专利名称：一种腺病毒载体及其在制备hcv细胞和小鼠模型中的应用的制作方法丙型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一，严重威胁人类健康。目前尚没有有效的HCV预防性疫苗，而HCV模型，尤其是感染性模型的缺乏，也阻碍了 HCV疫苗研发及致病机制研究，从而增加了其防控难度。现有的HCV感染性小鼠模型主要是免疫缺陷型人肝嵌合小鼠，不能用于HCV疫苗评价及致病机(Mercer DF, Schiller DE, Elliott JF, Douglas DN. , Hao C, RinfretA, Addison WR, Fischer KP, Churchill TA, Lakey JR, Tyrrell DL, Kneteman NM. Hepatitis Cvirus replication in mice with chimeric human livers. Nat Med 2001 ；7 :27-933.)。第三代腺病毒载体，又称空壳载体或辅助病毒依赖型腺病毒(HDAd， helper-dependent adenovirus)载体，它去除了腺病毒全部的编码反式作用蛋白的基因， 仅保留了两端的反向末端重复序列以及包装信号，其去除的腺病毒蛋白编码序列的功能由辅助病毒提供。发明内容本发明的一个目的是提供一种重组腺病毒载体。本发明提供的重组腺病毒载体，为将序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒载体HDAd中得到的载体。上述重组腺病毒载体具体为将序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒载体 HDAd的I-Ceu I和Hce I位点间得到的载体。由上述重组腺病毒载体包装得到的腺病毒。上述腺病毒为将上述重组腺病毒载体转染表达Cre重组酶的293细胞，包装得到的腺病毒。上述腺病毒具体按照如下方法制备将上述重组腺病毒载体经Pme I线性化后与辅助病毒AdNG163共转染表达Cre重组酶的293细胞，包装得到腺病毒。
本发明的另一个目的是提供一种转基因细胞，为将上述腺病毒导入宿主细胞中得到的细胞。
上述转基因细胞中，所述宿主细胞为Huh7细胞。
上述的重组腺病毒载体或上述的腺病毒在制备筛选抗HCV药物的细胞模型中的应用。
上述的重组腺病毒载体或上述的腺病毒在制备用于筛选抗HCV药物小鼠模型中的应用。
上述的重组腺病毒载体或上述的腺病毒或上述的转基因细胞在筛选抗HCV药物中的应用。
本发明的实验证明，本发明提供了一种重组HCV加SJFHl全长基因组的第三代腺病毒载体，其制备得到的腺病毒可以用来制备HCV全基因组细胞模型或小鼠模型，得到的模型可以用来进行抗HCV药物筛选，从而用于HCV疫苗评价及致病机制研究。


图1为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞GFP及HCV core和NS3免疫荧光检测结果。
图 2 为 HDAd-HCV 病毒感染 Huh7 细胞 HCV core 和 NS3 Western blot 检测结果。
图 3 为 HDAd-HCV 病毒感染 Huh7 细胞 HCV RNA Northern blot 检测结果。
图4为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞及上清中HCV RNA实时定量检测结果。
图5为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞培养上清再感染Huh7细胞HCV core和NS3 免疫荧光检测结果。
图6为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞培养上清HCV感染性被人CD81单克隆抗体阻断实验。
图7为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞培养上清HCV感染性被HCV E2单克隆抗体阻断实验。
图8为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞透射电镜及上清针对HCV E2的免疫电镜结^ ο
图9为HDAd-HCV病毒感染Huh7细胞模型用于IFN- α抗HCV作用评价。
图 10 为 HDAd-HCV 病毒感染 C57BL/6 小鼠肝组织 HCV core 和 NS3Western blot 检测结果。
图11为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝组织HCV RNA Northern blot检测结^ ο
图12为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠血清HCV RNA实时定量检测结果。
图13为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠血清ALT检测结果。
