促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法[0002]乳糖酶,又被称为β -半乳糖苷酶(拉丁文名称:β-Galactosidase),主要用于乳品工业，可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的葡萄糖和半乳糖；使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。但由于种种原因，大部分人的体内缺少上述乳糖酶，造成很多人患有乳糖不耐症，即人们在饮用牛奶后常会引起对牛奶中的主要碳水化合物一乳糖的消化不良，出现腹涨、肠鸣、急性腹痛甚至腹泻等症状，在中国，根据科研人员的研究结果，成年人饮用牛奶后乳糖吸收不良的发生率高达86.7%，不耐受指数为0.9。而乳糖不耐症的会导致胃肠失调，造成有价值的蛋白质和矿物质损失，甚至影响到婴幼儿的智力发育，故欧洲不少国家常将乳糖酶加入牛奶，供婴儿饮用。[0003]目前国内乳糖酶的产业化生产还存在着很大的问题，乳糖酶并未得到广泛应用，其主要原因是:乳糖酶的单位产量较低，市场销售的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，其提取纯化工艺复杂，成本高；酶的作用温度低，耐热性差，生产过程中很容易染杂菌，适用范围窄。
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用毛霉菌株进行胞外产酶的乳糖酶的制备和纯化方法，该方法包括以下步骤:[0005](I)将活化后的毛霉菌(拉丁文名称=Mucor)接种至固态培养基内培养；[0006](2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；[0007](3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。
[0008]步骤(I)中所述的活化后的毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10~15%。
[0009]步骤(I)中固态培养基包括:
[0010](I)麸皮、黄豆粉或玉米粉中的一种、两种或三种；
[0011](2)麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种；
[0012](3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一种；
[0013](4) MnSO4, KH2PO4, NaH2PO4 或 CaCl2 中的一种；
[0014](5)水。
[0015]更优选的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4, NaH2PO4和水，其中麸皮与水的重量比为1: 1.0~2.0，乳糖添加量为0.05~0.lg/mL，蛋白胨添加量为0.04~0.08g/mL，KH2PO4加量为固态培养基总重量的0.05~0.15%，NaH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.10~0.2%。[0016]上述固态培养基选用已经经过2-3次发酵培养后的固态培养基时，胞外产酶的效果更好。
[0017]步骤(I)中的培养条件是:培养温度为30-50°C，培养时间为60-80h，培养过程中每24-36h翻曲一次。
[0018]步骤(2)中的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种。
[0019]步骤(3)中的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法,层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。
[0020]本发明的优点与积极效果在于:
[0021]本发明以毛霉菌为出发菌株，在固态培养基内进行培养，通过单因素和正交试验确定了最佳的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水、培养后得到的粗酶液经无机絮凝剂硫酸铝处理后，再经过硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化制得乳糖酶成品，该成品经聚丙烯凝胶酰胺电泳检验后，其最终比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率为44.38%，提纯倍数为35.82，乳糖酶的作用PH为4.5-5.5，在30-60°C有较高的耐受性，在4°C冷藏条件下具有良好的稳定性，同现有技术中的胞内产酶相比较，其生产工艺简单、原料成本低、适合规模化生产，制得的乳糖酶耐热性高、稳定性好、安全稳定无污染，作用pH更适宜人体的体内生物环境。

[0022]下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0023]一种促进毛霉产乳糖酶的制备纯化方法包括以下步骤:
[0024](I)将活化后的毛霉 菌株接种至固态培养基内培养；
[0025]1.用接种环直接取冻存的亮色毛霉菌株DZ251，在LB培养基平板表面划线，于25-32°C培养 36-42 小时。
[0026]2.挑取一个单菌落，转到3-5ml LB培养基中，于25-32°C培养36-42小时。
[0027]3.将培养液全部转到100ml LB培养基中培养36-42小时，到0D600 = 0.2-
0.4。
[0028]步骤(I)中的活化后的毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10-15%。
[0029]步骤(I)中的固态培养基包括:
[0030]①麸皮、黄豆粉或玉米粉中的任意一种；
[0031 ] ②麦芽糖、蔗糖或乳糖中的任意一种；
[0032]③牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一种；
[0033]④MnS04、KH2PO4, NaH2PO4 或 CaCl2 中的任意一种；
[0034]⑤水。
[0035]经过单因素和正交试验确定了更优选的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、ΚΗ2Ρ04、NaH2PO4和水，其中麸皮与水的重量比为1: 1.0-2.0，乳糖添加量为0.05-0.lg/mL，蛋白胨添加量为0.04-0.08g/mL, KH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.05-0.15%，NaH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.10-0.2%。
[0036]上述固态培养基选用已经经过2-3次发酵培养后的固态培养基时，胞外产酶的效果更好，可提高40~55%的乳糖酶产量。
[0037]步骤(I)中的培养条件是:培养温度为30~50°C，培养时间为60~80h，培养过程中每24~36h翻曲一次，可提高乳糖酶的产量，通过适当翻曲可以使物料接种和温度保持均匀，有利于原料的利用，同时翻曲也可以延迟孢子出现的时间，使菌丝分泌更多的酶类。
[0038](2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；
[0039]步骤(2)中的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种，其不仅絮凝效果好，而且酶的回收率也高。
[0040]絮凝率的测定方法是:
[0041]取IOOmL乳糖酶粗酶液置于500mL烧杯中，室温和自然pH条件下，加入硫酸铝，快速混匀Imin, 2~3min后再慢速混匀Imin,静置60min,空白不添加絮凝剂。取上层液稀释一定倍数，在620nm处以蒸馏水为参比测定吸光度OD值。絮凝率(FR)计算如下:
[0042]