专利名称：包括至少一种蛋白水解酶以及至少一种脂肪分解酶的组合的组合物，用于防止甘油三酯 ...的制作方法通常当今公认的是，在发达国家中很多人当中超重和肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和低能量的频率增加，是由于我们消费的产品中所含卡路里的利用不佳，其中大多时候 是脂肪非常高的。这种代谢缺陷或代谢综合征影响了近5000万美国人(近1/4的美国成年人)和大约3000万欧洲人。年龄在20至30岁之间的约7%的成年人以及年龄在40岁以上的40%的成年人符合发展有这种综合征的标准。代谢综合征代表了同时发生并增加心血管疾病、中风和2型糖尿病风险的一组因素。仅具有这些因素中的一个——血压升高、高胰岛素水平、围绕腰部过多的脂肪或胆固醇水平异常——增加了患上严重疾病的风险；当几个因素组合时，风险就更大了。脂肪，凭借它们的物理、化学、生理性质，在人们的营养方面发挥了重大作用。除了人们以食物形式摄入的脂肪以外，身体本身也制造脂质。膳食脂肪和脂肪组织的脂肪主要是由甘油三酯组成的，甘油三酯是带有三个与其结合的脂肪酸的甘油分子。甘油三酯被分为脂质(脂肪)，但是只有三个脂肪酸是脂肪，因为甘油是多元醇，更正确地其属于碳水化合物类。例如，甘油溶于水且不溶于油；因此甘油不是脂肪。结合至甘油的脂肪酸的结构上的差异使得这些脂肪是不同的并影响它们的粘度状态。因此食物中的甘油三酯有着很大的多样性，比如橄榄油、向日葵油和大豆油、黄油、牛油、猪油、人造黄油等。这些脂肪酸，通过对于所有本身不被吸收的甘油三酯常见的过程，在肠中被吸收。它们必须通过消化道中脂肪酶的作用被分解成甘油二酯、单甘油酯和游离脂肪酸；只有这些各种产物是可吸收的，而甘油三酯不是。脂肪分解脂肪酶或脂肪分解酶是口、胃和胰腺分泌的酶，其将甘油三酯(TAG)切割成小到足以被吸收的分子。不幸的是，脂肪酶仅在甘油的位置I和3进攻甘油三酯(TAG)，导致游离脂肪酸和2单酰甘油(包括一个在位置2结合的脂肪酸的甘油分子)的形成。如果脂肪酶的活性更大，甚至可获得游离脂肪酸和甘油。所有这些分子被身体吸收。但是事情变得复杂了 一旦这些产物被吸收，身体在肠上皮细胞(肠细胞)重新合成(重新形成)已经被脂肪酶(比如胰脂肪酶)断裂成尤其是游离脂肪酸和2-单酰甘油的甘油三酯(见图1，其代表通过脂肪酶的甘油三酯的分解(三酰甘油，TAG)，然后甘油三酯在肠细胞上重新形成)。尤其通过四种酶(酰基CoA合成酶、单甘油酯转酰酶、甘油二酯转酰酶和甘油二酯合成酶)的活性获得这种甘油三酯(TAG)的重新形成，所述酶按照合成的几个阶段而发挥作用。然后游离脂肪酸将在位置I和3结合2-单酰甘油，其将重新形成甘油三酯。这些甘油三酯，不溶于血液，将整合乳糜微粒，其将演变为VLDL、LDL和HDL，并将甘油三酯(TAG )、胆固醇和磷脂运输到整个身体。这些新的甘油三酯将因此结合到脂蛋白中并存储在脂肪细胞(adipocytes)(脂肪细胞(cellules graisseuses))中。由身体吸收的甘油三酯,被断裂成更小的脂肪后,再次作为甘油三酯存储。由于它们储存在脂肪细胞中，因此身体并没有立即利用它们的能量。当它们结合到甘油时，如以甘油三酯的形式，身体不能代谢脂肪酸。要被代谢的话，脂肪酸必 须是游离的。这种代谢缺陷，有人称之为肥胖基因(James V. Neel - DiabetesMellitus:thrifty^genotype rendered detrimental by“progress”_American Journalof Human Genetics - vol. 14 - pages 353-362),其构成甘油三酯的重建和储存,对于数千年前的早期人类是有利的。事实上，储存脂肪的能力对于生存是必要的。在繁荣的时期，当狩猎时使得可能杀死猎物，人们进食更多并保持脂肪储备。通过这种方式储存脂肪，人们然后可以在这些艰难时期通过消耗他们的脂肪储备在饥饿时期长期生存。