专利名称：蛋白多糖含有物的制作方法蛋白多糖是与胶原蛋白等一起形成结缔组织的细胞外基质中的基质的主要生物体高分子。蛋白多糖以往是将哺乳动物(特别是牛)软骨中所含的物质提取分离而得的， 然而由于报告过牛海绵状脑症(BSE)的发病，因此希望有取而代之的蛋白多糖供给源及制造方法。水产动物组织是有力的蛋白多糖供给源替代候选。尝试过提取水产动物鲸、鲨鱼的软骨中所含的蛋白多糖。但是，在这些水产动物的捕获量方面存在限制，很难制造大量的蛋白多糖。另外，提取分离操作也很烦杂，在提取中所用的溶剂等中存在有毒性不低的物质，如此等等。由此，形成如下的状况，即，产品的用途受到限制，特别是难以用于食品或化妆品的制造中。此种状况下，研究了各种各样的蛋白多糖制造方法。例如，专利文献1中，记载有如下的蛋白多糖的提纯方法，其特征在于，用溶剂提取对鲑鱼的鼻软骨进行粉碎及脱脂处理而得的脱脂干燥粉末，进行从所得的提取液中分离提纯粗蛋白多糖的后透析。但是，该方法中将氯仿、甲醇等毒性不低的有机溶剂作为提取溶剂使用，另外，还有在所得的蛋白多糖中残存有腥臭等问题。另外，专利文献2中记载有使用乙酸作为提取溶剂从鲑鱼鼻软骨中提纯蛋白多糖的方法。专利文献3中显示，在利用专利文献2记载的提纯方法提纯出的蛋白多糖中具有纤维芽细胞繁殖促进作用及玻尿酸合成促进作用。如此所述，对于蛋白多糖的制造方法、其用途及效果，现在也还在进行着研究。专利文献专利文献1日本特开2001-172^6号公报专利文献2日本特开2002-069097号公报专利文献3日本特开2008-247803号公报
本发明的目的在于，使用毒性低的溶剂，从鱼类软骨中制造新型的含有蛋白多糖的组合物(蛋白多糖含有物)，以及找出该蛋白多糖含有物的新用途及优异的效果。本发明人等发现，令人吃惊的是，从鱼类的软骨中利用特定的步骤提取而得的、含有酸性糖成分的提取物包含具有与以往已知的蛋白多糖相比更大的分子量的蛋白多糖。此外还发现，该提取物发挥出各种优异的效果，反复加以改良而完成了本发明。予以说明，本说明书中，有时将酸性糖、以及具有酸性糖作为构成成分的化合物称作酸性糖成分。蛋白多糖是具有将酸性糖与蛋白质结合而成的结构的物质，因此与该化合物相当。所以，蛋白多糖是酸性糖成分的1种。本发明的蛋白多糖含有物包含蛋白多糖及酸性糖作为酸性糖成分。所以，也可以将本发明的蛋白多糖含有物改称为酸性糖成分含有物。本发明例如包含以下的项目中记载的蛋白多糖含有物、含有该含有物的组合物寸。项目1.一种蛋白多糖含有物，其是从鱼类的软骨中得到的、包含蛋白多糖及酸性糖作为酸性糖成分的蛋白多糖含有物，其中包含分子量为2000kDa以上的酸性糖成分。项目2.根据项目1中记载的蛋白多糖含有物，包含分子量为5000kDa以上的蛋白多糖。项目3.根据项目1或2中记载的蛋白多糖含有物，酸性糖成分的50质量％以上具有 2000kDa以上的分子量。项目 4.根据项目1 3中任一项记载的蛋白多糖含有物，蛋白多糖的20质量％以上具有 IOOOOkDa以上的分子量。项目5.根据项目1 4中任一项记载的蛋白多糖含有物，酸性糖成分的20质量％以上为蛋白多糖。项目 6.一种饮食品组合物，包含项目1 5中任一项记载的蛋白多糖含有物。项目7.一种口腔用组合物，包含项目1 5中任一项记载的蛋白多糖含有物。项目 8.一种化妆品组合物，包含项目1 5中任一项记载的蛋白多糖含有物。项目9.一种蛋白多糖，其是从鱼类的软骨中提取出的蛋白多糖，分子量为5000kDa以上。本发明的蛋白多糖含有物能够起到出色的皮肤纤维芽细胞繁殖效果、皮肤屏蔽功能增强及改善效果、皮肤胶原蛋白产生能力增强及改善效果、真皮肥厚抑制效果等、对于皮肤的保湿及抗老化来说有利的效果。图1是表示在本发明中考虑表示蛋白多糖的峰面积时的步骤的示意图。图2是表示将来源于鲑鱼鼻软骨的粉末(左图)及来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物(右图)作为样品，用凝胶过滤色谱(使用kphar0SeCL-2B填充柱)处理，每次 ImL地采取洗脱馏分，分别用咔唑硫酸法及UV吸收法对该各馏分中所含的酸性糖量及蛋白质量进行定量而得的结果。图3是表示对市售的蛋白多糖(PG-K)及市售的粘多糖(PG-M ；作为软骨素销售)进行凝胶过滤色谱处理、并将各洗脱馏分中所含的酸性糖量定量而得的结果。将PG-M的结果表示于左图中，将PG-K的结果表示于右图中。图4表示对葡聚糖分子量标示物进行凝胶过滤色谱、并利用苯酚·硫酸法将各洗脱馏分中所含的糖量(即葡聚糖量)定量而得的结果。图5表示以由图4得到的、各分子量标示物所洗脱的液体量为基准制成的标准线。图6表示将图1及图2所示的酸性糖量测定结果汇总而得的曲线图。