专利名称：大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2及其应用的制作方法大豆是重要的经济作物，因此提高和优化大豆品质成为人们关注的热点。我国是世界上最缺水的国家之一，干旱是我国农业生产主要自然灾害，且盐碱地和次生盐碱化耕 地的面积逐年増加，这些不利的环境条件严重制约了我国的农作物产量。为了适应这些不利的环境，植物内部发展一系列的防卫措施，也需要非生物胁迫应答基因參与。目前已经鉴定了许多盐和干旱应答基因并验证了他们在非生物胁迫中的功能，但关于很多非生物胁迫相关的基因的生物学功能仍然是未知的。植物转录因子研究是功能基因组研究的ー个重要方面。虽然转录因子在基因组中所占比例很少，但在调控植物的生长发育、响应外界环境胁迫中发挥重要作用。NAC转录因子是近十年来新发现的植物特有的转录调控因子。1997年Aida等首先报道了 NAC结构域，发现在矮牵牛NAM基因、拟南芥A TA F1/2和CUC2基因编码蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC。第一个NAC转录因子是由Souer等于1996年从矮牵牛中克隆得到的，随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中相继发现，目前在拟南芥中共发现了 105个NAC成员，而大豆中则发现了 226个。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。植物的生存环境复杂多变，经常遭受干旱、高盐、低温和病虫害等逆境胁迫，影响植物的生长发育，甚至会造成植物死亡，严重影响农业生产和生态环境。NAC转录因子受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达，參与植物的胁迫应答。然而，还未见大豆NAC膜结合转录因子功能的报道。
本发明的目的是提供ー种大豆圣豆9号NAC转录因子基因_GmST2及其应用。本发明的技术方案是从圣豆9号中分离得到NAC转录因子基因-GmST2，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，然后将该基因转到原植株大豆中得到抗盐/耐旱性提闻的转基因植株。本发明所述的大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。本发明还提供了ー种含上述的大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2的植物表达载体PK2GW7: :GmST2，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。本发明还提供了ー种含上述的大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2的植物表达载体PB2GW7: :GmST2，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。本发明所述圣豆9号NAC转录因子基因GmST2在植株中表达GmST2基因和提高抗盐/耐旱性的应用。。其中所述植株是大豆或拟南芥；进ー步的，所述拟南芥是Col-O野生型，大豆品种是鲁豆11。具体的，本发明所述圣豆9号NAC转录因子基因GmST2在拟南芥或大豆植株中表达GmST2的应用。本发明首先在圣豆9号植株中克隆到了 NAC转录因子基因GmST2 ;利过gateway系统将GmST2基因进行BP反应连接到pD0NR221 (见图I)，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5 α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmST2连接到表达载体pK2GW7 (见图2)和pB2GW7(见图3)上，并在大肠杆菌DH5a中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。将转化农杆菌菌株转入拟南芥和大 中，从而验证表达的GmST2的功能。 本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了圣豆9号NAC转录因子基因GmST2并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的提高抗盐/耐旱性的能力。通过大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法将该基因转入大豆中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱性提闻。本发明所述的基因可广泛用于培育抗盐/耐旱的植物品种。图I为入门载体pD0NR221图谱。图2为植物表达载体pK2GW7图谱。图3为植物表达载体pB2GW7图谱。图4为圣豆9号NAC转录因子基因GmST2的cDNA电泳图，其中M为Marker，泳道1、2为基因的cDNA。图5为转GmST2基因的拟南芥纯系筛选。图6为圣豆9号NAC转录因子基因GmST2在转基因拟南芥中RealTime-PCR表达分析。图7为转基因的拟南芥中抗盐性的分析。图8为转基因的拟南芥中耐旱性的分析。图9转GmST2基因的大豆再生植株。图10为转基因圣豆9号NAC转录因子基因GmST2鲁豆IlPCR检测图，其中泳道M为Marker，泳道阳性对照为阳性质粒对照；泳道阴性对照为阴性植株对照；泳道4、7、8均为转GmST2基因阳性植株。图11为转基因圣豆9号NAC转录因子基因GmST2鲁豆11 Southern-Blot分析图，其中泳道M为Marker，泳道+为阳性质粒对照；泳道-为阴性植株对照；泳道1、2、3均为转GmST2基因阳性植株。图12为转基因的大豆中抗盐性的分析。
实施例I、GmST2的克隆I. I圣豆9号总RNA的提取(I)将圣豆9号植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于_80°C超低温冰箱保存备用)；(2)等液氮挥发后，立即将100_200mg植物粉末转入到I. 5ml离心管中，然后迅速的加入Iml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min ；(3) 4°C，12，OOOrpm,离心lOmin，将O. 9ml上清液转移到新的I. 5ml离心管中，再加入O. 2ml氯仿剧烈振荡混勻15sec,室温放置2_5min ；(4) 4°C，12，OOOrpm,离心lOmin，将O. 4ml上清液转移到新的I. 5ml离心管中，再加入O. 4mI异丙醇,上下翻转15次混勻溶液,室温放置15mim ；
(5)4°C, 12，OOOrpm,离心lOmin,弃上清，用Iml 75%的こ醇洗漆沉淀两次,4°C,
8,OOOrpm,离心 5min ；(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2_5min，加入40 μ I RNase-Free水，在60°C中充分溶解RNA IOmin ；(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A26(l/A28(l达到I. 7-2. O为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。I. 2 RNA的反转录(I)向离心管中依次加入下列物质(40 μ I反应体系):
总 RNA3 pg
oligo-dT (0.05μ§/μ1)2μ1
dNTP (0.01μ§/μ1)2μ1
RNase-Free 水至 27μ1(2)轻轻混勻后，65°C变性5min,立即插到冰上,冰浴至少Imin ；(3)向离心管中依次加入下列物质
5 xbufFer 8μ1 20mM DTT 4μ1 _MMLV _ Ιμ (4)轻轻混匀后，42°C恒温水浴lh，65°C变性lOmin，_20°C保存备用。1.3GmST2 基因克隆GmST20X-F:5’ -AAAAAGCAGGCTCGATGAAGGGAGAATTAGAGTTGCC-3’GmST20X-R:5’ -AGAAAGCTGGGTTTCACATCTTCTGTAGGTACATGAACA-3’(I)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第一步扩增的反应体系如下(50 μ I 体系)


本发明公开了一种大豆圣豆9号NAC转录因子基因——GmST2及所述基因GmST2的植物表达载体。本发明还公开了所述基因GmST2在拟南芥和大豆植株中提高其抗盐/耐旱性的应用。实验证明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱能力得到了很大程度的提高，为通过基因工程手段提高作物抗盐/耐旱性提供了理论依据和实践基础。可广泛用于培育抗盐/耐旱的植物品种。