这些均由Stephen Cunnane 在他的书“The survival of the fattest” 中(TheKey to Human Brain Evolution, World Scientific Publishing Co, New Jersey, UnitedStates, 2005, www. worldscibooks. com)已经得到了很好的解释，其解释道具有最大脂肪储备的人，长期粮食短缺时能最好的生存。同样是这些人，其脑中富含omega-3脂肪酸，并且比他们的同类生物变得更加智能和更加先进。在这一时期，代谢缺陷因此成为进化优势，并在自然选择方面成为优势。这在起源于原始人种的人类的情况中尤其如此。美拉尼西亚人的实例是显而易见的。这些人离开台湾乘坐独木舟然后殖民到所有太平洋岛屿。那些克服了旅程的人们就是那些具有最大脂肪储备的人。自然选择促进最大的生存，然后那些人有了带有肥胖基因的儿童。因此美拉尼西亚人的60-70%是2型糖尿病患者。但是，今天，在发达国家中饥饿得到了也许是过量的满足，这种储存能力已成为一个灾难。事实上，在肠细胞或肠的细胞中甘油三酯的重新合成为人类的健康带来灾难性的后果。特别是，这种甘油三酯的重新形成诱导-乳糜微粒的大小和数目的增加，乳糜微粒在血液中运输甘油三酯、胆固醇和磷月旨，-由于所有被困在甘油三酯中的脂肪酸并且不被身体所代谢，动脉粥样硬化的风险增加，促进动脉斑块的形成和通常动脉血栓的形成，-循环中坏胆固醇的水平增加，-脂肪细胞的数目和大小增加，因此发展体重增加或肥胖。此外，血液中过量的甘油三酯减少可被代谢的游离脂肪酸的量；因此，能源短缺。因此，在一些严重的情况下，肥胖基因相当明显，甚至饭后感到血液中没有获得营养的感觉。这种不愉快的感觉产生对零食的欲望，不断的饥饿感使得消耗食物和饮料以便感觉好些。这种代谢缺陷，不能利用我们吸收的脂肪酸中含有的卡路里的事实，但是其中甘油三酯的形式是不可用的，因为脂肪酸被困在其中，导致一系列并发症，由Reaven称为X综合征或由Kaplan称为“致命四重奏”。-G. M. Reaven -斯坦福大学医学院_退伍军人服务医疗中心部门，内分泌、老年学和代谢科，Palo Alto, CA,美国-Syndrome X 6 years later - Journal of InternalMedicine 1994;236 (Supplement 736):13-22 ；-G. M. Reaven - Simon & Schuster - Rockefeller Center, 1230Avenue of theAmericas -纽约，NY 10020 - Syndrome X-Overcoming the silent killer that can give you a heart attack - Copyright 2000 G. M. Raven, T. Strom 和 B. Fox ;Norman M. Kaplan MD-The Deadly Quartet-Arch Inter. Med-vol 149, July1989:1514-1520。为了找到其需要的能量，被剥夺可获得的被代谢的脂肪酸的我们的身体，将利用身体内无处不在的葡萄糖。这就是使得我们所说的人类是混合动力车。但是葡萄糖，与脂肪酸不同，有许多缺点-燃烧时，其仅释放出每克4卡路里，而脂肪酸释放每克9卡路里，-但最重要的，葡萄糖，要被利用且穿透细胞，需要激素胰岛素。此外，对于葡萄糖穿透所有其细胞，身体必须超越其能力并在极端条件下分泌甚至更多的胰岛素。因此，在身体的一些位置，特别是胰腺可不再分泌这么多的胰岛素，引起胰岛素抵抗的现象；葡萄糖在血液中积累，并不再能穿透细胞。这就是所谓的葡萄糖不耐受性；身体变成胰岛素抗性。这种高胰岛素血症有负面作用；过多的胰岛素防止脂肪酸离开脂肪细胞，即称为脂解作用。因此仍更多的缺乏所要用的可获得的脂肪酸；因为没有更多的脂肪酸离开脂肪细胞，尤其对那些患肥胖的人而言没有减重的可能性。因此，代谢中可获得的脂肪酸的缺乏仍然较大，并且对葡萄糖的利用更强烈，从中仍产生其它并发症，比如甘油三酯血症和胆固醇血症的增加。所有这些代谢异常导致血脂异常、高血压、高尿酸血症以及血糖水平高于正常，由于葡萄糖不能很好的穿透细胞并在血液中积累引起高血糖症。所有这些代谢并发症可以然后导致2型糖尿病，其长期保持。