mL，再分别加入2mL不同质量分数的三氯乙酸溶液，磁力搅拌30min,静置2h,4000r / min离心15min弃去沉淀,测定上清液中的蛋白质去除率和
多糖保存率；
[0022]木瓜蛋白酶与三氯乙酸联用脱蛋白的具体操作为:取20mL经脱色后的多糖液，置于37°C水浴锅中预热lOmin，加入一定量的的木瓜蛋白酶在一定温度下酶解一定时间，反应结束后将其放入沸水浴中灭酶lOmin，冷却至室温，再加入2mL不同质量分数(2%，4%，6%,8%, 10% )的三氯乙酸,磁力搅拌30min,静置2h, 4000r / min离心10min弃去沉淀，测定上清液中的蛋白质去除率和多糖保存率，木瓜蛋白的加酶量优选为0.1-0.4%，酶解温度30-50°C，酶解时间1-3.5h ；
`[0023]优选地，步骤(6)脱盐处理为将步骤(5)得到的经脱蛋白后的木枣多糖溶液采用透析袋进行脱盐，具体操作为:选用扁平宽度44mm，透过分子量为8000~14000的透析袋。由于新透析袋表面有甘油、重金属、微量硫化物和一些具有紫外吸收的杂质，对蛋白质和一些生物活性物质有害，用前必须除去；预处理:将透析袋剪成15cm的小段，用60%的乙醇煮沸30min,蒸懼水洗漆;用0.01mol / L碳酸氢钠煮沸15min,蒸懼水洗漆;用0.0Olmol / LEDTA溶液煮沸15min，蒸馏水洗涤；冷却后，将其存于4°C蒸馏水中，脱盐处理为将脱色、脱蛋白后的多糖液装入上述透析袋，留三分之一的空间，于去离子水中透析，5-8更换一次去离子水，连续透析36-52h。
[0024]优选地，步骤(7)DE_52柱层析分离步骤为对(6)得到的脱盐后的木枣多糖液过DE-52柱，得到洗脱峰命名为JP1、JP2、JP3，具体操作为:
[0025]A、预处理:
[0026]Al、称取40gDE_52溶于四倍体积的蒸馏水中充分溶胀4h，用真空泵抽滤；
[0027]A2、将 DE-52 溶于 2 倍体积的 0.1mol / L 的 NaOH 和 0.1mol / L 的 NaCl 溶液中，浸泡20min左右，用真空泵抽滤；
[0028]A3、用 0.1mol / L 的 NaCl 进行洗涤；
[0029]A4、同样，用0.1mol / L的HCl溶液和0.1mol / L的NaCl溶液洗涤纤维素；
[0030]A5、用蒸馏水洗涤纤维素，直至pH值到7.0左右，备用装柱。
[0031]B、装柱
[0032]B1、将处理好 的纤维素保存液放入抽气I~2h左右，直到混在纤维素中的空气完全排出；
[0033]B2、将层析柱垂直固定在三角铁架上，加入蒸馏水至I / 4柱高，关闭出液口 ；
[0034]B3、将抽气完成的纤维素轻轻搅动均匀，慢慢倒入层析柱中，至柱高的2 / 3左右，静置待纤维素沉降；
[0035]B4、连接恒流泵，将蒸馏水泵入层析柱内，打开下端的出口，平衡液流速在
0.5-2.0mL / min，当流出液与平衡液的pH—致时，层析柱达到平衡。
[0036]C、纯化洗脱
[0037]Cl、将经脱色、脱蛋白、除小分子后的多糖样品溶解，配置成30~40mg / mL的溶液，取5mL缓缓加到纤维素的上界面，盖好层析柱的上盖；
[0038]C2、用蒸馏水，0.1mol / LNaCl,0.3mol / L NaCl,0.5mol / L NaCl，0.7mol / LNaCl溶液进行梯度洗脱，0.8mL / min,自动馏分收集器收集洗脱液，每管5mL ；
[0039]C3、用苯酚-硫酸法于490nm跟踪测定多糖峰位的吸光值，绘制多糖的洗脱分布图，分别收集不同的洗脱峰JP1、JP2、JP3，合并、浓缩、透析、醇沉、冷冻干燥，得到多糖粉末。
