专利名称：一种高产α-酮戊二酸酵母工程菌及其应用的制作方法α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，简称a-KG)是一种重要的有机酸，在食品、 医药、化工和化妆品等行业都有广泛应用。作为三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一， α-酮戊二酸参与氨基酸、蛋白质、维生素合成以及能量代谢等重要过程，在微生物细胞碳氮代谢调控中起着重要的作用。目前，工业上生产α-酮戊二酸主要采用化学合成的方法，但是高污染、使用有毒和有害化学试剂等缺点限制了它的发展空间，而微生物发酵法正以高产量、高生产强度、环境友好等优点受到越来越多的关注。国内外关于微生物发酵法生产α-酮戊二酸的研究主要集中于对发酵条件的优化和控制，但是简单的发酵优化并不能很好地解决副产物积累的问题，代谢工程作为一种理性的菌种改造方法能够更加有效地实现目标产物的高产。虽然， 目前采用代谢工程手段来强化α -酮戊二酸积累的研究鲜有报道，但是鉴于丙酮酸羧化途径在丙酮酸代谢和TCA循环中的重要作用，强化丙酮酸羧化途径应该是一条促进碳代谢流进入TCA循环的有效策略。
本发明要解决的技术问题是提供一种高产α -酮戊二酸酵母工程菌，其通过过量表达丙酮酸羧化酶基因，强化胞内丙酮酸代谢途径中的重要支路-丙酮酸羧化途径的代谢通量，实现α-酮戊二酸的过量积累。以下是本发明技术方案的详细描述。替换质粒上原有的标记基因赋予重组质粒对潮霉素B的抗性根据NCBI网站上hph基因序列(Genbank :K01193. 1)，采用化学全合成方法， 获得 hph 基因序列并克隆到质粒 p0 (Swennen, D. , M. F. Paul, L. Vernis, J. M. Beckerich, A. Fournier, and C.Gaillardin. 2002. Secretion of active anti—Ras single-chain Fv antibody by the yeasts Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces lactis. Microbiol-Sgm 148 :41-50)中，利用hph基因替换质粒pO上原有的URA3标记基因，赋予重组质粒PO (hph)对潮霉素B的抗性，便于后续重组菌的筛选。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明质粒改造成功。目的基因RoPYC2扩增与表达质粒的构建根据NCBI网站上Genbank HM130700. 1，采用基因全合成方法获得丙酮酸羧化酶 RoPYC2基因，克隆到pO (hph)，得到表达载体pO (hph) -RoPYC2。重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。过量表达RoPYC2的Y. Iipolytica重组菌的筛选将重组质粒pO (hph)-RoPYC2经AvrII酶切、纯化后,醋酸锂法转化Y. Iipolytica WSH-Z06感受态细胞。将能在YPD+HygB平板上生长的菌落，在YPD+HygB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，利用引物RoPYC2-F 和RoPYC2-R进行PCR验证，得到大约3. 5kb的片段，表明RoPYC2基因已成功整合到 Y. Iipolytica WSH-Z06 (保藏编号CCTCC NO :M207143)基因组中。所得重组菌命名为 Y. lipolytica-RoPYC20该菌在以甘油为唯一碳源的培养基上生长时，丙酮酸羧化酶活性为O.87U/mg protein,是出发菌株的10. 2倍。微生物菌株的种子培养与发酵种子培养基(g/L):葡萄糖20g,蛋白胨IOg,磷酸二氢钾Ig,七水硫酸镁O. 5g,琼脂20g(斜面用)，ρΗ5·5，自来水定容至IL0发酵培养基(g/L):甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁I. 2g，氯化钠O. 5g/L,磷酸氢二钾O. Ig,盐酸硫胺O. 2 μ g,碳酸|丐20g (摇瓶时添加),自来水定容至 1L。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121°C，15min。维生素等热敏性材料配制后O. 22 μ m膜过滤除菌，接种前加入。将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于28°C、200rpm条件下培养 20-24h。按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28°C，200rpm条件下培养 144h。细胞干重的测定取一定量的菌悬液置于IOmL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于570nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。甘油、丙酮酸和α -酮戊二酸浓度的测定高效液相色谱(HPLC)仪器=Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件色谱柱AminexΗΡΧ-87Η ion exchange column流动相5mMH2SO4流速0.6mL/min柱温35°C进样量5μ L紫外检测器波长210nm(检测丙酮酸和α -酮戊二酸)示差折光检测器检测甘油样品制备500 μ L发酵液在10，OOOrpm下离心lOmin，取上清液移入I. 5mL离心管中测甘油、丙酮酸和α-酮戊二酸的含量。取100 μ L上清液移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0. 45 μ m滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。本发明的有益效果本发明的特点是以一株能以甘油为唯一碳源，过量积累 α -酮戊二酸的Y. Iipolytica WSH-Z06为出发菌株，利用代谢工程手段构建了一株能过量表达RoPYC2基因的重组菌Y. Iipolytica WSH_Z06-RoPYC2。通过强化丙酮酸羧化途径，加大碳代谢流进入TCA循环的通量，促进a -酮戊二酸的过量积累，同时减少副产物-丙酮酸的生成。在发酵144h后，a-酮戊二酸产量达到47. 2g/L，是出发菌株的I. 3倍。这一调节微生物细胞中TCA循环的回补途径，促进代谢流流向TCA循环中间代谢产物，实现代谢产物过量积累的策略，为工业生物技术特别是采用代谢工程手段改造菌株来提高目的产物的生成提供了新的技术思路。
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葡萄糖20g, Tryptone 20g, Yeast extract IOg,固体培养基添加 20g 琼脂。YPD+HygB 抗性平板(g/L)YPD+200mg潮霉素，固体培养基添加20g琼脂。实施例3甘油为唯一碳源时重组菌与对照菌发酵特性的比较以甘油为唯一碳源，发酵144h后，重组菌和对照菌相比(I)对照菌中α-酮戊二酸产量为36. 3g/L，重组菌中α -酮戊二酸产量可达47. 2g/L，是对照菌的I. 3倍；(2) 对照菌中丙酮酸含量为21. 2g/L，而重组菌中丙酮酸含量仅为10. 4g/L，丙酮酸积累减少了 51%，过量表达RoPYC2基因有效地将碳代谢流从丙酮酸导向中α _酮戊二酸的生成，在提高α-酮戊二酸产量的同时减少了丙酮酸的积累。


本发明公开了一种通过强化丙酮酸羧化途径促进α-酮戊二酸积累的方法，将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)中编码丙酮酸羧化酶的基因RoPYC2过量表达于发酵法生产α-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，获得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重组菌，其丙酮酸羧化酶活性提高了10.2倍(达到0.87U/mg protein)；以甘油为唯一碳源，发酵144h后，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，是出发菌株的1.3倍；丙酮酸产量降低到10.4g/L，是出发菌株的49.0％。本发明通过调控三羧酸循环的回补途径，成功实现了碳代谢流从丙酮酸节点流向α-酮戊二酸节点，在提高α-酮戊二酸产量的同时，减少了副产物-丙酮酸的生成。为今后利用代谢工程手段改造菌株促进目标产物过量积累提供了一定的借鉴意义。