图14为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝组织HE染色及HCV core免疫组化检测结果。
图15为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型用于miRNA122反义寡核苷酸抗HCV 作用评价。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的实验材料如下所示
ρJFHU pSCll等质粒及辅助病毒AdNG163、Huh7细胞系、！feph细胞系、稳定转染重组酶Cre的293细胞系均为本室保存，胎牛血清(FCQ、H印es、双抗、谷氨酰胺等均购自Gibco公司，α-干扰素购自北京杰华生物工程研究院。DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自北京全式金生物公司，T4DNA Ligase购自Promega公司；RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司；脂质体转染试剂盒、Trizol试剂为Invitrogen产品。E. coliDH5 α competent cells 禾口 DNA standard Marker 购自北京全式金生物公司；QIApr印 Spin Miniprep Kit 和 Gel Extraction Mini Kit 购自 Qiagen 公司；M_MLV(code :D2640A) ,dNTP Mixture(code :D4030RA)>Random 6mer(code :D3801A) R RNase Inhibitor(code :D2310A) 均购自Takara公司。RealMaster Mix (SYBR Green)购自天根生物公司(目录号:FP202)， 蛋白酶抑制剂Aprotinin、P印statin A、Leup印tin、PMSF均购自Amresco公司；限制性内切酶购自NEB公司和I^akara公司；引物由上海生工合成，苏木素、伊红购自Sigma公司。ALT 采用 Fuji DRI-CHEM 7000 生化分析仪检测(FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japan)
Anti-HCV core monoclonal antibody 购自 Thermo Scientific (Cat. No. MA1-080), Anti-HCV NS3monoclonal antibody 购自 Virogen (Cat. No. MA1-7369)， Anti-HCV E2monoclonal antibody(sc-65457)及 Anti-human CD81monoclonal antibody (sc-70803)均购自 Santa Cruz 公司，购自 Anti-GAPDH polyclonal antibody (Cat. No. G9545)购自 Sigma 公司；RIPA 裂解液(#C1053)及 SuperECL Plus 超敏发光液(#P1020)均购自普利莱基因技术公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司，P0006)，山羊血清封闭液、DAB显色液、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG以及DyLight^gA标记山羊抗小鼠IgG均购自中杉金桥公司；MEGAscript T7RNA 体外转录试剂盒购自Ambion公司(Cat. No. AM1334)，Amersham HyboncT-N+尼龙膜购自 GEhealthcare (Cat. No. RPN303B), High Pure PCR Product Purification Kit(REF 11732668001)及 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Cat. No. 11585614910)均购自Roche公司，野生型C57BL/6J小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
下述实施例中用的PBS溶液均为Gibco公司，REF10010-023。
实施例1、HDAd-HCV重组腺病毒载体的获得
重组HCV 2a型JFHl基因组的第三代腺病毒载体HDAd-HCV为将序列表中序列1插入腺病毒载体 HDAd (Prolonged Peritoneal Gene Expression Using AHelper-Dependent Adenovirus. Peritoneal Dialysis International, 2009 ；29 :508-516,公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得)的I-Ceu I和Hce I位点间得到的载体。