在脂肪细胞中脂肪的积累，尤其是对于男性在腹部和腰围周围以及对于女性在臀部，还将长期保持。所有这些代谢问题，将影响个体的精神，其然后经常处于低谷，这可能会在患有这些代谢异常的所述个体中导致情绪失衡或神经崩溃，尤其是强烈感到不满和不断的饥饿感。此外，大脑因此缺乏供养。过量的胰岛素破坏一些血液指标脂肪细胞因子、TNP β、IL-6、PAI I、肥胖菌素(adiposine)、血管紧张素、瘦素、脂联素、抵抗素、MCSF、TGFL等在血液中增加。所有这些炎症产物突出生物的不平衡并使得个体脂质和碳水化合物的代谢不稳定。之前的工作寻求捷径的甘油三酯的合成与克服这种代谢缺陷的新的途径。因此，发现各种方法来缩减脂肪细胞的储存并使得这些脂肪细胞中储存的脂肪酸是可生物利用的。尤其是用于这一目的的物质包括富含类黄酮的茶提取物来阻断破坏肾上腺素的酶O’ -甲基转移酶，或者富含黄烷-3-醇的葡萄籽提取物以及富含生物类黄酮的松树树皮，后两者增加产热，即从脂肪细胞释放脂肪酸；同样，从可可豆中提取的多酚具有相同的作用。大量使用安非他明及其它异构体或中间体帮助释放困在脂肪细胞中的脂肪。但是，这些产物是非常危险的，现在都已被禁止。还尝试了用共轭的亚油酸(CLA)缩短脂肪细胞路径，亚油酸不进入甘油三酯(TAG)合成循环，并具有不用通过脂肪细胞而进行燃烧的中等链的油。
本申请人寻求找到对抗代谢综合征、挑战肥胖基因并使用所有脂肪的能量，而不促进脂肪堆积形成的一种更好的手段。本申请人注意到许多实验室提出脂肪酶阻断剂的使用以防止TAG分解和重新形成。但是，本申请人发现了一种令人惊奇的方式，抗脂肪酶的产物是绝对不能有效减重的，而且在现实中，通过增加肠内剩余TAG的量对身体具有有害的作用。本发明所提出的解决方案是通过使用蛋白水解酶或蛋白酶与至少一种脂肪分解酶或脂肪酶的组合来抑制、减少和/或防止甘油三酯在身体肠细胞或肠的细胞中的重新形成。通过施用这种蛋白水解酶，特别是脂肪酶，以优良的方式且对身体没有危险，来避免甘油三酯的重新合成。因此,本申请人发现·蛋白水解酶在肠细胞中破坏有助于甘油三酯重新合成的四种酶(酰基CoA合成酶、单甘油酯转酰酶、甘油二酯转酰酶和甘油二酯合成酶)的活性，·但是特别是，如果尤其使用有利地作用于肠甘油三酯位置2的脂肪酶，2-单酰甘油的产生降低，这是甘油三酯重新合成的中心点。这种代谢通路被所有生化学者认为是80%的甘油三酯的合成通路；其它较低效率的通路是从3-磷酸甘油酯的重新合成并且只产生20%的甘油三酯。本发明因此具有这样一个目的，一种包括至少一种蛋白水解酶或蛋白酶和至少一种脂肪分解酶或脂肪酶的组合的组合物，其有利地通过降解2-单酰甘油，用于防止尤其是在肠细胞或肠的细胞中甘油三酯的合成或重新形成。有利地,根据本发明，蛋白水解酶选自枯草杆菌蛋白酶、枯草菌蛋白酶(nagarse)、纳豆激酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、舍雷肽酶及其混合物。在根据本发明一个特别有利的方式中，蛋白水解酶是枯草杆菌蛋白酶或纳豆激酶或者枯草杆菌蛋白酶或纳豆激酶与一种或更多种其它蛋白水解酶的混合物。根据本发明的一个具体特征，相对于组合物总重量，蛋白水解酶按重量5-30%、典型地按重量10-20%的比例出现。根据本发明的另一个具体特征，相对于组合物总重量，脂肪分解酶按重量70-95 %、典型地按重量80-90 %的比例出现。有利地，根据本发明，组合物使得能够施用范围在IOmg和200mg之间，更尤其是IOmg和IOOmg之间，典型地20mg和IOOmg之间，例如，50mg和IOOmg之间的蛋白水解酶的每天剂量。有利地,根据本发明，组合物使得能够施用范围在IOOmg和400mg之间，更尤其是IOOmg和300mg之间，典型地IOOmg和200mg之间，或200mg和300mg之间的脂肪分解酶的
每天剂量。
在本发明的一个
