专利名称：双t-dna植物表达载体在菊花转基因育种中的应用的制作方法菊花是世界上最重要的观赏花卉之一，也是我国历史悠久的传统名花，在花卉生产中占有重要位置。菊花是一种短日照植物，对光周期具有一定的依赖性，满足菊花周年生产，获得花期提前或延迟的新品种以适应国内外市场的需求对提高菊花生产技术水平、降低成本、抢占国内外市场具有十分重要的意义。多年来，虽然传统育种方法在菊花花期改良上取得了巨大成就，但都受到物种自身基因及杂交亲和性的限制。转基因育种可以打破植物物种间的生殖隔离障碍，提高育种研究的精确性，缩短育种时间，并定向地改变植物的性状，为观赏植物育种提供了一条新的途径。LFY基因是一种花分生组织特性基因，它最早是从野生型拟南芥中克隆出来的，前人的研究证明它有促进植物开花的作用，因此将其导入菊花中有可能在不进行人工光周期处理条件下实现周年生产，大大降低生产成本。然而，目前转基因技术还存在一些限制因素，转基因技术普遍使用选择标记来筛选转基因植株，它们大多是一些编码抗生素抗性或除草剂抗性的基因，一旦获得转基因植株这些选择标记便失去意义。并且还存在一些潜在的不利因素，主要表现在以下方面1)标记基因的编码产物可能有毒或对人类产生过敏反应。2)这些抗生素抗性基因可能水平转移进入人类肠道微生物或上皮细胞，使抗生素类药物失去作用。3)这些基因可能通过转基因植物与其近缘野草自然杂交而垂直转移进入野草中，使杂草具有抗除草剂的作用，有可能破坏生态平衡。4)如果还想导入其他基因便不能重复使用相同的选择标记，因此不利于多次重复转化。因此，去除选择标记可以减少人们对转基因植物食品安全性和环境安全性的忧虑，允许相同的选择标记转化同一植株，还可避免重复的启动子、中止信号序列等引起的基因沉默或基因重排现象，有利于多种性状的组合。另外，去除选择标记还避免了对该标记基因进行复杂的风险性评价。对于观赏植物而言，培育无选择标记的转基因观赏植物，可最大限度地发挥转基因技术在观赏植物育种中的优势，将更多、更新奇实用的外源基因导入植物细胞中，从而培育出综合品质更高的新品种。
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供双T-DNA植物表达载体在菊花转基因育种中的应用。本发明中，所述的应用是将目标基因和选择标记基因分别构建到两个T-DNA结构3域内，再将所述的两个T-DNA结构域整合到同一植物表达载体中，转化菊花，转基因菊花自交分离后获得无选择标记基因的转基因株系。其中，所述的目标基因为LFY基因。在一个具体的实施方案中，将花期调控基因LFY和选择标记基因hpt构建到两个T-DNA结构域内，再将所述的两个T-DNA结构域整合到同一植物表达载体中，转化菊花，转基因菊花自交分离后获得花期提前且无选择标记基因的转基因株系。其中，所述的菊花优选为地被菊。本发明通过将分别携带LFY和hpt基因的双T-DNA植物表达载体整合进菊花基因组，对自交分离后代进行鉴定，获得使花期适当提前且不含有选择标记基因的品系。图1所示为双T-DNA表达载体的构建过程。图2所示为双T-DNA表达载体的T-DNA结构示意图。图3所示为含LFY基因重组载体酶切鉴定。M =DNA markerDL15000 ；1为BamHI酶切；2为RiilI酶切；3为未酶切的质粒。图4表达载体转化农杆菌后的PCR鉴定结果。M:DNA markerDL15000 ；1，4为阴性对照；2，3为LFY基因扩增产物；5，6为hpt基因扩增产物。图5所示为部分Ttl代共转化植株的Southern杂交分析。P为质粒阳性对照；N未转化植株阴性对照；A. hpt探针；B. LFY探针；1，2，3，6共转化植株。图6所示为部分T2代植株的Southern杂交分析。P为质粒阳性对照，N为未转化植株阴性对照，A. hpt探针，B. LFY探针。图7所示为T2代植株表型性状。


本发明涉及双T-DNA植物表达载体在菊花转基因育种中的应用。本发明通过将分别携带LFY和hpt基因的双T-DNA植物表达载体整合进菊花基因组，自交分离后代进行鉴定，获得使花期适当提前且不含有选择标记基因的品系。