具体制备如下
1、pMD18T-HCV500-Ribo 构建
以 ρJFHl 质粒(Production of Infectious Hepatitis C Virus in Tissue Culture from ACloned Viral Genome. Nat. Med, 2005 ； 11 (7) :791_796，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得)为模板，使用重叠PCR方法将HDV核酶序列Ribo连在JHll下游，HDV核酶序列以及设计的引物序列如下
HDV Ribo
ggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgaggggaccgtcccctcggt aatggcgaatgggaccca ；
Fl :gtttgcggccgatatctcttcaattgggcggtg ；
Rl :gaggaggctgggaccatgccggccacatgatctgcagagagaccagttacggca ；
F2 :ggccggcatg gtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgagggga ；
R2 :gctctagatgggtcccattcgcc attaccgaggggacggtcccctcggaatgttgccca,
以F1/R1为引物，ρJFHl为模板扩增HCV末端455bp序列及核酶前21bp序列，产物记为Pldf Pl、F2、R2混合进行第2轮PCR，产物记为P2，再以P2为模板，F1/R2为引物进行第3轮PCR扩增，产物记为P3，将P3亚克隆至pMD18T中，)(ba I酶切鉴定方向，选择酶切目的大小为500bp左右的克隆提取质粒送去测序，命名为pMD18T-HCV500-Ribo，以上PCR 条件均为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸30秒，2-4步30 个循环；72°C 10分钟，4°C 5分钟。
2、pjrai_Ribo 构建
pMD18T-HCV500-Ribo 经 Xba I/EcoR V 双酶切回收 500bp 左右片段，连入经 Xba I/EcoRV双酶切的pJFHl，记为pJFHl-Ribo ；利用T7启动子上游EcoR I和下游 Age I 位点，在 T7 启动子下游设计一对引物 F3、R3，F3 :ccgaattcgagctcggtacccgg，R3 caccggttccgcagaccac，分别含有 EcoR I 和 Age I 位点，以 pJFHl-Ribo 为模板进行 PCR,以上PCR条件为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸30秒，2-4步 30个循环；72°C 10分钟，4°C 5分钟。产物经EcoR I/Age I酶切后连入同样经EcoR I和 Age I酶切的pjrai-Ribo，测序鉴定已去除T7启动子序列的pJFHl-Ribo ( Δ T7)。
3、HDAd-HCV 构建
上述得到的pJFHl-Ribo (Δ Τ7)经EcoR I和Hind III双酶切后连入pSCll，得到 pSCl I-JFHl-RibojS I-Ceu I和Hce I双酶切后连入HDAd中，得到重组质粒，经过测序， 该质粒即为将序列表中的序列1插入腺病毒载体HDAd的I-Ceu I和Hce I位点间得到的载体，记作HDAd-HCV。
实施例2、HDAd-HCV重组腺病毒载体在制备细胞模型和小鼠模型中的应用
I、HDAd-HCV重组腺病毒的获得
将由实施例1得到的载体HDAd-HCV和HDAd空载体均经I^me I线性化后与辅助病毒 AdNG163 (Prolonged Peritoneal Gene Expression Using A Helper-Dependent Adenovirus. Peritoneal Dialysis International, 2009 ；29 :508-516,公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得)共转染稳定表达Cre重组酶的293细胞，使重组HDAd-HCV包装并活化，而后不断加入AdNG163辅助病毒，分别经过60mm细胞培养皿、150mm细胞培养皿以及3L细胞培养瓶扩增培养(37°C 60rpm摇瓶培养3天)，收集细胞裂解后进行CsCl密度梯度离心35000rpm离心12小时)，收集肉眼可见光亮条带， 分别得到HDAd-HCV病毒及HDAd空病毒(以下均以HDAdGFP病毒表示)。