图7表示将来源于鲑鱼鼻软骨的粉末作为样品用凝胶过滤色谱(使用S^hacryl S-1000SF填充柱)处理，每次ImL地采集洗脱馏分，用咔唑硫酸法对该各馏分中所含的酸性糖量进行定量而得的结果。图8表示对来源于鲑鱼鼻软骨的粉末、以及来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物的、人皮肤纤维芽细胞繁殖能力研究而得的结果。图9表示对来源于鲑鱼鼻软骨的粉末、以及来源于鱼鼻软骨的粉末的水提取物因经口摄取而对皮肤屏蔽功能(TEffL值)造成的影响研究而得的结果。图10表示来源于鲑鱼鼻软骨的粉末、以及来源于鱼鼻软骨的粉末的水提取物因经口摄取而对皮肤弹性造成的影响研究而得的结果。图11表示来源于鲑鱼鼻软骨的粉末、以及来源于鱼鼻软骨的粉末的水提取物因经口摄取而对皮肤的胶原蛋白产生能力造成的影响研究而得的结果。图12表示为了研究来源于鲑鱼鼻软骨的粉末、以及来源于鱼鼻软骨的粉末的水提取物对真皮皮厚造成的影响而测定将它们经口投放后的小鼠的背部的真皮皮厚的结果。图13表示对来源于鲑鱼鼻软骨的粉末、以及来源于鱼鼻软骨粉末的水提取物因经皮投放而对皮肤屏蔽功能(TEffL值)造成的影响研究而得的结果。图14表示使用了离子交换色谱及凝胶过滤色谱的、来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物的分级的概要。图15表示对来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物的分级级别研究细胞繁殖效果的结果。具体来说，表示从添加各样品(50 μ g/ml)起7天后的细胞数。而且，所谓“PGNP 水提取物”表示来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物。图16表示对来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物的分级级别研究细胞繁殖效果的结果。具体来说，表示从添加各样品(10yg/ml)起7天后的细胞数。另外，本发明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖优选其20质量％以上、更优选其30质量％以上具有6000kDa以上(更优选为IOOOOkDa以上)的分子量。而且，本发明的蛋白多糖含有物以干燥质量换算，优选包含15 70质量％、更优选包含30 70质量％的酸性糖成分。另外，本发明的蛋白多糖含有物以干燥质量换算，优选包含4 40质量％、更优选包含10 40质量％、进一步优选包含15 40质量％的蛋白多糖。本发明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分或蛋白多糖的分子量可以使用色谱等来测定。特别适合使用凝胶过滤色谱来测定。具体来说，例如只要作为色谱柱的载体使用琼脂糖系(琼脂糖、交联琼脂糖等)的凝胶，作为缓冲液使用磷酸缓冲液(优选含有氯化钠的缓冲液)即可。可以对蛋白多糖含有物进行凝胶过滤，根据酸性糖成分或蛋白多糖被洗脱前的液量(洗脱液量)来决定该组合物中所含的酸性糖成分或蛋白多糖的分子量。予以说明，由于蛋白多糖具有将粘多糖(mucopolysuccharide)与蛋白质共价结合而成的结构，因此在进行色谱处理时，可以通过对酸性糖及蛋白质进行监测，来检出蛋白多糖的洗脱。也就是说，将对酸性糖进行监测而得的色谱图、和对蛋白质进行监测而得的色谱图重叠，如果在两个色谱图中在大致相同的洗脱液量范围中有峰，则可知该峰是检出蛋白多糖的峰。例如在酸性糖的监测中可以使用咔唑硫酸法。可以每次分取一定量的色谱的洗脱馏分，利用咔唑硫酸法将各分取馏分中所含的酸性糖量定量而決定。另外，例如，在蛋白质的监测中可以使用UV吸收法(测定在^Onm附近具有吸收的色氨酸·酪氨酸·苯基丙氨酸的吸光度而将蛋白质定量的方法)、茚三酮反应、BCA法、Bradford法、Lowry法、双缩脲法等。尤其是，利用UV吸收法来定量十分简便。而且，在根据洗脱液量决定分子量时，只要对分子量标示物同样的进行凝胶过滤色谱处理，测定该分子量标示物被洗脱的液量而制成标准线(洗脱液量ν s分子量)即可。 分子量标示物可以考虑上述的蛋白多糖含有物的分子量值、所用的凝胶的种类等，选择、买入适当的材料使用。例如，可以使用由葡聚糖构成的分子量标示物。此种分子量标示物可以从SIGMA等买入。在本发明的蛋白多糖含有物中，还含有酸性糖成分以外的来源于鱼类软骨的成分。作为此种成分，例如可以举出胶原蛋白等蛋白质、盐类等。