专利名称：人nlk基因相关的用途及其相关药物的制作方法Nemo样激酶(Nemo-like kinase, NLK)定位于细胞核，是一种属于脯氨酸介导的蛋白激酶超家族中保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，最初认为与果蝇的眼细胞的极化及脊椎动物多种发育过程有关(Choi Kff, Benzer S.Rotation of photoreceptor clustersin the developing Drosophila eye requires the Nemo gene.Cell.1994 ；78:125-36.Verheyen EMiMirkovic IiMacLean SJ,Langmann CiAndrews BCiMacKinnon C.The tissuepolarity gene Nemo carries out multiple roles in patterning during Drosophiladevelopment.Mech Dev.2001 ；101:119-32.)。近年来的研究认为NLK可调节、磷酸化转录因子，并通过多种信号途径参与细胞的凋亡过程(BiOtt BK，Pinsky BA, Erikson RL.Nlkis a murine protein kinase related to Erk/MAP kinases and localized in thenucleus.Proc Natl Acad Sci USA.1998 ；95:963-8.Mirkovic IiCharish KiGorski SM，McKnight K, Verheyen EM.Drosophila Nemo is an essential gene involved in theregulation of programmed cell death.Mech Dev.2002 ;119:9-20.)。Wnt信号传导通路包括:细胞外因子(Wnt)、跨膜受体(Frizzled，Fz)、胞质蛋白(Dsh, β-catenin/APC/Axin复合体等)及核内转录因子(TCF/LEF)，与多种肿瘤的发生发展密切相关(Bienz M，Clevers H.Linking colorectal cancer to Wnt signaling.Cell 2000;103:311-20.)。NLK 是 Wnt/β-catenin 信号通路的负调节因子，可使 TCF/LEF磷酸化，抑制β-catenin/TCF复合体的转录活性。c_myb原癌基因表达物c_Myb蛋白作为转录因子可调控下游多种基因转录，影响造血干细胞的增殖与凋亡。fct-1通过转化生长因子β激活性激酶TAKl诱导NLK直接结合并磷酸化c-Myb蛋白多个位点，后续发生遍在蛋白化及蛋白酶依赖的降解，可能造成细胞周期Gl期的阻滞，然而对Myb家族另一成员a-Myb的调控则主 要表现为磷酸化并抑制其与DNA结合区结合而发挥作用(Kane1-1shii C， Ninomiya-Tsuji J， Tanikawa J， Nomura T， Ishitani T， Kishida S，Kokura K，Kurahashi T，Ichikawa-1wata E，Kim Y，Matsumoto K，Ishii S.Wnt-1 signalinduces phosphorylation and degradation of c-Myb protein via TAKl， HIPK2， andNLK.Genes Dev.2004 ;18:816-29.)。另外，研究发现，TAKl-NLK通路可磷酸化具有影响细胞凋亡、应激、DNA损伤/修复、肿瘤发生的转录因子F0X01，并促使F0X01从胞核至胞质的移位，而抑制 F0X01 的转录功能(Kim S，Kim Y，Lee J，Chung J.Regulation of F0X01by TAKl-Nemo-1ike kinase pathway.J Biol Chem.2010 ;285:8122-9.)。进一步研究发现，NLK还可通过磷酸化转录共激活因子CBP/P300的C-末端区域而影响转录因子如NF-κ B、AP-U Smad等的转录活性的方式参与细胞凋亡过程(Yasuda J，Yokoo H，YamadaT，Kitabayashi I，Sekiya T，Ichikawa H.Nemo-like kinase suppresses a wide rangeof transcription factors，including nuclear factor-kappaB.Cancer Sc1.2004 ；95:52-7.Shi Y，Ye K，Wu H，Sun Y，Shi H，Huo K.Human SMAD4 is phosphorylated at Thr9and Serl38 by interacting with NLK.Mol Cell Biochem.2010 ;333:293-8.)。关于NLK在肿瘤中的研究已有在结直肠癌、前列腺癌和肝癌中的报道。NLK被认为是结肠癌Wnt/β -catenin信号通路的抑癌基因。野生型的NLK在结直肠癌中被诱导表达，通过磷酸化TCF/LEF抑制细胞生长，促进p53非依赖的细胞凋亡，但不影响细胞周期(Yasuda J,Tsuchiya A,Yamada T,Sakamoto M,Sekiya T,Hirohashi S.Nemo-like kinaseinduces apoptosis in DLD-1 human colon cancer cells.Biochem Biophys Res Commun2003 ；308:227-33.)。在前列腺癌中，NKL负调节雄性激素受体信号转导途径。NLK过表达可显著诱导雄性激素受体阳性表达的前列腺癌细胞发生细胞凋亡。进一步的研究发现，NLK能够通过与雄激素受体形成复合物的方式抑制雄激素受体对靶基因的转录活性，且在转录水平抑制雄激素受体mRNA的表达(Emami KH, Brown LG, Pitts TE, Sun X, VessellaRL, Corey E.Nemo-like kinase induces apoptosis and inhibits androgen receptorsignaling in prostate cancer cells.Prostate.2009 ;69:1481-92.)。而在人肝癌细胞系中，敲除NLK的表达可以抑制细胞生长，同时发现，Gl-S期细胞增加，细胞周期相关蛋白cyclin D1、⑶K2的表达也明显降低,说明NLK在肝癌形成中可能具有通过作用cyclinDl、CDK2 而发挥促有丝分裂的作用(Jung KH, Kim JK, Noh JH, Eun Jff, Bae HJ, Xie HJ,Ahn YM,Park WS,Lee JY, Nam Sff.Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibitstumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin Dl and CDK2 in humanhepatocellular carcinoma.J Cell Biochem.2010 ;110:687-96.)。综上，NLK在不同肿瘤的发生发展中可能发挥不同的生物学功能。RNA干扰(RNA interference, RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA (dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉 默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23nucleotide intervals.Cell 2000 ; 101:25-33.)。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard, Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005；579:5996-6007.)。为了深入研究NLK在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取肺癌、乳腺癌和前列腺癌细胞模型，以RNAi为手段研究NLK在肺癌、乳腺癌和前列腺癌发生和发展中的作用。
本发明的目的在于公开与人NLK(Nemo-like kinase)基因相关的治疗方法及药物。本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了 NLK基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了 NLK基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。较佳的，所述NLK基因来源于人。NLK基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容:其一，将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指:将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平。所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将NLK基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如可NLK基因为作用对象筛选获得的小分子干扰RNA，将之用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将NLK基因作为作用对象。所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与NLK基因的表达相关的任一种肿瘤，例如选自:肺癌、乳腺癌和前列腺癌。所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制NLK蛋白的表达或活性的分子。所述肿瘤治疗药物能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖、生长、增殖、分化和/或存活。 所述肿瘤治疗药物包括:核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或肽。