蚀斑法测定上述HDAd-HCV病毒及HDAd空病毒的滴度将病毒液按10倍比稀释后加入细胞中，室温放置60分钟，去除培养基，加入5%低熔点琼脂盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动，37°C继续培养4天，用中性红染料染色，因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示，IPFU = 200viral particle,结果为 HDAd-HCV 病毒滴度为 2X 10"νρ/ιΛ，HDAdGFP 病毒滴度为 lX1012vp/mL(vp = viral particle，病毒颗粒数)。
11、HDAd-HCV感染性细胞模型建立及抗HCV药物评价
一、HDAd-HCV感染性细胞模型建立
利用以上高滴度HDAd-HCV 病毒(按 ΙΟΟνρ/cell)感染 Huh7 细胞(Production ofInfectious Hepatitis C Virus in Tissue Culture from A Cloned Viral Genome. Nat. Med, 2005 ；11 (7) :791_796，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得)，每2 3天进行感染细胞传代，得到HDAd-HCV感染性细胞模型。
采用同样的方法将HDAdGFP病毒(按lOOvp/cell)感染Huh7细胞，得到HDAd空病毒细胞。
二、HDAd-HCV感染性细胞模型的鉴定
1、HDAd-HCV感染性细胞模型中HCV复制及表达检测
分别收集不同时间点由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型的细胞以及细胞培养上清，荧光显微镜下检测HDAd自身带有绿色荧光蛋白GFP基因表达水平，以HDAd自身带有绿色荧光蛋白GFP基因表达水平观察HDAd-HCV感染率。
结果如图1第一列显示，感染后第2、6、11天HDAd-HCV感染性细胞模型的GFP表达逐渐减弱(绿色荧光表示)，说明HDAd-HCV病毒本身不复制。
2、检测细胞模型中HCV核心蛋白core以及NS3表达
1)间接免疫荧光法(二抗为红色荧光标记抗体)
实验操作如下取部分感染后第4天和第20天由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型的细胞，经4%多聚甲醛固定，PBS溶液洗3次，山羊血清封闭液室温(25°C ) 封闭 1 小时，0. 3% Triton X-100 室温(25°C )处理 1 小时，Anti-HCV core monoclonal antibody (红色荧光标记抗体)和Anti-HCV NS3monoclonal antibody (红色荧光标记抗体)使用PBS分别按1 300和稀释1 30，37°C孵育1小时，PBS溶液洗3次，DyLight^gd 标记山羊抗小鼠IgG 二抗使用PBS按1 600稀释，37°C孵育30分钟，PBS溶液洗3次，荧光显微镜下观察结果。以HDAdGFP为对照(为将HDAdGFP病毒(按lOOvp/cell)感染Huh7 细胞，得到HDAd空病毒细胞。)。
间接免疫荧光结果如图1第2列和第3列所示(其中第一行为HDAdGFP，第二、 三行为HDAd-HCV感染性细胞模型的细胞)，其中第2列为Anti-HCV core monoclonal antibody (红色荧光标记抗体)的结果，第3列为Anti-HCV NS3monoclonal antibody的结果，可以看出，感染后第4天和第20天，HCV core及NS3蛋白均表达(红色荧光表示)。
2)Western-blot
方法操作如下取部分HDAd-HCV病毒感染后第36小时和第72小时细胞(由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型)，经RIPA裂解液4°C处理30分钟，IOOOOrpm 4°C离心 10分钟，收集上清液，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司，目录号P0006)定量检测上清液中的蛋白含量，结果如下取部分HDAd-HCV病毒感染后第36小时和第72小时细胞的蛋白含量分别为1. 2mg/ml和1. 0mg/ml ；
然后提取HDAd-HCV病毒感染后第36小时和第72小时细胞的蛋白溶液30 μ g，加入5XSDS上样缓冲液及1/20体积β -巯基乙醇，煮沸lOmin，IOOOOrpm离心5min，上清用于HCV core及NS3蛋白的Wfestern检测HCV core及NS3蛋白检测一抗分别使用Anti-HCV core monoclonal antibody (稀释度 1 1000)禾口Anti—HCV NS3 monoclonal antibody (稀释度 1 50)，GAPDH蛋白一抗使用 Anti-GAPDH polyclonal antibody (稀释度 1 10000)， 二抗分别使用HRP标记山羊抗小鼠IgG (core和NS3 二抗)和HRP标记山羊抗兔IgG (稀释度1 5000) (GAPDH蛋白的二抗)，显影液使用SuperECL Plus超敏发光液。