本发明中，所谓物质的平均分子量是指如下求出的分子量，即，在利用凝胶过滤色谱对该物质进行分析而得的色谱图中，引出将该物质的峰的面积2等分的、垂直于横轴(洗脱液量)的线O等分线)，根据相当于该2等分线位置的洗脱液量使用标准线求出。具体来说，是指利用实施例的“蛋白多糖含有物的分子量的研究”中记载的方法求出的分子量。例如，对于蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分的平均分子量，将蛋白多糖含有物用凝胶过滤色谱分离，在对其中所含的酸性糖成分进行监测而得的色谱图中，引出将该色谱图的面积2等分的线，根据相当于该2等分线位置的洗脱液量使用标准线(即，将该洗脱液量带入标准线的方程式)而求出分子量值，将该值作为平均分子量。对于酸性糖成分的监测，如果更具体地进行说明，则是将蛋白多糖含有物加以凝胶过滤色谱分析，以一定速度进行洗脱，每次一定量地回收洗脱液，对所回收的各洗脱液(馏分)中含有何种程度的酸性糖进行定量，将结果作为色谱图即可。另外，对于蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的平均分子量，在利用凝胶过滤色谱分析蛋白多糖含有物而得的色谱图中，引出将表示蛋白多糖的峰的面积2等分的线，根据相当于该2等分线位置的洗脱液量使用标准线求出分子量值，将该值作为平均分子量。如前所述，将对酸性糖进行监测而得的色谱图、和对蛋白质进行监测而得的色谱图重叠，在两个色谱图中存在于大致一致的位置的峰是表示蛋白多糖的峰。在表示蛋白多糖的峰的上升沿或下降沿因与其他的酸性糖成分的峰重叠而无法确认的情况下，根据峰的形状来推定上升沿及下降沿。此后，根据所推定的上升沿或下降沿来求出分子量或平均分子量。作为例子，图1中表示出无法确认下降沿时的峰的轮廓的推定方法的概要。图1中，引出峰的下降的延长线而决定峰的轮廓。在求酸性糖成分及蛋白多糖的任意一个的分子量或平均分子量时，也优选分析对酸性糖进行监测而得的色谱图。另外，在进行凝胶过滤色谱时，也可以通过仅回收与表示蛋白多糖的峰相当的馏分，来提纯本发明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖。另外，也可以通过包含表示蛋白多糖的峰地回收途中以前的馏分，来得到平均分子量更大的蛋白多糖含有物。本发明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分通常其20质量％以上、优选20 60质量％、更优选25 55质量％、进一步优选30 50质量％为蛋白多糖。在该酸性糖成分中所占的蛋白多糖的比例可以根据上述的为求出酸性糖成分或蛋白多糖的分子量而使用的色谱图来求出。即，通过在对蛋白多糖含有物的酸性糖成分进行监测而得的色谱图面积中，求出表示蛋白多糖的峰的面积所占的比例，来求出在酸性糖成分中所占的蛋白多糖的比例。本发明的蛋白多糖含有物如上所述，由鱼类软骨中制造。具体来说，可以通过利用乙醇处理将鱼类软骨脱脂而制造。另外，可以从脱脂了的鱼类软骨中进行水提取而制造。例如可以利用以下的工序来制造。工序(1)水处理工序将鱼类的含软骨组织(例如鱼类头部)在常温或低温(约0 40°C )的水中浸渍几分钟 几天左右。既可以静置浸渍，也可以一边搅拌一边浸渍，还可以使用管路搅拌器等与水混合搅拌。水的量没有特别限制，然而优选为将该含软骨组织整体浸泡的量。这样，由于将该组织的腥臭去掉，并且向该组织中渗透水而膨胀，因此很容易除去软骨以外的部分。 而且也可以在浸渍到水中之前，先将该含软骨组织预先切片或粗粉碎，或者将软骨以外的组织中可以除去的组织预先除去等。在浸渍到水中而将组织脱臭、适度地膨胀的阶段，从鱼类的含软骨组织中提取脂肪等(即，将含软骨组织脱脂)。该脂肪等溶解或悬浮在水等中，或者成为脂肪层而漂浮在水层上。通过除去该水层及脂肪层，而除去含软骨组织中所含的脂肪。也可以利用离心分离将这些不需要物质分离除去。工序O):乙醇处理工序将除去脂肪层及水层后得到的残渣(软骨组织)回收，向该残渣中加入乙醇，进一步提取脂肪而除去。通过除去脂肪，还会更加高度地加以脱臭。而且，也可以使用含水乙醇。 另外，优选在加入有机溶剂前将残渣(软骨组织)粉碎。粉碎方法没有特别限制，然而例如可以使用可以将软质物质微粉碎的球磨机、振动式磨机、低温粉碎机、冷冻粉碎机、滚动球磨机、粉碎混合机、混合磨等来进行。另外，粉碎粒度也没有特别限制，然而优选为10 500 μ m左右，更优选为50 250 μ m左右。而且，该粒度可以利用激光衍射散射法来测定。具体来说，例如，向如上所述地得到的软骨组织(优选为粉碎软骨组织)中，加入将该组织充分浸渍的容量的乙醇而静置或搅拌，其后除去该溶剂即可。另外，优选将该操作反复进行多次(例如2 5次)。