中，组合物制剂成口服施用的。有利地，根据本发明，组合物以硬或软胶囊、片剂、颗粒、粉或口服溶液的形式提供。根据本发明的一个具体特征，组合物以硬或软胶囊或胃耐受性片剂的形式提供。有利地，组合物是胃耐受性的，从而组合物在肠内释放蛋白水解酶和脂肪分解酶。在根据本发明的一个有利的方式中，组合物是药物、化妆品、营养食品或膳食组合物、膳食补充剂、或医疗器械，并可以包括从药物、化妆品、膳食或营养食品的角度而言可接受的任何载体或合适的赋形剂，以及本领域已知的常规添加剂。在根据本发明的一个有利的方式中，组合物包括至少一种脂肪酶，比如提取自米曲霉(Thermomyces Ianuginosus)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、娄地青霉(Penicilliumroqueforti )、卡门伯特青霉(Penicillium camemberti )、白地霉(Geotrichum candidum)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米根霉(Rhizopus oryzae)、爪睡毛霉(Mucor javanicus)的脂肪酶,或来自南极假丝酵母(Candidaanthartica)、白地霉(Geotrichum candidum)的脂肪酶,或提取自燕麦的脂肪酶,及其混合物。在一个特别有利的方式中，组合物包括几种脂肪酶。有利地，在本发明上下文中所用的脂肪酶在甘油三酯位置2上是有活性的，并且将减少2-单酰甘油并防止甘油三酯再次形成，其为一种产生80%甘油三酯的通路。根据本发明的一个具体特征，组合物包括至少一种脂肪酶，其选自南极假丝酵母(Candida anthartica)的 Cal A 或 Cal B 的脂肪酶、白地霉(Geotrichum candidum)、皱落假丝酵母(Candida rugosa),以及这些脂肪酶的二元或三元混合物。通常情况下，组合物包括南极假丝酵母(Candida anthartica)的 Cal A 或 Cal B、白地霉(Geotrichum candidum)和皱落假丝酵母(Candida rugosa)的混合物。在一个具体的实施方式中，本发明的组合物意图用于防止或减少超重、月旨肪生成或过量的胆固醇，或典型地在化妆品组合物或医疗器械中作为消蜂窝组织(anticellulite)剂。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物或产物意图用于防止或治疗肥胖或动脉粥样硬化、或心血管疾病、或2型糖尿病，并且通常被称为代谢综合征，以对抗肥胖基因。本发明还具有这样的一个目的，一种含有如下的组合物或产物
-至少一种蛋白水解酶，比如枯草杆菌蛋白酶，以及-至少一种脂肪酶，比如南极假丝酵母(Candidaanthartica)的Cal A或Cal B、白地霉(Geotrichum candidum)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶，或这些脂肪酶的二元或三元混合物。作为一个组合产物，有利地通过在肠内降解2-单酰甘油，同时、单独或交错使用来防止甘油三酯的合成。有利地，根据本发明，蛋白水解酶选自枯草杆菌蛋白酶、枯草菌蛋白酶、纳豆激酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、舍雷肽酶及其混合物 。在根据本发明的一个有利的方式中，脂肪酶是提取自米曲霉(ThermomycesIanuginosus)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、娄地青霉(Penicillium roqueforti )、卡门伯特青霉(Penicillium camemberti)、白地霉(Geotrichum candidum)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米根霉(Rhizopus oryzae)、爪睡毛霉(Mucor javanicus)的脂肪酶,或是提取自南极假丝酵母(Candida anthartica)、白地霉(Geotrichum candidum)或来自燕麦的脂肪酶。蛋白酶通常以明胶胶囊的形式施用。蛋白酶有利地每天施用两到三次，每餐一个明胶胶囊。