Western-blot结果如图2所示，其中，HDAdJFHl36为HDAd-HCV病毒感染后第36 小时细胞，HDAdJFHl72为HDAd-HCV病毒感染后第72小时细胞，HDAdGFP为将HDAd空病毒(按lOOvp/cell)感染Huh7细胞得到的对照细胞，PC Huh7为体外转录的Ji7Hl RNA (将 pJFHl经)(bal I线性化后，使用MEGAscript T7 RNA体外转录试剂盒进行体外转录(操作见说明)，得到HCV RNA)转染Huh7细胞；Huh7为正常Huh7细胞；可以看出，由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中感染后第36小时和72小时的细胞，HCV core及NS3蛋白均表达。
3)、Northern blot法检测HDAd-HCV病毒感染细胞中HCV RNA表达
取部分HDAd-HCV病毒感染后第7天、14天、21天细胞(由上述一得到的HDAd-HCV 感染性细胞模型)，使用RNeasy Mini Kit提取总RNA，经Nanodrop 1000分光光度仪测定浓度及纯度，结果为浓度分别为720ng/ul、560ng/ul、630ng/ul ；纯度(Α^0Λ80)分别为 2. 07,2. 00,1. 98 ；将pJFHl经)(bal I线性化后，使用MEGAscript T7RNA体外转录试剂盒进行体外转录(操作见说明)，得到HCV RNA作为阳性对照。
设计 弓I 物 North-Fl :gaggcctcctgggcgccatag, North-Rl taagcctgacggtggtctccgc，以 pJFHl 为模板，扩增与 HCVNS3 互补的约 500bpPCR 产物，使用 Roche 公司 High Pure PCR Product Purification Kit 纯化(操作见说明)，以纯化 PCR 产物为模板，使用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 中 DIG-High Prime进行地高辛(DIG)标记探针制备(操作见说明)。
建立以下RNA样品变性体系2ul 10XMOPS电泳缓冲液+4ul甲醛+IOul甲酰胺 +Iul溴化乙锭(200ug/ml)，补足RNase Free H2O至20ul。将RNA样品在85°C温育10分钟， 冰上迅速冷却10分钟后，加入2ul IOX甲醛凝胶加样缓冲液，将配制好的琼脂糖/甲醛凝胶装入水平电泳槽，加入1XM0PS电泳缓冲液，预电泳10分钟(5V/cm)，加入RNA样品后以 4 5V/cm电压下电泳，直至溴酚蓝移出约8cm左右。然后用DEPC处理水淋洗凝胶，将胶浸入0. 01mol/LNa0H-3mol/LNaCl中20分钟，将RNA通过毛细管转移到带正电荷尼龙膜上。 加入 DIG标记探针 100ng/ml，68°C过夜，依次经 2XSSC(含 0. 1% SDS) ,0. 5XSSC(含 0. 1% SDS),0. IXSSC(含0. SDQ洗膜各2次，每次15分钟(以上操作详见分子克隆第三版)。加入DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 中 IXBlocking buffer 室温封闭 30 分钟，再加入 IXBlocking buffer 稀释(1 10000)的 Anti-DIG-AP， 室温封闭30分钟后洗膜，进行CSPD化学发光检测(详见试剂盒说明书)。
结果如图3所示，HDAdjrai 7为HDAd-HCV病毒感染后第7天细胞(由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型)，HDAdjrai 14为HDAd-HCV病毒感染后第14天细胞(由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型)，HDAdjrai 21为HDAd-HCV病毒感染后第21天细胞(由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型)，HDAdGFP为将HDAd空病毒(按IOOvp/ cell)感染Huh7细胞得到的对照细胞，PC RNA为上述制备的阳性对照；Huh7为正常Huh7 细胞；可以看出，感染后第7天、14天、21天，均能检测到HCV RNA。
3、实时定量PCR检测细胞裂解成分以及细胞培养上清中HCV RNA水平