或者，也可以使乙醇循环地进行脂肪除去处理。该情况下，例如可以优选使用索氏提取器等。此种处理之后，回收固体成分。也可以将所回收的固体成分风干等，而将有机溶剂完全地除去。可以将如此得到的固体成分作为蛋白多糖含有物使用。如果对上述工序⑵举出更具体的一个例子，则例如可以利用包括下面的〔1〕 〔9〕中记载的工序的方法来进行该工序O)。〔1〕将除去了皮、硬骨等附着物的鲑鱼鼻软骨用绞肉机粗粉碎。〔2〕向粉碎了的鲑鱼鼻软骨中，加入鲑鱼鼻软骨的相同量 2倍量(体积)的 PH6 7. 5的自来水或净化水，在40°C以下的温度下充分地搅拌。〔3〕搅拌后，进行离心分离机处理，采集固体成分。〔4〕将〔2〕及〔3〕的处理反复进行1或2次。〔5〕将所得的固体成分使用公知的湿式粉碎机进一步微粉碎。〔6〕加入微粉碎鲑鱼微软骨的约10倍量(体积)左右的95°以上的纯度的乙醇， 在40°C以下的温度下充分地搅拌。〔7〕搅拌后，进行离心分离机处理，采集固体成分。〔8〕将〔6〕及〔7〕的处理反复进行1 3次。〔9〕根据需要进行干燥。而且，在上述〔5〕中，也可以将所得的固体物暂时冷冻干燥后进行微粉碎。工序(3)水提取处理工序更优选将工序O)中得到的固体成分再提供给借助水的提取工序，将用水提取出的物质作为蛋白多糖含有物使用。例如，加入能够将工序O)中得到的固体成分充分地浸渍的量的水，搅拌后，将除去不溶物而得的溶液或其干燥物作为蛋白多糖含有物使用。所用的水通常来说pH为5. 5 8. 0，优选pH6. 0 7. 5，更优选ρΗ6· 5 7. 5。具体来说，例如， 在水中浸渍30分钟 6小时左右的同时搅拌，或者在利用管路混合器等与水混合搅拌等后，除去不溶物即可。除去不溶物后，也可以使用公知的方法将其干燥。另外，除去不溶物后，也可以加入以容量计为2 10倍量的乙醇，将所生成的固体成分回收。该情况下，也可以在加入乙醇前添加氯化钠。如果对上述工序(3)举出更具体的一个例子，则例如可以在进行上述〔1〕 〔9〕 后，如下面的〔10〕 〔12〕中记载的那样进行该工序(3)。〔 10〕加入〔9〕中得到的干燥物的相同量 2倍量(体积)左右的ρΗ6 7. 5的净化水，在40°C以下的温度充分地搅拌30分钟 48小时左右。〔11〕进行离心分离处理，除去固体成分。〔12〕根据需要进行干燥。而且，也可以在上述〔11〕之后，再添加乙醇而搅拌，将所生成的固体成分回收。如上所述，也可以说，本申请发明的蛋白多糖含有物是经过(A)提纯鱼类软骨的工序；
(B)使用有机溶剂从鱼类软骨中除去脂肪的工序；(C)使用已经除去脂肪的鱼类软骨，再进行水提取，回收提取物的工序的(A) (B)或(A) (C)制造的。(A)、⑶、(C)工序分别相当于上述的(1)、⑵、⑶工序。本发明的蛋白多糖含有物可以理想地用于皮肤的抗老化。皮肤因各种要因而每天受到伤害。例如，在表皮层中，因外在要因(例如紫外线等光照射等)或内在要因(例如老龄化等)而使表皮屏蔽功能降低，经表皮透过散失水分量(trans印idermal water loss TEffL)升高。由此，肌肤变得干燥、或引起肌肤粗糙等。另外，基于相同的理由，在真皮中，也会引起胶原蛋白产生能力的降低、皮肤弹性的降低、真皮层的肥厚等，加剧皮肤的僵固化。 由此，会在皮肤中产生褶皱等。本发明的蛋白多糖含有物具有抑制及改善此种皮肤的症状的多种效果(皮肤纤维芽细胞繁殖效果、皮肤屏蔽功能增强及改善效果、皮肤胶原蛋白产生能力增强及改善效果、真皮肥厚抑制效果等对于皮肤的保湿及抗老化有利的效果)，特别是可以理想地用于对由光(尤其是紫外线)照射引起的上述的皮肤症状的预防及改善。本发明的蛋白多糖含有物的使用方式没有特别限制，然而特别优选用在口腔护理领域、化妆品领域及饮食品领域中。所以，在本发明中，包括含有本发明的蛋白多糖含有物的口腔用组合物、含有本发明的蛋白多糖含有物的化妆品组合物、以及含有本发明的蛋白多糖含有物的饮食品组合物。口腔护理领域中所用的含有蛋白多糖含有物的口腔用组合物(以下有时记作“本发明的口腔用组合物”)可以通过将本发明的蛋白多糖含有物与口腔用组合物中所用的其他成分(例如研磨剂、发泡剂、清洗剂、表面活性剂、湿润剂、PH调节剂、增稠剂、香味剂等) 适当地配合来制造。例如，可以利用常法以糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂布剂、喷雾剂、填补剂、 液体剂、漱口剂、软膏剂、口香糖、糖锭剂、片剂等形态来制造。此种本发明的口腔用组合物特别是通过向口腔内涂布、喷雾或者漱口等，会特别地使口腔内的纤维芽细胞繁殖，增强、改善皮肤屏蔽功能，增强、改善皮肤胶原蛋白产生能力，因此适用于口腔组织的再生、防老化。