专利名称：一种鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法鸡马立克氏病(Marek，s Disease, MD)是由疱疹病毒科的马立克氏病病毒(MDV) 引起的鸡的一种高度接触性淋巴组织增生性疾病，该病目前还没有有效的治疗方法，给全世界养鸡业带来了巨大损失。鸡马立克氏病是第一个能用疫苗预防的肿瘤性疾病，鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗是目前应用最普遍的防治鸡马立克氏病的有效手段。50年代初，Dulbecco依据噬菌体感染细菌而产生噬斑原理，用培养细胞单层建立了病毒蚀斑技术，该技术能计数细胞培养适应病毒、细胞病变阳性的病毒蚀斑数，是目前人和动物病毒精确定量的常用方法，已成为病毒学研究和活病毒生物制品质量监测的重要方法。目前，鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗的毒价测定是通过蚀斑计数完成的。《中华人民共和国兽药典》(三部，2010年版)(以下简称《中国兽药典》)测定方法为疫苗样品用SPG稀释，取适当稀释度，每个稀释度接种3个已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞瓶，每瓶0. anl，置37°C吸附60分钟，加入含1牛血清的M-199营养液，继续培养M小时，弃去培养液，覆盖含5%牛血清的EMEM或M-199琼脂(糖)培养基，待凝固后，将瓶倒置，继续培养 5^7日，进行蚀斑计数。蚀斑应典型、清晰，形态不规则，边缘不整齐，呈乳白色，与同时设立的参照品蚀斑一致。计数时，计算同一稀释度3瓶细胞的平均蚀斑数，再计算每瓶疫苗所含蚀斑数。《中国兽药典》所载测定方法需要在细胞单层上覆盖琼脂(糖)培养基，不但操作繁琐，且琼脂的毒性作用及覆盖温度等均会影响计数结果。在多篇文献中有报道，应用该方法，同一组样品重复检验的结果差别很大，有的相差广2倍，甚至出现产品保存半年后测得的蚀斑数比生产时还高。测定结果不准确，成品疫苗的抗原实际含量可能会低于标准，免疫鸡机体产生的保护力达不到预期，会直接导致鸡群的免疫失败。而且鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定是一个涉及多环节多因素的操作系统，任何一个环节的误差都会造成最终测定结果差异的扩大；有必要对影响病毒蚀斑计数的各个因素进行优化，并保持一贯性，以减小测定结果批间误差。
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷、提供一种改进的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，它可以提高疫苗毒价测定精度，保证疫苗的质量。本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，包括以下步骤⑴制备鸡胚成纤维细胞悬液使用胰酶连续消化法将9日龄SPF鸡胚制成鸡胚成纤维细胞悬液，备用；⑵细胞培养用细胞生长液将步骤⑴所得鸡胚成纤维细胞悬液稀释使细胞密度为 0.9X106个/ml 1. IXlO6个/ml，并接种于细胞培养板中，每孔加入Iml稀释后的细胞悬液，置CO2培养箱中培养，至长满细胞单层，备用；(3)稀释病毒液采用旋涡混悬器混勻方法，用细胞维持液1X104、5X104倍稀释待测定的病毒液，得到梯度浓度的病毒液；(4)病毒接种及培养弃去步骤⑵细胞培养板中细胞生长液，并按0.2ml/孔加入步骤 ⑶所得稀释病毒液，每个稀释度接5个孔，置CO2培养箱中吸附lh，接毒孔再加入细胞维持液1. 5ml/孔；同时将细胞培养板未接毒孔中加入细胞维持液，1. 5ml/孔，每个稀释度对应1 孔，设置为阴性对照；细胞培养板置(X)2培养箱中培养；(5)蚀斑计数病毒接种后培养4飞天，待病毒蚀斑充分生长时，在倒置显微镜下对细胞培养板中相应的蚀斑进行计数；
