专利名称：微生物发酵生产纤溶酶的方法纤溶酶(plasmin，EC 3. 4. 21. 7)是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是纤溶系统中的一个重要组份。纤溶酶主要通过降解纤维蛋白和纤维蛋白原，水解多种凝血因子(II. V. VII. VIII. X. XI)，使纤溶酶原转变为纤溶酶，水解补体等途径降解纤维蛋白(余望生等，临床内科杂志，1994)。纤溶酶作为生物酶制剂已经广泛应用于医疗和保健等行业中，但目前使用的纤溶酶主要是从动植物中分离提取，虽然国内外微生物发酵生产纤溶酶的研究很多，但是有关微生物发酵纤溶酶研究处于起步阶段，主要是菌种选育、产酶条件优化、酶学性质以及相关基因的克隆与表达等基础性工作(王敏等，药学学报，1998 ;龚勇等，微生物学报，2001 ;刘晨光，青岛海洋大学学报，2001 ;张少平等，华南理工大学学报，2010)。关于微生物发酵生产纤溶酶的产业化、规模化及应用还未见报道。微生物发酵生产纤溶酶与从动植物中分离提取相比有很大的优势，从动植物中提取纤溶酶代价昂贵，需要进行严格脱毒，工艺复杂，原料来源有限，浪费大；而微生物发酵工艺简单，可大规模生产，所需原料来源广泛，在常温常压的发酵方式下，生产成本低，微生物代谢旺盛，可以提高原料利用率，获得的酶稳定性好，产出率高，临床风险小，在节能方面有相当大的优势；这将有助于微生物纤溶酶的推广和应用(章海锋等，食品工程 技术，2008 ;孙月娥等，中国酿造，2010 ;璩竹玲等，中国海洋药物杂志，2003)。利用微生物发酵生产的纤溶酶可以开发功能性食品和新型药物用于溶解动脉血栓、治疗进展性脑梗死、不稳定型心绞痛、心脑血管血栓栓塞等疾病(王高学等，四川大学学报，2009 ;方璟等，长江大学学报，2010 ;赵连浩等，中国水电医学，2010)，避免了传统方法大剂量用药引发血管出血、溶栓后血管再闭塞、药物过敏等缺点，随着现代生物工程技术的发展，临床溶栓将越来越关注微生物发酵生产纤溶酶。因此，微生物发酵生产的纤溶酶的应用将对传统的临床溶栓领域产生深远的影响，具有广阔的开发潜力和应用前景。
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产纤溶酶的方法，该发明主要是微生物经过产物定向驯化后，在24 30°C液体发酵生产纤溶酶的方法，这种生产方法获得的微生物发酵纤溶酶活性可以达到150U/mL。如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制齐U。该方法生产的微生物发酵纤溶酶制剂成本低，专一性强，稳定性好，临床风险小，可以从根本上避免了利用动植物提取的高成本、原料的限制、严格脱毒等缺点。本发明所述的一种微生物发酵生产纤溶酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生纤溶酶的微生物进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(2)按常规方法将产物定向驯化后的纤溶酶产生菌在24 30°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在24 30°C培养60 114h时，即微生物发酵生产纤溶酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，即为粗酶液； (5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。纤溶酶产生菌株(例如，CGMCC编号1. 769或I. 892)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产纤溶酶，定向驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在零下80°C条件下可以长期保藏。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖10. 0g，纤维蛋白20. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值7. 0 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. 0 12. Og,纤维蛋白15. 0 25. Og,酵母粉3. 0 6. 0g,NaCl 4. 0 6. Og,琼脂粉20. Og,蒸懼水I. 0L,pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基葡萄糖5. 0 15. Og,大豆蛋白胨6. 0 12. 0g,K2HPO4 I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 5g, CaCl2 0. I 0. 5g, MgSO4 0. 2 0. 8g，pH 值自然，自来水 I. 0L, 121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖15.0 25. 0g，豆浆0. 01 0.03L，酵母粉I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 0g, K2HPO4 I. 5 6. 5g, MgSO4 7H20 0. 2 0. 8g, CaCl2 0. 01 0. 05g, pH值自然，自来水I. 0L, 121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生纤溶酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的纤溶酶产生菌在24 30°C逐级扩大培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积的5% 7%接种量接入50L的发酵产酶培养基中，在26 28°C培养78 96h时，即微生物发酵生产纤溶酶结束；(5)将(4)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，即为粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖10. 0g，纤维蛋白20. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值7. 0 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种定向驯化培养基葡萄糖8. 0 12. Og,纤维蛋白15. 0 25. Og,酵母粉3. 0 6. 0g,NaCl 4. 0 6. Og,琼脂粉20. Og,蒸懼水I. 0L,pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30mino③液体种子培养基葡萄糖5. 0 15. Og,大豆蛋白胨6. 0 12. 0g,K2HPO4 I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 5g, CaCl2 0. I 0. 5g, MgSO4 0. 2 0. 8g，pH 值自然，自来水 I. 0L,121°C高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖15.0 25. 0g，豆浆0. 01 0.03L，酵母粉I. 0 6. 0g, KH2PO4 0. 5 2. 0g, K2HPO4 I. 5 6. 5g, MgSO4 7H20 0. 2 0. 8g, CaCl2 0. 01 0. 05g, pH值自然，自来水I. 0L, 121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生纤溶酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经过产物定向驯化4 6次，使其在24 30°C环境条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的纤溶酶产生菌在24 30°C逐级扩大培养36 60h而后按5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积的7% 9%接种量接入100L的发酵产酶培养基中，在28 30°C培养60 78h时，即微生物发酵生产纤溶酶结束；(5)将(4)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，即为粗酶液； (6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产纤溶酶的方法是将产生纤溶酶的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在24～30℃环境条件下生长良好；按常规方法将产物定向驯化后的纤溶酶产生菌在24～30℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在24～30℃培养60～114h时，即微生物发酵生产纤溶酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。