本发明的口腔用组合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量并没有特别限制，然而相对于组合物整体来说，通常为0. 002 13质量％，优选为0. 01 5质量％，更优选为0. 02 3质量％。另外，该口腔用组合物的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的量没有特别限制，然而相对于组合物整体来说，通常为0. 001 5质量％，优选为0. 005 2质量％，更优选为0.01 1质量％。化妆品领域中使用的、含有本发明的蛋白多糖含有物的化妆品组合物(以下有时记作“本发明的化妆品组合物”)可以通过将本发明的蛋白多糖含有物与容许用于化妆品用途的介质、基剂、载体、添加剂、或其他容许用于化妆品用途的成分、材料适当地配合，依照常法来制造。具体来说，可以举出包含本发明的蛋白多糖含有物地制造的乳液、化妆水、霜、 美容液、粉底、剥撕式面膜、防晒霜等。此种本发明的化妆品组合物可以作为防晒用、晒后修复用、保湿用及抗皮肤老化用(例如干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤的褶皱、松弛等的预防或改善用)使用。本发明的化妆品组合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量，没有特别限制，相对于组合物整体来说，通常为0. 002 5质量％，优选为0. 02 2质量％，更优选为0. 1 2质量％。此外，该化妆品组合物的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的量相对于组合物整体来说，通常为0. 001 2质量％，优选为0.01 1质量％，更优选为0. 05 1质量％。饮食品(饮料及食品)领域中使用的、含有本发明的蛋白多糖含有物的饮食品组合物(以下有时记作“本发明的饮食品组合物”)是将本发明的蛋白多糖含有物、食品卫生学上容许的基剂、载体、添加剂、或其他可以作为食品利用的成分、材料等适当地配合而得的物质。例如，可以例示出含有本发明的蛋白多糖含有物的、保湿用及抗皮肤老化用(例如干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤的褶皱、松弛等的预防或改善用)的加工食品、饮料、健康食品 (营养功能食品、特定保健用食品等)、保健品、美容食品、病人用食品等。此外，此种包含本发明的饮食品组合物的保湿剂、抗皮肤老化剂也包含于本发明中。该保湿剂、抗皮肤老化剂可以以美容用或抗皮肤老化用(例如干燥皮肤、皮肤粗糙、皮肤的褶皱、松弛等的预防或改善用)的饮用剂、锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、胶冻剂、糖锭剂等形态提供。对于本发明的饮食品组合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量，没有特别限制，在食品组合物或包含食品组合物的剂的情况下，相对于组合物或剂整体来说，通常为 0.01 50质量％，优选为0.02 25质量％，更优选为0. 1 8质量％。另外，在饮料组合物或包含饮料组合物的制剂的情况下，本发明的饮食品组合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量，没有特别限制，相对于组合物或剂整体来说，通常为0. 002 13质量％， 优选为0.01 8质量％，更优选为0. 1 2质量％。此外，对于该饮食品组合物的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的量，在食品组合物或包含食品组合物的制剂的情况下，相对于组合物或剂整体来说，通常为0. 005 20质量％，优选为0. 01 10质量％，更优选为 0. 05 3质量％。在饮料组合物或包含饮料组合物的制剂的情况下，相对于组合物或剂整体来说，通常为0. 001 5质量％，优选为0. 005 3质量％，更优选为0. 01 1质量％。此外，如果将本发明的蛋白多糖含有物与玻尿酸或胶原蛋白一起使用，则会提高本发明的蛋白多糖含有物的效果，因此优选。所以，在上述的本发明的口腔用组合物、化妆品组合物、饮食品组合物中，也优选还配合玻尿酸和/或胶原蛋白(优选胶原蛋白水解物)。 特别是，通过将本发明的蛋白多糖含有物与玻尿酸一起经口摄取，会进一步提高皮肤的保湿效果及抗老化效果，因此优选。虽然没有特别限制，然而在将本发明的蛋白多糖含有物设为1质量份时，可以并用0.01 1质量份、优选0. 02 0.5质量份、更优选0. 