取HDAd-HCV病毒感染后不同时间点的细胞和上清液(由上述一得到的HDAd-HCV 感染性细胞模型的细胞及上清液)，分别使用Qiagen公司RNeasy Mini Kit和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，其中细胞总RNA取500ng，上清RNA取6ul，按以下体系进行8逆转录反应2ul 5XM-MLV Buffer+0. 5ul dNTP Mix+0. 5ulRandom 6mers+0. 25ul M-MLV 逆转录酶+0.25ul RNase hhibitor+RNA，补足 RNase Free H2O 至 10ul，逆转录反应条件为42°C 60分钟。将pJFHl按0. Ing相当于IO7Copies依次稀释成标准品IO7Copies/ mL、106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL，HCV 实时定量 PCR 引物设计如下 HCV-real-F :cgacactccgccatgaatc, HCV-real-R :ccatggctaggcgctttc,配制以下 PCR 体系9ul SYBR Mix+0. 5ulHCV-real-F (IOuM)+0. 5ul HCV_real-R(10uM)+cDNA，补足 ddH20 至 20ul，实时定量PCR条件为95°C预变性2分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，68°C延伸 30秒，2-4步40个循环。根据标准品Ct值绘制标准曲线(Ct = 40. 58-3. 625Log[HCV拷贝数])，进行HCV RNA定量。
结果如图4所示，可以看出，由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中的细胞的HCV RNA滴度水平由感染后第2天3. 6 X IO8Copies/μ g cellular RNA逐渐降至第洸天8. 6 X IO6Copies/μ g cellular RNA,由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中的细胞上清的HCV RNA水平先逐渐升高至第16天峰值8. 95X 106COpieS/ml，然后逐渐下降至第 26 ^ 1. 9X105copies/ml。
4、HDAd-HCV感染性细胞模型感染Huh7细胞培养上清中HCV感染性检测
将不同时间点收集由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中的培养上清再分别感染正常Huh7细胞和正常HepG2细胞，通过间接免疫荧光法检测再感染细胞中HCV core 及NS3表达(方法同上)。
确定上清是否具有HCV感染性的结果如图5所示，上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型的培养上清再感染正常Huh7细胞间接免疫荧光法检测HCV core及NS3均为阳性 (图5中)，而上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型的培养上清再感染正常Hep。细胞间接免疫荧光法检测HCV core及NS3均为阴性(图5右)，说明感染是上清中产生的HCV造成，而不是HDAd-HCV病毒造成。
将不同时间点收集由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型的培养上清加入系列稀释的抗HCV E2单克隆抗体(Santa Cruz公司，sc-65457) 1、5、10ug/ml)以及抗人CD81 单克隆抗体(Santa Cruz公司，sc-70803，0. 5、5、25ug/ml)，用中和抗体抑制方法(直接加入抗体，37°C孵育1小时后对Huh7细胞中HCV RNA进行实时定量检测，方法同前)检测是否阻断HCV感染。
观察是否阻断HCV感染的结果如图6和图7所示，其中图6为加入抗人⑶81单克隆抗体，图7为加入抗HCV E2单克隆抗体，可以看出，加入抗HCV E2单克隆抗体及抗人 ⑶81单克隆抗体均能阻断上清中HCV感染(图6和7，HCV RNA拷贝数降低)，也说明上清中产生感染性HCV病毒。
5,HDAd-HCV感染性细胞模型感染Huh7细胞及培养上清中HCV病毒透射电镜观察
将不同时间点收集由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中的细胞及培养上清，进行固定及电镜样品制备，电镜观察是否产生HCV病毒颗粒，细胞进行透射电镜观察， 培养上清中依次加入Anti-HCV E2 monoclonal antibody及胶体金(IOnm)标记山羊抗小鼠IgG，进行免疫电镜观察。
结果如图8所示，A为HDAd-HCV感染第8天Huh7细胞透射电镜结果Q4000倍)、B 为A同视野放大(65000倍)、C为HDAd-HCV感染第8天Huh7细胞上清免疫电镜结果(93000倍)、D为C同视野放大(135000倍)，箭头所指为病毒颗粒，可以看出观察到包膜形态病毒颗粒，且病毒大小约60nm，这与文献中关于HCV描述一致。
三、由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中IFN- α抗HCV评价
在由上述一得到的HDAd-HCV感染性细胞模型中的感染后第8天的细胞中加入依次加入不同浓度0，0.04，2.0，10，50 (units/ml)的IFN-α (北京杰华生物，Α20070913)，继续培养7 作为实验组。以Huh7细胞为对照组。