[0040]进一步地，JPU JP3再通过葡聚糖凝胶柱进行洗脱，得到JPl为单一组分，JP3为两个小组分，即为JP3a、JP3b ;具体操作为:
[0041]A、预处理
[0042]称取10.0g SephadexG-100于500mL烧杯中，加150mL蒸懼水溶胀，时间为12h,之后100°C煮沸5h，降到室温，备用装柱。
[0043]B、装柱
[0044]B1、将煮沸过的S印hadexG-ΙΟΟ放入抽气Ih左右，直到混进的空气完全排出；
[0045]B2、向柱内加入I / 3高度的洗脱液后，缓慢将凝胶液倒入柱中，待底面上沉积起l-2cm的凝胶柱床，打开柱底部的出口，使凝胶颗粒缓慢沉降，过程中避免气泡产生；
[0046]B3、装约3 / 4的高度时，停止装柱，注意勿使凝胶面洗脱液流干。
[0047]B4、连接恒流泵,用水平衡48h后备用。
[0048]C纯化洗脱[0049]Cl、先打开出口，使洗脱液流至凝胶面上保留5mm左右，取各组分样品配成30mg /mL的溶液，取5mL加到凝胶表面上；
[0050]C2、用蒸馏水，进行洗脱，控制流速为0.1-1.0mL / min,自动分部收集器收集洗出液，每管5mL;
[0051]C3、用苯酚-硫酸法于490nm跟踪测定多糖峰位的吸光值，制定多糖的洗脱分布图，分别收集不同的洗脱峰。同样，合并，浓缩等得到不同组分的多糖粉末。
[0052]优选地，葡聚糖凝胶柱可以是SephadexG-25, SephadexG-50, SephadexG-100,SephadexG-200 柱，
[0053]优选地，步骤(8)是将将步骤(J)得到的多糖组分，醇沉丙酮洗涤，鼓风干燥烘干，得到经分离纯化后的多糖粉末；更优选地，将步骤(7)的多糖组分添加2-4倍体积的丙酮洗涤，在鼓风干燥箱干燥得到经分离纯化后的多糖粉末，鼓风干燥温度50-70°C，鼓风干燥时间 10-15h ；
[0054]进一步，本发明还涉及通过上述制备方法获得的一种木枣多糖；
[0055]进一步，本发明还涉及上述制备方法获得的木枣多糖在保健食品、医药品中的应用；
[0056]进一步地，本申请还涉及通过上述制备方法获得的木枣多糖在抗氧化保健食品、医药品中的应用。
[0057]优选地，木枣选取山西吕梁木枣。
[0058]优选地，本发明所涉及到的主要仪器有超声波清洗机JP-010，高速组织捣碎机DFY-200D，旋转蒸发仪RE-5 2AA，自动部份收集器BSZ-100，数显恒流泵HL-2B，中压玻璃层析柱1.2 X 60cm等。
[0059]通过以粗多糖(JP)、纯化多糖组分(JP1、JP3、JP3a、JP3b)为样品，以Vc和BHT为对照品，进行抗氧化研究得出:木枣多糖具有抗氧化能力，其抗氧化能力与浓度呈现正相关；初步纯化得到的多糖组分(JP1、JP3)清除自由基活性比粗多糖(JP)活性大；然而JP3进一步纯化后的组分JP3a、JP3b清除自由基的活性大多比JP3小。
[0060]本发明的有益效果在于:
[0061]通过本发明木枣多糖的制备方法，通过使用超声波辅助热水浸提处理或者酶法辅助热水浸提处理最大程度低提取木枣中的多糖成分，并通过后续的脱色、脱蛋白、脱盐、柱层析工艺进行多糖的分离纯化，不仅提高了木枣多糖的得率，还保证了木枣多糖的纯度、色泽等优良品质，解决了目前木枣多糖提取过程种面临的品质较低、成本较高的技术难题，同时，并通过抗氧化性研究了木枣多糖的抗氧化特性，采用本发明提取木枣多糖取得了良好地企业效益和经济效益。