05 0.2质量份的玻尿酸。而且，该本发明的口腔用组合物、化妆品组合物、及饮食品组合物中所含的酸性糖成分的量例如可以利用咔唑硫酸法求出。另外，可以根据将这些组合物用凝胶过滤色谱分析而得的、酸性糖检测色谱图来求出。另外，对于这些组合物中所含的蛋白多糖的量，例如可以将这些组合物用凝胶过滤色谱分析，将酸性糖检测色谱图及蛋白质检测色谱图重叠， 通过将重复的峰作为蛋白多糖的形式检出、定量来决定。另外，本发明还包括通过将本发明的蛋白多糖含有物向皮肤或口腔内涂布而获得使纤维芽细胞繁殖、或者使皮肤屏蔽功能增强、改善等本说明书中记载的效果的方法。该方法中，也可以原样不变地使用本发明的蛋白多糖含有物。另外，可以优选使用上述的本发明的口腔用组合物、化妆品组合物。适用该方法的对象没有特别限制，然而优选特别是因老化或日晒而使皮肤屏蔽功能降低的人。另外，也可以出于美容目的来使用。使用量也没有特别限制，可以适当地设定必需量。此外，本发明还包括通过将本发明的蛋白多糖含有物经口摄取而获得使纤维芽细胞繁殖、使皮肤屏蔽功能增强、改善、使皮肤弹性改善、抑制真皮皮厚、或使皮肤胶原蛋白产生能力增强、改善等本说明书中记载的效果的方法。该方法中，也可以原样不变地使用本发明的蛋白多糖含有物。另外，可以优选使用上述的本发明的饮食品组合物。适用该方法的对象没有特别限制，然而优选特别是因老化或日晒而使皮肤屏蔽功能降低的人、皮肤弹性降低的人等。另外，也可以出于美容目的来使用。使用量也没有特别限制，可以适当地设定必需量。实施例以下，具体地说明本发明，然而本发明并不限定于下述的例子。蛋白多糖含有物的制造将鲑鱼头部浸渍在水中静置1天，使之膨胀。然后，从鲑鱼头部除去鼻软骨以外的组织而得到鲑鱼鼻软骨。将该鲑鱼鼻软骨粗粉碎，制成鲑鱼鼻软骨粉末。向该粉末IOOg 中加入水IOOmL,温和地搅拌后，在室温下静置10分钟，进行脱脂。其后，进行离心分离 (SOOOrpm, 30分钟，室温)，回收所得的残渣(鲑鱼鼻软骨脱脂粉末)，冷冻干燥。将冷冻干燥了的鲑鱼鼻软骨脱脂粉末9. 02g用超离心粉碎机制成粒径约100 200 μ m(利用激光衍射散射法测定)的细粉末。此后，使用20mL的乙醇将该细粉末清洗3次后风干，得到含有酸性糖成分的细粉末7. 69g。以下有时将该细粉末称作“来源于鲑鱼鼻软骨的粉末”。而且， 这里所说的使用乙醇的“清洗”是将细粉末分散于乙醇中后离心回收沉淀的操作(乙醇沉淀)。继而，向来源于鲑鱼鼻软骨的粉末20g中加入IOOOmL的常温的净化水(pH6.5)，搅拌30分钟后，在室温下静置10分钟。其后，进行离心分离(SOOOrpm，30分，室温)，回收上清液而浓缩干固，得到含有酸性糖成分的粉末约7g。以下有时将如此得到的水提取物称作 “来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物”。在该来源于鲑鱼鼻软骨的粉末中，含有约20质量％的酸性糖成分、约9质量％的蛋白多糖(也就是说，含有约11质量％的粘多糖等酸性糖)。另外，在该来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物中，含有约35质量％的酸性糖成分、约15质量％的蛋白多糖(也就是说，含有约20质量％的粘多糖等酸性糖)。而且，该数字是在利用咔唑硫酸法将糖醛酸(葡萄糖醛酸)定量、继而在该定量法中使用广为人知的下式求出硫酸软骨素量(质量)、并将其作为酸性糖成分量时的数字。[式1]软骨素硫酸量=葡萄糖醛酸量X 2. 593而且，以下只要没有特别指出，利用咔唑硫酸法求出的酸性糖成分量就表示与上述相同地求出的硫酸软骨素量。另外，蛋白多糖的含有量可以如下算出，S卩，如下所示地在对酸性糖成分量利用糖醛酸定量进行监测的同时，进行凝胶过滤色谱分析而得到色谱图，根据该色谱图中的表示蛋白多糖的峰在整个色谱图中所占的面积比算出。也就是说，可以通过将该面积比乘以酸性糖成分量而算出。蛋白多糖含有物的分子量的研究
对所得的蛋白多糖含有物的分子量，利用凝胶过滤色谱进行了研究。具体来说，首先，将来源于鲑鱼鼻软骨的粉末及来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物作为样品用下述条件的凝胶过滤色谱进行处理，每次ImL地采集洗脱馏分，将该各馏分中所含的酸性糖量及蛋白质量分别用咔唑硫酸法及UV吸收法定量。将作为该凝胶过滤色谱分析的结果得到的色谱图表示于图2中。其中，分析酸性糖量的色谱图表示出利用咔唑硫酸法定量的葡萄糖醛酸量(不是将该葡萄糖醛酸量乘以 2. 593倍而作为硫酸软骨素的量)。而且，对于来源于鲑鱼鼻软骨的粉末，为了提高纯度而用4M盐酸胍(4M GuCl)进行提取处理，将所得的提取物作为样品使用。