通常情况下,产物包括至少一种南极假丝酵母(Candida anthartica)的脂肪酶，比如南极假丝酵母(Candida anthartica)的脂肪酶Cal A或Cal B、白地霉(Geotrichumcandidum)脂肪酶、皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶和/或提取自燕麦的脂肪酶。这是尤其有利的，因为这些脂肪酶在甘油三酯的位置2发挥作用并因此断裂2-单酰甘油，并帮助蛋白酶防止甘油三酯在体内重新形成。没有2-单酰甘油，TAG重新合成要困难得多(记住这种通路产生体内80%的TAG)。脂肪酶通常以明胶胶囊的形式施用。脂肪酶有利地每天施用三次，每餐一个明胶月父囊。在一个具体的实施方式中，本发明的组合物或产物意图用于药物、化妆品剂、医疗器械、膳食组合物、营养食品或膳食补充剂。在一个具体的实施方式中，本发明的组合物或产物意图用于防止或减少超重、月旨肪生成或过量的胆固醇，或作为消蜂窝组织剂。在另一个具体的实施方式中，本发明的组合物或产物意图用于防止或治疗肥胖、动脉粥样硬化、心血管疾病、或2型糖尿病，并且通常被称为代谢综合征，以对抗肥胖基因。

其它两个条件，各包括10只大鼠的组，分别接受8天(每天一次)50mg枯草杆菌蛋白酶和IOOmg南极假丝酵母(Candida anthartica)的Cal A脂肪酶的混合物(对于组I),以及50mg枯草杆菌蛋白酶和50mg白地霉(Geotrichum candidum)脂肪酶和50mg皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶的混合物(对于组2)。8天后，所有的大鼠，包括对照组，接受相当于在人的一汤匙(15毫升)的橄榄油剂量。此橄榄油施用至所有大鼠之后，橄榄油的施用后I小时、2. 5小时和5小时从所有的动物采血。然后从采集的血液计算甘油三酯的水平。在对照大鼠中，对于三个样本(I小时、2. 5小时和5小时)在血液中发现高量的TAG。组I和2在血液中没有TAG。
然后以一周的间隔再施用两次橄榄油——条件I和2始终继续接受枯草杆菌蛋白酶与上述脂肪酶的组合。结果与另外两次的相同。在组I和2中TAG不重新形成，而对照组，对于三个样本血液中具有高浓度的TAG。因此可以得出结论，枯草杆菌蛋白酶和脂肪酶的组合防止形成甘油三酯(TAG)。实施例2 10只小型猪的研究在10只小型猪上进行研究。这些猪被分为四组-一只对照猪-组I中三只猪-组2中三只猪-组3中三只猪对照猪不接受酶。其它三个条件接受三种酶的制剂。制剂I由IOmg枯草杆菌蛋白酶和300mg Cal A脂肪酶以及胰酶组成。其以20mg/kg的剂量向组I的猪施用。制剂2由IOmg枯草杆菌蛋白酶和300mg皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶以及胰酶组成。其以40mg/kg的剂量向组2的猪施用。制剂3由IOmg枯草杆菌蛋白酶和300mg白地霉(Geotrichum candidum)脂肪酶以及胰酶组成。其以40mg/kg的剂量向组3的猪施用。给予8天制剂，每天一次。每2个小时取血液样本持续2天，在血液样本中测量结果(甘油三酯水平)。研究的结果表明对照猪产生丰富的甘油三酯，而在其它三个条件中的猪产生相对较少的甘油三酯(见图2)。第二研究进行8天之后，利用这个时间作为对照动物，从上述各条件取一只猪(从组I取一只猪、从组2取一只猪和从组3取一只猪)。每批剩余的两只猪接受如上述的那些相同的酶制剂。然后指出，没有任何猪，包括对照猪，产生很多甘油三酯。由此可以得出结论，8天前给予的酶具有延迟作用在血液中仍有活性，以 及在8天前接受酶的对照动物中脂蛋白降低。


本发明涉及一种组合物，其包括至少一种蛋白水解酶(比如枯草杆菌蛋白酶)以及至少一种脂肪分解酶的组合，有利地通过在肠内降解2-单酰甘油，用于防止甘油三酯的合成。本发明还具有一个主题是这种组合物用作药物、化妆品剂、医疗器械、膳食组合物、膳食补充剂或营养食品，尤其用于防止或治疗肥胖、动脉粥样硬化、2型糖尿病或用于预防或减少超重。