专利名称：微藻中血凝素-神经氨酸酶蛋白的生产的制作方法通过微生物发酵生产蛋白相对于现有的系统，例如植物和动物细胞培养具有一些优势。例如，基于微生物发酵的方法可以提供(i)高浓度蛋白的快速生产；(ii)使用无菌、充分受控的生产条件(例如良好生产规范(GMP)的条件)的能力使用简单、化学上确定成分的生长培养基以允许更简单的发酵和更少杂质的能力；(iv)人或动物病原体污染的规避；和(V)易于回收蛋白(例如通过从发酵培养基中分离)。此外，发酵设施通常比细胞培养设施建设的成本更低。微藻,例如破囊壶菌(thraustochytrids),能够以标准的发酵设备,非常短的培养周期(例如，1-5天)，低廉的确定成分培养基和最低限度的纯化(如果有的话)进行培养。此外，某些微藻，例如裂殖壶菌属(Schizochytrium),其生物质及自其衍生的脂质具有已经证明的用于食品应用的安全历史。例如，来自此类微生物的富含DHA的甘油三酯油已获得美国食品和药物管理局的GRAS (—般认为安全)状态。微藻已被证明能够表达重组蛋白。例如，美国专利第7，001，772号公开了第一个适于转化破囊壶菌，包括裂殖壶菌属成员的重组构建体。此出版物公开了乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸合酶启动子和终止子区、α-微管蛋白启动子、来自聚酮合酶(PKS)系统的启动子、和脂肪酸去饱和酶启动子的裂殖壶菌属核酸和氨基酸序列等。美国申请公开号2006/0275904和2006/0286650随后公开了肌动蛋白、延伸因子I a (ef I α )和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动 子和终止子的裂殖壶菌序列。病毒疫苗通常从与为了用它们进行防治的疾病对应的病毒培养物的灭活或减毒制备物制备。通常，病毒是从与病毒在野生环境可能感染的细胞类型相同或相似的细胞类型培养而来。这种细胞培养价格昂贵而且往往难以形成规模。为了解决此问题，已经尝试在转基因宿主中表达病毒蛋白抗原，这可以使培养成本更低并且更适于形成规模。然而，病毒膜蛋白，例如血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的大量产生是非常困难的，而且在异源系统中全部或部分地表达病毒包膜蛋白的尝试常常仅能获得有限的成功。因此，对于能够规模化并能够产生病毒HN抗原的新的异源表达系统，例如本发明的系统，具有需求。发明概述本发明涉及一种生产血凝素-神经氨酸酶(HN)多肽的方法，包括在培养基中培养重组微藻宿主细胞以产生异源HN多肽，其中所述重组微藻宿主细胞含有包含编码异源HN多肽的多核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，HN多肽被分泌。在一些实施方案中，该方法进一步包括从培养基回收HN多肽。在一些实施方案中，所述HN多肽与SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:11是至少90%相同的。在一些实施方案中，编码HN多肽的多核苷酸序列进一步包含膜结构域。本发明涉及一种生产包含异源HN多肽的组合物的方法，该方法包括(a)在微藻宿主细胞中表达异源HN多肽，并(b)在足以产生异源HN多肽的条件下培养所述微藻宿主细胞，其中所述组合物作为包含所述异源HN多肽的培养上清产生。在一些实施方案中，该方法进一步包括从组合物中去除培养上清和在液体载体中重悬所述异源HN多肽。在一些实施方案中，上述任意一种方法的宿主细胞是网粘菌门(Labyrinthulomycota)宿主细胞。在一些实施方案中，上述任意一种方法的宿主细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属宿主细胞。本发明涉及一种重组微藻细胞，其含有包含编码异源HN蛋白的多核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，HN蛋白与SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 11是至少90%相同的。在一些实施方案中，编码HN蛋白的多核苷酸序列进一步包含膜结构域。在一些实施方案中，微藻细胞是网粘菌门宿主细胞。在一些实施方案中，微藻细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属宿主细胞。附图简述图1显示了编码新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，该序列经过优化以在裂殖壶菌属菌种ATCC 20888中表达。图2显不了裂殖壶菌属的密码子选择表。图3 显示了 pCL0081[pEPCT(+)-caliNDV_HN]的质粒图谱，也称为 pCL0081。图4显示了转基因裂殖壶菌属CL0081_23( “23”)进行的HN蛋白的分泌。分离低速上清和不溶级分的 离心流程如图4A所示。从低速上清回收的重组HN蛋白(如箭头所示)显示于考马斯染色的凝胶(“考马斯”)和抗-NDV免疫印迹(“IB :抗-NDV”)中，如图4B所示，并且从不溶级分回收的如图4C所示。共纯化的肌动蛋白条带用星号表示。图5显示了回收的重组HN蛋白的肽序列分析，这是通过涵盖蛋白序列(SEQ IDNO:2)68%的共32条多肽确定的。胰蛋白酶位点用下划线表示。图6A和图6B显示了示例裂殖壶菌属中HN蛋白糖基化的考马斯染色凝胶(“考马斯”)和抗-NDV免疫印迹(“IB:抗-NDV”)。“-Ctrl”指免疫印迹的阴性对照，其是转基因裂殖壶菌属AB0018。“23”指转基因裂殖壶菌属CL0081-23。