该提取处理具体来说是如下所示地进行的。向来源于鲑鱼鼻软骨的粉末Ig中加入4M GuCl，在4°C搅拌1天后离心分离，向上清液中加入3倍量的食盐饱和乙醇而放置1晚后，离心分离而回收沉淀。 将该沉淀作为凝胶过滤色谱用样品。将来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物直接作为样品使用。〔凝胶过滤色谱条件〕色谱柱kpharose CL-2B填充柱(以kpharose CL-2B作为载体而填充到φ IcmX 48cm的柱子中。kpharose CL-2B的葡聚糖的分级范围是100 20000kDa，可以从GE Healthcare公司等处买到。Sepharose CL-2B是2 %交联琼脂糖，粒子粒径60 200 μ m (基于激光衍射散射法得到)，CAS注册编号65099-79-8。)缓冲液0. IM磷酸缓冲液(pH 7. 1，含有0. 2M NaCl)应用样品量％ig(溶解于Iml缓冲液中使用)流速0. 15mL/min溜分量lmL/tube另外，对于市售的蛋白多糖(以下也称作“PG-K”)及市售的粘多糖(软骨素)(以下也称作“PG-M”)，也在相同的条件下进行凝胶过滤色谱处理，将各洗脱馏分中所含的酸性
糖量定量。将结果表示于图3中。如图2所示，在洗脱液量约为15 23mL的范围中，得到糖及蛋白质双方的峰。所以可知，该峰表示蛋白多糖。然后，对于下述的各种葡聚糖分子量标示物，也分别在与上述相同的条件下(但是样品量为Img)进行凝胶过滤色谱处理，利用苯酚·硫酸法将各洗脱馏分中所含的糖量(即葡聚糖量)定量。具体来说，依照Hodge, J. Ε. and Hofreiter，B. Τ.，Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)中记载的方法，如下所示地定量。〔 1〕向105X 15_的试管中加入500 μ 1的试样水溶液或标准单糖(甘露糖)水溶液。〔2〕加入500 μ 1的苯酚试剂(5V/V%苯酚水溶液)，搅拌。〔3〕加入2. 5ml的浓硫酸，立即剧烈搅拌10秒钟。〔4〕在室温下放置20分钟以上。〔5〕用分光光度计测定490nm的吸收。<葡聚糖分子量标示物>Dextran from Leuconostoc mesenteroides (葡聚糖来自肠膜样明串珠菌)(mol wt 5，000，000-40，000，000)(SIGMA)
· · 空隙体积测定用、IOOOOkDaDextran Mandard (葡聚糖标准)1,400, 000 (SIGMA) · · .HOOkDaDextran Standard 670, OOO(SIGMA) · · ‘ 670kDaDextran Standard 410, OOO(SIGMA) · · · 4IOkDaDextran Standard 270，000(SIGMA) · · · 270kDa而且，对于标示物 Dextran from Leuconostoc mesenteroides,是为了测定 kphar0SeCL-2B填充柱(分级上限20，OOOkDa)的空隙体积而使用的。为了更为准确地测定空隙体积，进行了将该标示物中所含的低分子的葡聚糖除去的前处理。前处理是通过利用上述的〔凝胶过滤色谱条件〕使Dextran from Leuconostoc mesenteroides洗脱，回收分子量20，OOOkDa以上的分子并冷冻干燥而进行的。具体来说，将与最先出现的峰相当的洗脱液量15 19mL的分级物回收，将其冷冻干燥(可以认为，由此可以将分子量20，OOOkDa 以上的分子回收、冷冻干燥)。此后，将该冷冻干燥物用于色谱柱中而进行测定。将结果得到的色谱图表示于图如 e中。而且，图如是测定经过上述的前处理的冷冻干燥物的图。对于图如的来源于Leuconostoc mesenteroides的葡聚糖前处理物， 由于分子量超过所用的kphar0SeCL-2B填充柱的分级范围(IOOkDa 20000kDa)，因此将与峰顶点位置对应的洗脱液量作为该色谱柱的排斥极限20000kDa的分子被洗脱的洗脱液量。而且，将该洗脱液量解释为表示色谱柱的空隙体积(Void Volume)。对于图4b e， 将与色谱图的峰面积的2等分线的位置相当的洗脱液量作为各自的标示物分子量的分子被洗脱的时间点的洗脱液量。图4b e分别是测定Dextran Standard 1400000,670000, 410000,270000的结果。将这些洗脱液量及分子量的关系加以曲线图化，制成标准线，其结果是形成直线(y = -4. 1355Ln(x)+59. 