采用Western-blot方法(同前)分析实验组和对照组细胞中HCV NS3表达差异， 结果表明如图9所示，IFN- α能有效抑制HCV在Huh7细胞中的复制。
以上结果表明，HDAd介导的新型HCV全基因组细胞模型，实现HCV长期、高效稳定复制表达、产生感染性HCV病毒，并可初步应用于抗HCV药物评价。
III、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型的建立及其应用
一、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型的建立
实验组和对照组各取8只C57BL/6小鼠，实验组每只小鼠经尾静脉注射约 IXIO1oVP由上述I得到的HDAd-HCV病毒，对照组经尾静脉注射等量由上述I得到的 HDAdGFP病毒，分别得到HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型和对照组模型。
二、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型鉴定
1、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠体内HCV表达及复制检测
将上述一得到的HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型和对照组模型在感染后第 3、7、14天进行肝组织取材，部分用于提取总蛋白及总RNA0使用以下配方的组织蛋白裂解液10mM IM Tris-HCl, 1% (V/V)Triton X-100,1% (V/V)去氧胆酸钠，0.1% (V/V) 10% (g/ml)SDS,0. 4% (V/V)NP-40,150mM NaCl,5mM EDTA，0. 2mM 原钒酸钠，蒸馏水定容。提取前分别在组织蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂Aprotinin、PepstatinA, Leup印tin、PMSF, 使其终浓度分别为 2μ g/ml，0. 7μ g/ml，0. 5μ g/ml，ImM0
组织总蛋白提取的具体方法为取不超过30mg肝组织，加入上述组织蛋白裂解液及4种蛋白酶抑制剂，TlO basic ULTRA-TURRAX分散机5档勻浆40S后，冰浴30min，每5min 振勻1次，13000rpm 4°C离心15min，上清即为总蛋白溶液。总RNA提取的具体方法为取不超过30mg肝组织，加入Qiagen公司RNeasy Mini Kit中RLT溶液600ul及6ul β巯基乙醇，TlObasic ULTRA-TURRAX 分散机 5 档勻浆 40S 后，使用 Qiagen 公司 RNeasy Mini Kit 提取总RNA (操作见说明书)。
Western blot法检测不同时间点肝组织中HCV core及NS3表达情况(方法同上)，结果如图10所示，感染后第3天、7天、14天小鼠肝组织中HCV core及NS3均表达；
Northern blot法检测不同时间点肝组织中HCV RNA表达情况(方法同上)，结果如图11所示，HDAd-HCV病毒感染后第3天、7天、14天小鼠肝组织中HCV RNA均表达；
实时定量PCR检测小鼠血清中HCV RNA水平，结果如图12所示，HDAd-HCV病毒感染后小鼠肝组织中HCV RNA平均水平由第1周1. 2X105copies/ml上升至2X IO5Copies/ ml，而后逐渐下降至第8周2 X 104copies/ml。
2、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠肝组织HE及免疫组化检测
上述一得到的HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型和对照组模型的肝组织用4% 甲醛固定液固定，制作石蜡切片，HE染色分析肝组织病理改变。免疫组化分析肝组织HCVcore表达，操作如下60°C恒温烘箱中烤片1小时，二甲苯脱蜡2次，各20分钟，然后依次经过100 %、95 %、80 %、70 %乙醇，各5分钟，流水冲洗2次，蒸馏水冲洗2次，PBS缓冲液浸洗5 分钟，共3次。3% H2O2室温孵育10分钟，蒸馏水冲洗。抗原修复缓冲液(0.01M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，PH6. 0)98°C微波修复5分钟，自然冷却至室温，PBS缓冲液浸洗5分钟，共3 次，正常山羊血清封闭10分钟，加入一抗Anti-HCV core monoclonal antibody(1 500稀释)，4°C湿盒过夜，PBS缓冲液洗5分钟，共3次，加入二抗HRP标记山羊抗小鼠IgG (1 100 稀释)，37°C孵育30分钟，PBS缓冲液洗5分钟，共3次，DAB显色，苏木素衬染，流水冲洗， 酸酒精分色，流水冲洗，依次经过70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各2分钟，二甲苯透明5分钟，共2次，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。