“EndoH”和“PNGase F”指转基因裂殖壶菌属CL0081-23的不溶级分使用各个酶的酶处理。“NT”指不用酶但在与EndoH和PGNase F处理相同条件下温育的转基因裂殖壶菌属CL0081-23。图7显示了通过总离子流映射(total ion mapping)确定的天然裂殖壶菌分泌的蛋白的N-聚糖结构。图8显示了 NS1-总离子流映射获得的聚糖种类。图9显示了来自转基因裂殖壶菌属CL0081_23( “23”)上清的HN的血凝素活性。“[蛋白质]”指蛋白浓度，随样品稀释度增加而从左至右降低。指缺少HN的阴性对照。“ + ”指流感血凝素阳性对照。“HAU”指基于从左至右的样品倍数稀释的血凝素活性单位。“2”指第一孔中2倍稀释的样品；从左至右的随后的孔代表在前一孔之上的加倍稀释，从而使从左至右从第一孔到最后的孔的倍数稀释是2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048和 4096。图10显示了基于使用SignalP算法预测的天然裂殖壶菌属的信号锚序列。参见，例如，Bendsten 等，J，Mol. Biol. 340:783-795 (2004) ; Nielsen，H.和 Krogh，A. Proc.1nt.Conf.1ntell. Syst. Mol. Biol. 6:122-130 (1998) ;Nielsen, H.等，Protein Engineering12:3-9(1999) ;Emanuelssonj 0.等，Nature Protocols 2:953-971 (2007)。发明详述本发明涉及在微藻宿主细胞中异源血凝素-神经氨酸酶(HN)多肽的生产。本发明还涉及包含异源HN多肽的微藻宿主细胞，产自所述微藻宿主细胞的HN多肽，以及组合物及其用途。微藻宿主细胞微藻，又称微小藻类(miciOscopic algae)，经常发现于淡水和海洋系统。微藻是单细胞的但也可以生长成链和组。单个细胞的大小从几微米到几百微米。因为细胞能够生长在含水悬液中，它们能有效地获得营养和进入液体环境。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是不等鞭毛体(heterokont)或原生藻菌(stramenopile)。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是网粘菌门(Labyrinthulomycota)成员。在一些实施方案中，网粘菌门宿主细胞是破囊壶菌目(Thraustochytriales)或网粘菌目(Labyrinthulales)成员。根据本发明，术语“破囊壶菌(thraustochytrid) ”是指破囊壶菌目(Thraustochytriales)的任何成员，包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)，而术语“网粘菌(Iabyrinthuli d) ”是指网粘菌目(Labyrinthulales)的任何成员，包括网粘菌科(Labyrinthulaceae)。网粘菌科的成员从前曾被认为是破囊壶菌目的成员，但是在最近此类生物体的分类学归类的修订版中，网粘菌科现在被认为是网粘菌目的成员。网粘菌目和破囊壶菌目均被认为是网粘菌门的成员。分类学理论现在通常将这两个群的微生物与原生藻菌世系中的藻或藻样原生生物放在一起。破囊壶菌和网粘菌当前的分类学地位可以归纳如下界藻菌界(Stramenopila)(管毛生物界(Chromista))门网粘菌门(Labyrinthulomycota)(不等毛门(Heterokonta))纲网粘菌纲(Labyrinthulomycetes) (Labyrinthulae)目网粘菌目(Labyrinthulales)科网粘菌科(Labyrinthulaceae)目破囊壶菌目(Thraustochytriales)科破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)对于本发明的目的而言，作为破囊壶菌描述的菌株包括如下生物体目破囊壶菌目；科破囊壶菌科；属破囊壶菌属(种菌种，arudimentale, aureum，benthicola，globosum， kinnei， motivum， multirudimentale, pachydermum， proliferum， roseum，striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种菌种，amoeboidea，kerguelensis，minuta，profunda， radiata， sailens， sarkariana， schizochytrops, visurgensis， yorkensis)、裂殖壶菌属(种菌种，aggregatum，limnaceum，mangrovei, minutum，octosporum)，Japonochytrium 属(种菌种，marinum)、Aplanochytrium 属(种菌种，haliotidis，kerguelensis，profunda, stocchinoi)、Althornia 属(种菌种，crouchii)、或 Elina 属(种菌种，marisalba, sinorifica)。出于本发明的目的,吾肯氏壶菌属中描述的物种将被看作是破囊壶菌属的成员 ° Aurantiochytrium、Oblongichytrium> Botryochytrium、Parietichytrium、和Sicyoidochytrium是本发明网粘菌门包括的额外的属。