(6)毒价计算阴性对照培养孔无蚀斑出现的细胞培养板为有效板，根据有效板的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的病毒液的毒价。上述测定方法，所述细胞生长液配方为体积百分含量909Γ92%的Μ-199营养液， 8°/Γ Ο%新生牛血清，用NaHC03调整pH值为7. 2 . 5。上述测定方法，所述细胞培养板为M孔细胞培养板。 上述测定方法，所述(X)2培养箱中(X)2体积含量为4%飞％，优选体积含量为5% ；培养温度为37°C 38°C，优选培养温度为38°C。上述测定方法，使用旋涡混悬器混勻病毒液，采用转速300rpm，混勻时间l(T20s。上述测定方法，所述细胞维持液配方为体积百分含量979Γ98%的Μ-199营养液， 29Γ3%新生牛血清，调整pH值为7. 2^7. 5。上述测定方法，所述蚀斑判定方法为在显微镜下，视野中可见一个或多个细胞圆缩、堆积成簇的病变区域，病变细胞具有折光性，病变区域边缘不整齐、整体呈菜花样，一个病变区域即为一个蚀斑。上述测定方法，病毒蚀斑计数时机的确定，根据火鸡疱疹病毒在鸡胚成纤维细胞上的生长特性，一般在接毒后第4天计数，如果蚀斑偏小(眼观如针尖大小)，可在接毒后第 5天计数。上述测定方法，待测定病毒液毒价的计算方法毒价以Iml病毒液中所含有的蚀斑形成单位的数目来表示，计算公式为A=BXC/V，其中A 毒价；B 最适稀释倍数各孔蚀斑的算术平均数；C 最适稀释倍数；V 每孔接种病毒液体积。上述测定方法，所述的最适稀释倍数为蚀斑清晰，无融合重叠，蚀斑数在1(Γ30个范围的稀释倍数。本发明的基本原理是鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒感染细胞后，通过形成合胞体从一个细胞核进入另一个细胞核，病毒由最初感染的细胞向周边细胞扩展感染，经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的。此外，在病毒感染细胞72h以后，病毒还会通过细胞膜上的微绒毛释放到细胞外，产生游离病毒而形成第二次感染，经几个增殖周期，到第7天时蚀斑数量会突然增加，但在6天内蚀斑数量比较稳定，不受游离病毒影响。因此鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒毒价通过蚀斑计数来测定，在一定周期内，不必使用琼脂等固体介质盖在细胞上。本发明方法基于鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒的感染模式，不使用琼脂覆盖，且于接毒后4飞天进行蚀斑计数，可以避免接毒后第二次病毒释放造成的影响，能够准确测定出鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗的原始病毒毒价。由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性
(1)本方法使用胰酶连续消化法制备鸡胚成纤维细胞，与传统玻璃珠分散方法相比较， 制备的鸡胚成纤维细胞更易贴壁，细胞活力好，死细胞少，提高鸡胚利用率，降低成本；
⑵使用M孔细胞培养板进行空斑计数，1块M孔细胞培养板测定量等同于12个细胞培养瓶测定量，操作和计数更简便，成本更低；
(3)使用的病毒稀释液能够有效保护火鸡疱疹病毒，减小在疫苗效价测定过程中，由于稀释液不能有效保护病毒所带来的测定误差；
⑷本方法测定周期为5-6天，相比常规方法测定周期7-9天，测定周期大大缩短；
(5)使用旋涡混悬器梯度稀释病毒液，限定转速和混悬时间，既不损伤病毒，又可充分混勻病毒液，与传统移液器吹打混勻方法相比，准确性更强；
(6)本发明省略了覆盖琼脂(糖)培养基步骤，避免了琼脂的毒性作用及覆盖温度对细胞和病毒的影响，操作更简单；且对技术方案的进行多方面优化，使得测定条件均一，可控性强，批间误差小。


图1为蚀斑眼观状态；
图2为显微镜下观察到的2个蚀斑状态。

⑴选用生长良好的9日龄梅里亚SPF鸡胚，严格消毒鸡胚表面，用镊子敲除气室部位的蛋壳，用弯头眼科镊子小心夹住鸡胚并取出放在灭菌的平皿内；
(2)除去鸡胚的眼、脑和内脏，用0.OlM PBS pH7. 2洗液冲洗胚体三次；
(3)按每个胚体IOml的比例加入38°C预热的质量浓度为0.25%的胰酶溶液，在磁力搅拌下进行消化，每次lOmin，每次消化结束后，细胞液经2层纱布过滤到提前加入胰酶溶液总体积m的胎牛血清的容器内；本步骤重复操作3、次；