结果如图14所示，A和C分别为HDAdGFP空病毒感染小鼠肝组织HCV core免疫组化及HE染色结果，B和D分别为HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠第1周肝组织HCV core 免疫组化及HE染色结果；HCV core蛋白在HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠第1周肝组织有表达(图14B)，HE染色结果显示，HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠第1周肝组织中有明显炎性淋巴细胞浸润，伴有细胞凋亡(图14D)。
3、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠血清中ALT水平检测
HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型和对照组模型的血清中ALT水平采用 FujiDRI-CHEM 7000生化分析仪检测(由动物中心生化室仪器自动检测)，结果如图13所示，HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠血清中ALT水平第2周达到最大值199. 4士53. 1IU/L， 然后逐渐下降，而HDAdGFP病毒感染C57BL/6小鼠血清中ALT水平未发生明显变化。
三、HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型的应用
用于抗HCV小分子药物评价已有文献显示(Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science 2010, 327 :198-201.),利用锁核酸(LNA)修饰的microRNA-122拮抗分子能在黑猩猩体内部分程度抑制HCV复制，因此，本实验利用由上述一得到的HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型对LNA-antimiR-122分子抗HCV作用进行评价。
设计LNA-antimiR-122 序列如下5’-ccAttGtcAcamCtcCa_3’ (大写字母为 LNA 修饰，小写字母为未修饰DNA，修饰后的microRNA-122拮抗分子是直接人工合成的)，同时设计错配对照分子mismatch control LNA如下5’ -ccAttGtc^TcaAtcCa-S，(大小写字母含义同上)。
实验组小鼠(HDAdHCV+antimiR-122 通过尾静脉同时注射1 X 1 OicVpHDAd-HCV病毒和 100 μ g LNA-antimiR-122 分子；
对照组小鼠(HDAdHCV+control)同时注射IX IOicVp HDAd-HCV 病毒和 100 μ gmismatch control LNA 分子。
分别于第3天、7天、14天取部分肝组织进行Northern blot法检测HCV RNA表达情况(方法同上)，每隔一周采集小鼠血清实时定量PCR检测小鼠血清中HCV RNA水平。。
结果如图15所示，A为小鼠肝组织HCV RNANorthern blot结果，PC RNA为体外转录的JFH1RNA (将pJFHl经)(bal I线性化后，使用MEGAscript T7RNA体外转录试剂盒进行体外转录(操作见说明)，得到PC RNA) ；NC RNA为正常C57BL/6小鼠肝组织提取的总RNA; HDAdGFP为注射由上述I得到的HDAd空病毒(按lX101(Vp)到小鼠尾静脉得到的对照组模型，可以看出，在HDAd-HCV病毒感染C57BL/6小鼠模型中LNA-antimiR-122分子具有抑制HCV作用
B为小鼠血清HCV RNA实时定量结果；进一步可以看出，在HDAd-HCV病毒感染 C57BL/6小鼠模型中LNA-antimiR-122分子具有抑制HCV作用。
以上结果表明，本发明成功建立HDAd介导的新型HCV全基因组小鼠模型，实现HCV 一定时间内复制表达，可初步应用于抗HCV药物评价及急性感染损伤机制研究。


本发明公开了一种腺病毒载体及其在制备HCV细胞和小鼠模型中的应用。本发明提供了重组腺病毒载体，为将序列表中序列1所示的核苷酸插入腺病毒载体HDAd中得到的载体。本发明的实验证明，本发明提供了一种重组HCV 2a型全长基因组的第三代腺病毒载体，其制备得到的腺病毒可以用来制备HCV全基因组细胞模型或小鼠模型，得到的模型可以用来进行抗HCV药物筛选，从而用于HCV疫苗评价及致病机制研究。