本发明作为网粘菌描述的菌株包括如下生物体目网粘菌目，科网粘菌科，属网粘菌属(种菌种，algeriensis, coenocystis, chattonii, macrocystis, macrocystisat I an tica, macrocystis macrocystis, marina, minuta, roscoffensis, valkanovii,vitellina, vitellina pacifica, vitellina vitellina, zopfii), Labyrinthuloides 属(种菌种，haliotidis, yorkensis), Labyrinthomyxa 属(种菌种，marina), Diolophrys属(种菌种，archeri)，Pyrrhosorus 属(种菌种，marinus)， Sorodiplophrys 属(种菌种，stercorea)或 Chlamydomyxa 属(种菌种，labyrinthuloides, montana)(尽管关于Pyrrhosorus> Sorodiplophrys或Chlamydomyxa的精确分类学地位目前尚没有达成一致)。网粘菌门的微藻细胞包括但不限于保藏菌株PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、以SAM2179保藏的微生物(保藏者命名为“吾肯氏壶菌SAM2179”)、任何破囊壶菌属菌种(包括前述的吾肯氏壶菌属菌种，例如U. visurgensis, U. amoeboida,U. sarkariana, U. profunda, U radiata, U. minuta 和吾肯氏壶菌菌种 BP-5601),并且包括Thraustochytrium s triatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum ;和任何Japonochytrium属菌种。破囊壶菌目菌株包括但不限于破囊壶菌属菌种(23B) (ATCC20891) ；Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473) ；Thraustochytriumaureum(Goldstein)(ATCC 34304) ；Thraustochytrium roseum (Goldstein)(ATCC 28210)；和Japonochytrium属菌种(LI) (ATCC 28207)。裂殖壶菌属包括但不限于Schizochytriumaggregatum, Schizochytrium Iimacinum,裂殖壶菌属菌种(S31) (ATCC 20888),裂殖壶菌属菌种(S8)(ATCC 20889)，裂殖壶菌属菌种(LC-RM) (ATCC 18915)，裂殖壶菌属菌种(SR21)，保藏菌株 ATCC 28209,和保藏的 Schizochytrium Iimacinum 菌株 IFO 32693。在一些实施方案中，细胞是裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。裂殖壶菌属能够通过连续二等分裂和通过形成孢子囊两种方式复制，最终释放游动孢子。但是，破囊壶菌属仅通过形成孢子囊复制，然后释放游动孢子。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是破囊壶菌属的。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属细胞。在一些实施方案中，微藻宿主细胞是网粘菌。在一些实施方案中，微藻宿主细胞含有包含编码选择标记的核酸序列的重组载体。在一些实施方案中，选择标记允许选择经转化的微生物。在一些实施方案中，选择标记是营养缺陷标记、显性选择标记(如，例如，降解抗生素活性的酶)，或另一种参与转化选择的蛋白。根据本发明，术语“转化”是指能够将外源核酸分子(即，重组核酸分子)插入微生物细胞的任何方法。在微生物体系中，术语“转化”用来描述由于微生物获得外源核酸所致的一种遗传性改变而且基本上与术语“转染”同义。用于将外源核酸分子引入网粘菌门宿主细胞的合适的转化技术，包括但不限于粒子轰击、电穿孔、显微注射，脂转染、吸附、感染和原生质体融合。在一些实施方案中，将外源核酸分子包括重组载体，引入处于静止阶段的微生物细胞。在本发明的一些实施方案中，微藻宿主细胞经遗传修饰引入或删除参与与转运和/或合成碳水化合物相关的生物合成途径的基因，包括那些参与糖基化的基因。例如，可以通过删除内源性糖基化基因和/或插入人或动物的糖基化基因来修饰宿主细胞以使糖基化模式能够更接近地类似于人的模式。在酵母中的糖基化修饰示于，例如，美国专利第 7，029，872 号和美国申请公开号 2004/0171826, 2004/0230042, 2006/0257399,2006/0029604和2006/0040353。在一些实施方案中，微藻宿主细胞包括其中RNA病毒元件用于增加或调节基因表达的细胞。用于微藻宿主细胞的有效培养条件包括但不限于允许蛋白产生和/或重组的有效的培养基、生物反应器、温度、PH和氧条件。有效的培养基指任何通常培养微藻细胞的培养基。这种培养基通常包含具有可同化的碳、氮、和磷源、以及适当的盐、无机物、金属和其他营养物质，如维生素的含水培养基。适合破囊壶菌目微生物的非限制性培养条件描述于，例如，美国专利第5，340，742号。本发明的细胞可以培养于常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定皿和培养皿中。可以在适于重组细胞的温度、PH和氧含量下进行培养。破囊壶菌宿主细胞的非限制性发酵条件如下表I所示。表1:容器培养基本发明涉及重组微藻细胞及其用于生产异源血凝素-神经氨酸酶(HN)多肽的用途，以及组合物及其用途。