⑷细胞液进行离心，采用2500rpm lOmin，将上清液体弃去，按照每个胚体IOml的比例加入细胞生长液(体积百分含量90% M-199细胞营养液、10%新生牛血清，？!1值7.2)，用吹打管吹打将细胞混悬起来。(5)细胞液经4层纱布过滤，收集滤液；
(6)计数取0.5ml细胞悬液与4. 5ml的0. OlM PBS pH7. 2液混勻后，取0. 2ml混合液与0. 6ml台盼兰染液混勻后用细胞计数板进行计数；
(7)使用细胞生长液将细胞悬液稀释至0.9X IO6个/ml，混勻后接入M孔细胞培养板中，每孔接入1ml，放入38°C、5% CO2的培养箱中进行培养；
(8)观察细胞鸡胚成纤维细胞生长24h后长成均勻致密的细胞单层。实施例2鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒接入鸡胚成纤维细胞单层
⑴稀释病毒选取1个鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗样品(瑞普(保定)生物药业有限公司产品，市场有售)，使用细胞维持液(体积百分含量98% M-199细胞营养液、洲新生牛血清，PH值7. 4)对其进行IX IO4和5X IO4倍稀释，稀释过程使用旋涡混悬器对病毒液进行混勻，转速300rpm，混勻时间l(T20s，以保证病毒细胞液完全混勻；
⑵病毒接种将M孔细胞培养板内的细胞生长液弃去，将稀释好的病毒液加入孔中， 2个稀释度分别接5个孔；
(3)加入病毒液后放入38°C培养箱中吸附Ih；
(4)吸附完毕，向每个接毒孔中加入细胞维持液1.5ml,同时将2个稀释度同行未接毒孔各加入细胞维持液1. 5ml，设置为阴性对照，将M孔细胞培养板放入5% CO2培养箱中继
续培养。实施例3病毒蚀斑的计数及毒价计算
在接入病毒后第4天对蚀斑进行计数，阴性对照的培养孔无蚀斑出现，实验成立，在显微镜下对细胞孔内的蚀斑计数，从左到右、从上到下一条龙地观察每一个细胞孔中的蚀斑 (有些蚀斑可能融合在一起，需要区分出蚀斑的生发中心)，根据各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的病毒液的体积及稀释倍数计算出待测定的病毒液的毒价。毒价=mimmm^Mmmmmm^ χ Jii舌稀释倍数
每孔接种病毒液体积
注最适稀释倍数为蚀斑数在1(Γ30个范围的稀释倍数。图1和图2中箭头所示分别为眼观和显微镜下观察的病毒蚀斑，蚀斑计数应在显微镜下进行，图1为半块M孔细胞培养板。图1中M孔细胞板上Al Α5孔对应的是5Χ IO4稀释度，Bl Β5孔对应的是 1 X IO4稀释度，Α6、Β6孔为阴性对照。Α6、Β6两阴性对照孔无蚀斑，细胞培养板有效。Bl Β5孔内蚀斑数均超过30个，1 X IO4稀释度不是最适稀释倍数。Al Α5孔蚀斑数分别是21、20、26、12、22，蚀斑数均在10 30个范围内，5 X IO4为最适稀释倍数，如前所述，每孔接种的毒液量为0. 2 ml，根据公式计算得到
该疫苗样品毒价(蚀斑形成单位)= 1+20+26+12+22)/5X5X 104/0. 2=5. 05X IO6 (个/ 毫升)
实施例4批件误差比较实验
批间误差的计算方法是将同一待检的病毒液小量分装，低温保存，分5次实验来测定这一待检毒样，5次测定的结果取对数，并计算5个样本总体的标准偏差后得到的数值。选取3个鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗样品(瑞普(保定)生物药业有限公司产品，市场有售)，每个样品均进行小量分装，分别使用本发明测定方法和《中国兽药典》测定方法测定同一个样品，每种方法重复测定5次，比较两种测定方法的样本标准偏差(结果见表1)。表1鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价测定结果比较


一种鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定方法，它包括以下步骤⑴制备鸡胚成纤维细胞悬液；⑵细胞培养；⑶稀释待测定的病毒液；⑷病毒接种及培养；⑸蚀斑计数；⑹毒价计算。本发明操作简单，测定条件均一，可控性强，批间误差小，缩短了鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗毒价的测定周期。