[0062]图1为初步纯化的木枣多糖通过DE-52柱的洗脱曲线；
[0063]图2为JPl经DE-52柱洗脱得到的多糖组分通过S^hadexG-1OO柱的洗脱曲线；
[0064]图3为JP3经DE-52柱 洗脱得到的多糖组分通过S^hadexG-1OO柱的洗脱曲线

[0066]实施例1:称取红枣40g，控制料液比为1: 8，在75°C的热水中浸提4h，置于超声波容器中，温度为45°C浸提17min，得到的粗多糖(JP)得率为2.91 将得到的粗多糖配成4%的溶液，采用IOg活性炭对70mL粗多糖液恒温震荡(120r / min) 3h，过滤，得到的溶液的脱色率和多糖保存率分别为50.91%,64.71% ;取20mL经脱色后的多糖液，置于37°C水浴锅中预热lOmin，加入0.3%的木瓜蛋白酶在50°C酶解lh，将其放入沸水浴中灭酶lOmin，冷却至室温，再加入的三氯乙酸,磁力搅拌30min,静置2h,4000r / min离心10min弃去沉淀，得到的溶液蛋白去除率和多糖保存率分别为60.56%,65.26% ;将脱色、脱蛋白后的多糖液装入透析袋，于去离子水中透析，6h更换一次去离子水，连续透析48h;将得到的木枣多糖液过DE-52柱，其用量为40g，用蒸馏水进行洗脱，得到了洗脱峰为JPl ;将JPl再通过S^hadexG-1OO柱采用蒸馏水进行洗脱，其用量为10g，得到JPl为单一组分，将JP、JPl等组分进行抗氧化性的研究。
[0067]实施例2:称取红枣40g，控制料液比为1: 15，在75°C的热水中浸提4h，使其降温到40°C，加入0.3%的果胶酶，控制pH为4.5，浸提2h，得到的粗多糖(JP)得率为3.63% ;将得到的粗多糖配成4%的溶液，在70mL粗多糖液中加入30% H2025mL，搅拌均匀，40°C保温lh，得到的溶液的脱色率和多糖保存率分别为73.63%,33.82% ;取20mL经脱色后的多糖液，置于37°C水浴锅中预热IOminJPA 0.1 %的木瓜蛋白酶在50°C酶解1.5h，将其放入沸水浴中灭酶IOmin,冷却至室温,再加入2mL12%的三氯乙酸,磁力搅拌30min,静置2h,4000r / min离心10min弃去沉淀，得到的溶液蛋白去除率和多糖保存率分别为55.02%、63.55% ;将脱色、脱蛋白后的多糖液装入透析袋，于去离子水中透析，6h更换一次去离子水，连续透析48h ;将得到的木枣多糖液过DE-52柱，用0.3mol / LNaCl进行洗脱，得到了洗脱峰JP3 ;将JP3再通过S^hadexG-1OO柱进行洗脱，得到JP3为两个小组分，即为JP3a、JP3b ;将JP、J P3、JP3a、JP3b进行抗氧化性的研究。
[0068]实施例3:称取红枣40g，控制料液比为1: 12，在75°C的热水中浸提4h，置于超声波容器中，温度为50°C浸提17min，得到的粗多糖(JP)得率为1.73% ;将得到的粗多糖配成4%的溶液，采用IOg大孔树脂AB-8对70mL粗多糖液恒温震荡(120r / min) 3h，过滤，得到的溶液的脱色率和多糖保存率分别为38.37%,76.54% ;将脱色、脱蛋白后的多糖液装入透析袋，于去离子水中透析，6h更换一次去离子水，连续透析48h;将得到的木枣多糖液过DE-52柱，用0.1mol / LNaCl进行洗脱，未得到洗脱峰。
[0069]以上所述实施例，只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明专利申请范围内。