所述核酸包括:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有NLK基因的启动子序列或NLK基因的信息序列。进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(SiRNA)。所述小干扰RNA包含正义链和反义链，所述正义链含有与NLK基因中的靶序列基本相同的核苷酸序列，且所述正义链和反义链共同形成RNA 二聚体。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人NLK基因的表达。所述shRNA可经载体表达，如将可转录该的shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后表达。所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低NLK基因的转录或翻译，或者足够降低NLK蛋白的表达或活性的剂量。以使NLK基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子包含:I)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；2)或者shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；或者所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与NLK基因中15_27个连续的核苷酸基本相同，而所述第二链与第一链基本互补。较佳的，所述第一链与NLK基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述第一链与NLK基因中19、20或者21个连续的核苷酸基本相同。进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA。所述shRNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段与NLK基因中15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述反义RNA片段与正义RNA片段基本互补，且所述正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔。所述shRNA经酶切后可成为小干扰RNA进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NLK基因的表达的作用。较佳的，所述正义RNA片段与NLK基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述正义RNA片段与NLK基因中19、20或者21个连续的核苷酸基本相同。所述shRNA的茎环片段的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG,CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义RNA片段与NLK基因中的靶序列基本相同。所述NLK基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默NLK基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRN A片段所对应的NLK基因中的片段。较佳的，所述NLK基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-39中之任一序列。较佳的，所述NLK基因来源于人。如本发明的实施例列举的，所述shRNA的序列含有SEQ ID NO:40。GCAGCC⑶CAUUACAGCAAUUCAAGAGAUUGC腳AAUGACGGCUGC本发明第三方面，公开了一种NLK基因干扰慢病毒载体，为含有编码所述shRNA的基因片段的慢病毒载体，能表达所述shRNA。NLK基因干扰慢病毒载体可由将编码所述shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得。所述NLK基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，并进而转录出所述shRNA。所述NLK基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。所述慢病毒载体可选自以下任一:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP,pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.l-CMV-Neo、pLK0.l_Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP, pLK0.1-puro-CMV-TagYFP, pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635、pLK0.l-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 和 Lenti6.2/N-Lumio/V5_GW/lacZ。所述分离的寡核苷酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的双链RNA或shRNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明第四方面，公开了一种NLK基因干扰慢病毒，为将能够在肿瘤细胞中经转录成为所述shRNA的核苷酸片段克隆入慢病毒载体后，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生特异性沉默NLK基因的所述小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。所述NLK基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物中含有所述的能够降低NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或NLK基因干扰慢病毒。所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，可将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。所述肿瘤可选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。进一步的，采用该方法的对象为人。本发明第六方面，公开了一种分离的降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子的祀标寡核苷酸片段，所述寡核苷酸序列含有选自SEQ ID NO 1-39之任一的序列。本发明第七方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的NLK基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括:存在于容器中的所述分离的寡核苷酸分子或所述的NLK基因干扰慢病毒。本发明设计了针对人NLK基因的39个RNAi靶点序列，构建相应的NLK RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO 20的RNAi载体pGCSIL_GFP_siNLK能够显著下调NLK基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-siNLK能够靶向地将针对NLK基因的RNAi序列高效导入人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞，降低NLK基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖。因此慢病毒介导的NLK基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。本发明提供的可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或者NLK基因干扰慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NLK基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义。图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。图2表示Lv-siNLK慢病毒侵染人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞5天后，NLK mRNA的表达水平显著降低。图3表示Lv-siNLK慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制。图4表示Lv-siNLK慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，引起细胞增殖抑制。图5表示Lv-siNLK慢病毒侵染人前列腺癌PC_3细胞5天后，引起细胞增殖抑制。图6使用NLK抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果A为乳腺癌，b、C、d为肺癌图7浸染Lv-siNLK慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力检测结果a瘤体体积b瘤体大小



本发明公开了NLK基因的用途及其相关药物。本发明公开了NLK基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子、含有该分离的寡核苷酸分子的细胞及NLK基因干扰慢病毒，并公开了他们的用途。本发明提供的可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或者NLK基因干扰慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NLK基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。