47 ；R2 = 0. 9869)(图5)，由此可以确认，利用该葡聚糖分子量标示物得到的分子量与洗脱液量的关系具有高度的相关性。此外，根据分析结果可知，在到达空隙体积前的洗脱液中含有蛋白多糖(即，存在超过分级极限的20000kDa的蛋白多糖)的可能性很高。该凝胶过滤色谱中所用的色谱柱由于分级范围是IOOkDa 20000kDa，因此很有可能无法将20000kDa以上的分子准确地分级。所以，与上述相同，将来源于鲑鱼鼻软骨的粉末作为样品进行了借助下述条件的凝胶过滤色谱进行分析及各馏分的酸性糖量的定量。〔凝胶过滤色谱条件〕色谱柱S印hacryl S-1000SF填充柱(将kphacryl S-1000SF作为载体填充到φ lcmX48cm的柱子中的材料。S^hacryl S-1000SF的葡聚糖的分级范围是5X IO5 lXl(fDa，可以从GE Healthcare公司等处买到。)缓冲液0. IM磷酸缓冲液(ρΗ7· 1，含有0. 2Μ NaCl)应用样品量Mmg流速0. 3mL/min溜分量lmL/tube此外，将以下的分子量标示物在相同的条件下进行凝胶过滤色谱处理，利用苯酚·硫酸法将各洗脱馏分中所含的糖量(即葡聚糖量)定量而制成标准线。<葡聚糖分子量标示物>Dextran from Leuconostoc mesenteroides(mo1 wt 5000000-40000000)(SIGMA)
· · · IOOOOkDaDextran Standard 1400000(SIGMA) · · · 1400kDaDextran Standard 670000(SIGMA) · · ‘ 670kDa所得的标准线是y = -3. 8743Ln (χ) +59. 887 (R2 = 0. 9961)将图2及图3中所示的酸性糖量测定结果曲线图汇总在1个曲线图中，再将记载有如上所述地得到的分子量与洗脱液量的关系的图表示于图6中。如上所述，对于来源于鲑鱼鼻软骨的粉末及来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物，在凝胶过滤色谱分析的洗脱量约15 23mL的范围显示出峰，而作为蛋白多糖的市售品的PG-M在约观 49mL的范围内， 同样的作为市售品的PG-K在约18 47mL的范围中显示出峰。该结果表明，来源于鲑鱼鼻软骨的粉末及来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物(即，本发明的蛋白多糖含有物)含有与以往所知的蛋白多糖不同的非常高分子的蛋白多糖。另外，根据图5中所示的标准线，可以算出洗脱量23mL相当于分子量约6700kDa。 根据该结果可知，来源于鲑鱼鼻软骨的粉末及来源于鲑鱼鼻软骨的粉末的水提取物含有分子量约6000kDa以上的蛋白多糖。此外，将使用kphacryl S-1000SF填充柱分析来源于鲑鱼鼻软骨的粉末得到的结果表示于图7中。图7中，色谱图的最先显示的表示蛋白多糖的峰的上升沿从洗脱液量 15 16mL的范围开始。如果使用上述的标准线(y = -3. 8743Ln(χ)+59. 887)算出与该洗脱液量范围相当的分子量，则大约为90000kDa。由此可知，来源于鲑鱼鼻软骨的粉末含有 90000kDa左右的蛋白多糖。根据以上的结果可以确认，来源于鲑鱼鼻软骨的粉末含有6000kDa 90000kDa左
右的蛋白多糖。此外，使用图5中所示的标准线，根据图6的各曲线图的峰位置的洗脱液量算出各试样中的蛋白多糖的平均分子量。通常来说，平均分子量是根据峰面积的2等分线位置的洗脱液量算出，然而图6中所示的各色谱图的蛋白多糖峰基本上是左右对称的，因此将峰位置设为2等分线位置而进行算出。具体来说，将实验误差及批次差也考虑在内，将峰位置的洗脱液量士ImL的范围的洗脱液量值设为标准线的y值，将所得的χ值的范围设为各试样中的蛋白多糖的平均分子量。但是，对于利用该分析得到的蛋白多糖的平均分子量的上限值而言，由于所用的色谱柱(kpharose CL-2B填充柱)的分级量上限是20000kDa，因此有可能无法准确地算出，所以还根据使用kphacryl S-1000SF填充柱时的结果，同样地求出蛋白多糖的平均分子量。将结果表示于表1中。[表1]


本发明的目的在于，制造一种新型的蛋白多糖含有物，以及找出该蛋白多糖含有物的新用途和/或优异的效果。本发明提供一种蛋白多糖含有物，其是从鱼类的软骨中得到的，包含分子量为2000kDa以上的酸性糖成分。该蛋白多糖含有物起到优异的皮肤纤维芽细胞繁殖效果、皮肤屏蔽功能增强及改善效果、皮肤胶原蛋白产生能增强及改善效果、真皮肥厚抑制效果等对于皮肤的保湿及抗老化来说有利的效果。