专利名称：MaGCS蛋白在香蕉果实成熟中的应用的制作方法香蕉是一种典型的呼吸跃变型果实，对香蕉果实成熟机理的分子生物学研究将有助于发展建立在基因表达调控基础上的采后保鲜新技术，完善对果实成熟调控研究的深入，这些研究在香蕉产业发展中具有重要的理论和实践意义。乙烯是香蕉采后成熟的核心，与大多数的跃变型果实不同，香蕉果实在呼吸跃变的过程中乙烯的释放速率的升高和降低是剧烈的，因此认为香蕉中乙烯生物合成的调节机制可能与其它跃变型果实不同。氨基环丙烷羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC),氧化酶基因(1-aminocyclopropane-l-carboxylicacid oxidase, ACO) (Huang et al. ,1997)是在成熟度II开始表达并持续到随后的成熟度，该ACO基因可以被外源乙烯所诱导。Liu等对香蕉成熟过程中的ACS、AC0基因表达及与成熟之间的关系进行了较为系统的研究(Liu et al.，1985)。他们的研究结果表明，在自然成熟果实的跃变启动期，其中一个ACS (MA-ACSl)的表达增强，伴随着乙烯的迅速增长，而随后就迅速降低。而在跃变启动时期，ACO活性被大量激活，随后也迅速降低。在跃起变前可以检测到ACO基因的表达 (MA-ACOl)，而且随后的成熟过程中仍然维持着高水平的表达，尽管此时AGO的活性已经降低了。这种结果的差异是由于ACO活性所需的各种因子含量降低。他们的结果说明，香蕉成熟过程中的乙烯生物合成在跃变上升之前是受MA-ACSl转录水平调节的。柠檬酸合成酶(citratesynthase, CS, EC2. 3. 3. 1)催化草酰乙酸(oxaloacetic acid, OA)合成柠檬酸(citrate acid，CA)，是三羧酸循环和乙醛酸循环的关键酶。CS属于调控酶，它的活性受ATP、NADH、琥珀酰_CoA、CA、长链脂肪酸所抑制，又能受 AMP 禾口 OA 的促进(Caggiano et al. , 1979 ；Mitchell et al. , 1995 ；Tabrett et al.， 2000)。根据作用位置的不同，CS在植物中大致分为两类即线粒体中的柠檬酸合酶 (mitochondrial citrate synthase,MCS)禾口非线粒体中的柠檬酸合酶(nonmitochondrialcitrate synthase, non-MCS)-包括乙醛酸循环体中的柠檬酸合酶(Glyoxysomalcitrate synthase, GCS)，两者在提纯方法、酶动力学、稳定性以及与线粒体内膜的结合率上均存在差异(Kispal et al.，1991)。khnarrenberger (2002)对已知序列的柠檬酸合酶进行系统发育树的进化分析发现，植物中MGCS与酵母、猪、大鼠等真核生物较为接近，是同一来源的，而乙醛酸循环体中的柠檬酸合酶则与原核生物的进化距离较近，属同一来源。随着CS研究的深入，关于其在植物生理中作用的报道越来越多。Grzemski (2005) 发现MCS与植物根瘤固氮有关，酶活的降低会显著降低根瘤固氮酶的活性； Landschuetze (1995)发现MCS与花药或花粉发育相关，且与光合作用相关，在光合作用的组织中表达较高，但在非光合作用的组织中表达量普遍偏低；在油菜、水稻、胡萝卜等植物中GCS与耐铝、耐盐、耐磷等胁迫相关(Larsen et al.，1998 ；Koyama et al.，2000)；此外，GCS还影响能影响种子的萌发(Pracharoenwattana et al.，2005)。CS催化的产物CA在许多果实中存在，影响果实的酸度和口感，所以果实中CS酶活与CA含量的关系成为果实品质研究者们感兴趣的热点。柠檬酸合酶基因已从南瓜(Cucurbita maxima)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥 (Arabidopsis thaliana)等植物中被克隆，但对这些基因的更进一步的研究未见报道。我们(Jin. et al. 2009)利用cDNA微阵列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成启动时 (采后IOd)基因的差异表达，发现一个与其他植物同源的柠檬酸合酶基因明显上调表达。 推测该基因可能和香蕉过实采后成熟过程中乙烯生物合成相关，可能调控或影响香蕉果实采后成熟过程。因此，GCS基因的开发利用，将有助于更加深入了解香蕉果实采后成熟机理， 建立更加安全、廉价、有效的果实采后保鲜新方法。
本发明的目的是提供一种建立在基因表达调控基础上的采后保鲜新技术。本发明提供的保鲜新技术为将采后的香蕉果实用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡2h， 获得具有如下1)-2)中至少一种特征的香蕉果实1)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡2h，促进香蕉果实MaGCS的表达；2)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡池，促进香蕉果实成熟；将采后的香蕉果实用(w/v)柠檬酸溶液浸泡lh，获得具有如下3)-4)中至少一种特征的香蕉果实3)用1 % (w/v)的柠檬酸溶液浸泡lh，抑制香蕉果实MaGCS的表达；4)用(w/v)的柠檬酸溶液浸泡lh，抑制香蕉果实成熟；所述MaGCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述MaGCS蛋白的编码基因的核苷酸序列为如下1)或2):1)序列表中的序列1;2)序列表中序列1自5’末端第1-1737位核苷酸。本发明提供的技术方案为荧光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯诱导成熟和 I-MCP (1-methyl cyclopropene)抑制成熟的条件下，MaGCS在香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。通过体外诱导、抑制MaGCS的表达，研究果实成熟特性。1.荧光定量研究MaGCS与果实采后成熟的关系采后香蕉果实分设乙烯处理、I-MCP处理和正常成熟3组，提取3组中不同成熟阶段的果实总RNA反转录cDNA，荧光定量研究3种不同处理条件下MaGCS表达与成熟的关系。 2. MaGCS诱导剂草酰乙酸(OA)和抑制剂柠檬酸(CA)处理果实，研究体外调控基因表达对果实成熟的影响将采后的香蕉果实用IOOmM的草酰乙酸溶液中浸泡池和1 % (w/v)柠檬酸溶液中浸泡Ih分别处理，观察处理果实成熟变化，乙烯生物合成关键酶基因ACC氧化酶基因ACOl 表达分析，测定果实成熟相关的生理指标，分析通过采后体外调控MaGCS的表达对果实成熟的影响。[结果分析]1. MaGCS在香蕉果实采后被乙烯诱导表达，并可调节成熟乙烯生物合成=MaGCS在香蕉果实正常成熟时基因表达量的变化与内源乙烯的释放相一致，而外源乙烯处理，MaGCS 被诱导表达，表达量明显增加且提前。I-MCP处理后MaGCS的表达被明显抑制(图1)。以上结果显示，MaGCS与果实采后成熟过程中乙烯生物合成密切相关，促进香蕉果实采后成熟中的乙烯合成可以显著促进MaGCS的表达，抑制香蕉果实成熟中的乙烯合成可以显著抑制 MaGCS的表达。因此，推测该基因与香蕉果实采后成熟相关，对该基因的调控将达到调控香蕉采后成熟的目的。2. MaGCS诱导剂和抑制剂显著促进和抑制该基因的表达，进而影响果实的成熟过程和品质研究结果证明，IOOmM的草酰乙酸(OA)溶液中浸泡池和(w/v)柠檬酸(CA) 溶液中浸泡Ih分别能诱导和抑制香蕉果实成熟，通过生理学分析显示这种影响改变了果实颜色、硬度、芳香物质、淀粉含量等。证实对MaGCS表达的调控可以调节果实采后成熟(图 2、图幻。进一步研究显示，MaGCS调控果实成熟是通过调控MaACOl基因的表达来实现的， 而MaACOl是香蕉果实采后成熟过程中启动MaACSl基因表达和成熟乙烯生物合成的关键酶基因。因此，我们推测香蕉MaGCS是香蕉果实采后成熟过程中成熟乙烯生物合成的上游调节者，它通过调控MaACOl的表达控制果实的成熟过程和品质形成(图4)。本发明的实验证明，本发明将香蕉果实(Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian)分别用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡浊和(w/v)柠檬酸溶液浸泡lh，通过影响MaGCS表达进而调控乙烯生物合成关键酶基因ACC氧化酶MaACOl基因的表达水平， 最终调控香蕉果实的成熟品质，从而建立了通过调控基因表达而控制果实成熟的保鲜新技术。图1是I-MCP处理和乙烯处理条件下，利用荧光定量PCR分析MaGCS在香蕉采后不同时期的表达图2是OA (上)和CA (下)处理对香蕉果实采后成熟的影响图3是OA和CA处理后荧光定量PCR分析MaGCS的表达
图4是OA和CA处理后荧光定量PCR分析MaACOl的表达

3.方法(1)荧光定量研究MaGCS与果实采后成熟的关系提取乙烯处理、I-MCP处理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果实总RNA反转录 cDNA用作荧光定量PCR的模板。用NCBI的保守结构域分析软件分析MaGCS、Ma-act in 12个基因的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier5设计弓I物。MaGCS 上游引物5，-GAGTTCTTTCCTGTTCTGTTTG-3，MaGCS 下游引物5，-CTATGCTTATTGTTCCACGC-3，Ma-act in 1 上游引物5 ‘ -CGAGGCTCAATCAAAGA-3 ‘Ma-act in 1 下游引物5 ‘ -ACCAGCAAGGTCCAAAC-3 ‘在Mratagene的Mx3000P仪器上进行荧光定量PCR。在0. 2mL的PCR反应管中加入 SYBR Premix Ex Taq (2 X) (TAKARA) 12. 5 μ L, Rox reference Dye II (50 Χ) (TAKARA) 0. 5 μ L、5 μ M的一对引物各0. 75 μ L，cDNA样品1 μ L，然后用水补足至25 μ L。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因Ma-actinl，各个基因的扩增都做三个重复。按照94°C预变性3min，94°C变性7s，55°C退火15s，72°C延伸20s，共40个循环的反应程序进行扩增(四个基因的反应程序是一致的)，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。 反应结束后做94°C _55°C的融解曲线分析。荧光定量PCR结果证明，MaGCS表达受乙烯诱导、I-MCP抑制，在香蕉果实采后成熟过程中起着调控乙烯生物合成、果实成熟的作用。(2)不同浓度的OA和CA分别在不同处理时间条件下处理香蕉果实将采收的果实切割成单蕉指，用0. 次氯酸钠进行表面消毒lOmin，同时把果实顶部的干花抹掉，放置一个晚上晾干，随机选取果实分为13个处理，每个处理选取9个果实，每3个装进一个保鲜盒中，每个处理3个重复。正常成熟的果实置于22°C恒温条件下成熟；柠檬酸处理的果实于1^^5% (w/v)柠檬酸溶液中分别浸泡10min、30min、lh，晾干后22°C恒温条件下成熟；草酰乙酸处理的果实于40mM、100mM草酰乙酸溶液中分别浸泡 30min，lh，2h，晾干后在22°C恒温条件下成熟。以22°C恒温条件下未经任何处理的香蕉果实为对照(CK)。柠檬酸溶液处理的香蕉果实于处理后第15天观察不同处理对香蕉果实采后成熟时期的影响，草酰乙酸处理的香蕉果实于处理后第10天观察不同处理对香蕉果实采后成熟时期的影响，结果显示香蕉果实于(w/v)柠檬酸溶液中浸泡Ih明显能延长达到每个成熟度的时间，延缓成熟；香蕉果实于IOOmM的草酰乙酸溶液中浸泡池处理明显能缩短达到每个成熟度的时间，促进成熟(图2)。


本发明公开了一种MaGCS蛋白在香蕉果实成熟中的应用。本发明提供了一种建立在基因表达调控基础上的采后保鲜新技术，为将采后的香蕉果实用100mM的草酰乙酸溶液浸泡2h，获得具有如下1)-2)中至少一种特征的香蕉果实1)用100mM的草酰乙酸溶液浸泡2h，促进香蕉果实MaGCS的表达；2)用100mM的草酰乙酸溶液浸泡2h，促进香蕉果实成熟；将采后的香蕉果实用1％(w/v)柠檬酸溶液浸泡1h，获得具有如下3)-4)中至少一种特征的香蕉果实3)用1％(w/v)的柠檬酸溶液浸泡1h，抑制香蕉果实MaGCS的表达；4)用1％(w/v)的柠檬酸溶液浸泡1h，抑制香蕉果实成熟；所述MaGCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，MaGCS可被草酰乙酸(OA)和柠檬酸(CA)分别诱导和抑制表达，从而调控采后香蕉果实成熟度的变化。该基因的应用对于建立香蕉采后果实成熟调控新技术和培育优良品种具有重要的理论及实际意义。