专利名称：针对Ⅱ型单纯疱疹病毒的疫苗诱发免疫应答的组合物和方法针对II型单纯疱疹病毒的疫苗诱发免疫应答的组合物和方法相关申请本申请要求享受以下专利申请的优先权申请号为61/180，784，申请日为2009年 5月22日的美国临时专利申请；申请号为61/235，628，申请日为2009年8月20日的美国临时专利申请；申请号为61/240，587，申请日为2009年9月8日的美国临时专利申请；申请号为61/M0，626，申请日为2009年9月8日的美国临时专利申请；申请号为61/305,918， 申请日为2010年2月18日的美国临时专利申请。所引用的申请的全部教导内容明确地通过引用并入本申请中。I.II型单纯疱疹病毒(HSV-幻是造成生殖器疱疹的主要原因。HSV-2最通常的传播方式是性接触，感染该病毒通常会导致在生殖器和肛周区域的病变反复发作，并伴有病毒颗粒释放进入生殖道。在没有病变或其他症状时，也会发生病毒的释放。HSV-2还潜伏在感觉神经节。HSV-2感染会造成被感染的患者出现身体不适以及性心理病态，并引发其他健康风险。特别地，感染HSV-2的患者更容易感染HIV，并且妊娠期妇女会直接将HSV-2传播给胎儿。对于免疫低下的个体或者新生儿来说，HSV-2的感染可能致命。目前还不能治愈 HSV-2。HSV-2感染被广泛传播，有研究估计，在全世界有20%的人口被感染(Looker et al.，2008，Bulletin of the World Health Organization, October 2008，86 (10))。女性感染者多于男性，并且患病率随着年龄增长而增加。大量的青少年被诊断感染有HSV-2，由于HSV-2的感染是终身的，因此可以预计HSV-2在人群中的的患病率将持续增加。针对HSV-2症状的治疗选择有限。采用如泛西洛韦、缬昔洛韦或阿昔洛韦等化合物的抗病毒治疗能够限制症状的持续时间，并且在一些病例中能加快病变的愈合并减少病毒的释放率。然而，抗病毒药物无法治愈，且无法阻止复发或彻底清除病毒。此外，抗病毒药物的使用需要患者意识到HSV-2感染的症状，然后获得确诊，并且最终配合抗病毒方案的治疗。在不容易获得抗病毒药物的某些世界地区中，这些要求可能无法得到满足。此外， 患者通常并未意识到其已被感染，要么因为他们并没有症状，要么因为初始感染的症状已经减轻，提示疾病已恢复。为了解决HSV-2带来的医疗和社会问题，非常需要研制药物组合物来抑制或抵抗 HSV-2造成的感染。可以使用有效的组合物来诱发更强的针对HSV-2的免疫应答，由此阻止最初的感染、阻断病毒在感觉神经节建立潜伏的能力、消除反复发作和/或阻止病毒释放。 已知免疫系统能够产生对HSV-2的防御，这在复发感染中得到证实，复发感染表现出的症状较少、较轻，并且复发频率随时间而降低。虽然HSV疫苗的最终目标是长期预防病毒感染，但对疾病症状的抑制也会有益于患者的健康。预防性或治疗性疫苗的当前目标之一就是减少临床发病并且在原发和潜伏感染中减少病毒释放。已经对三种预防性疫苗进行了临床试验但是结果均令人失望i)全病毒 )蛋白亚单位和iii)基于基因的亚单位疫苗(Stanberry et al. ,Clinical Infect. Dis. ,30(3) :549-566, 2000)。在1970年代研究了一系列灭活病毒疫苗，但是无一有效。最近发现一种减毒的HSV具有较弱的免疫原性。在临床上评估了基于两种重组糖蛋白的亚单位疫苗与不同佐剂组分的组合。一种疫苗是由Chiron研发出的，其含有HSV-2糖蛋白 D(gD2)和糖蛋白B(gB》的截短形式，从转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中纯化获得并且用 MF59佐剂进行制剂。另一种疫苗是由葛兰素史克公司(GSK)研发出的，其含有截短的gD2， 用佐剂铝和3-0-脱酰单酰磷脂A (MPL)制剂。两种疫苗都具有免疫原性并且在I/II期临床试验中都具有较好的耐受性。但是在III期试验中，Chiron研制的疫苗对于HSV-2的血清转化并不具有总体上的效果，因此研究到此为止。GSK研制的疫苗对于HSV-I、HSV-2血清阴性的女性志愿者具有显著的效果(73-74% )，但是对于男性无效。虽然即使是疫苗效果的有限，也能造福于HSV患者，但这些试验仅测试了疫苗可能性中的一小部分。这是因为疫苗的研发并不是系统的。全病毒疫苗的研究是假设将病原体自身呈现给免疫系统时能够产生最佳的免疫效果。确实，全病原体疫苗的免疫应答范围和持续时间在过去一直都优于亚单位疫苗。但是，必须考虑到疫苗株的致病性。由于亚单位疫苗被认为在感染过程中的疾病发病和免疫原性中发挥重要作用，因此目前选择亚单位疫苗用于疫苗测试。通过这些方式鉴定出针对HSV的候选疫苗，它们在某些制剂中具有有限的效果，但是在其他制剂中却没有效果。因此，需要有新的和改进的方法，来研发疱疹病毒疫苗以抵御疱疹疾病。II.发明概述HSV-2的感染和传播是重要的健康问题。本申请提供了，尤其是，一些高效的 HSV-2疫苗。所述疫苗可用于治疗或预防。本申请还提供了特异性抗原和采用该抗原诱发针对HSV-2的免疫应答的方法。一方面，本发明提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和由SEQ ID NOS 2、3、4和5组成的至少一个多肽或其免疫原性片段，并且可选地进一步包括SEQ ID N0:1或其免疫原性片段。所述疫苗制剂可以包括由上述SEQ ID NOS之一组成的第一多肽，以及由上述SEQ ID NOS中的另一个组成的第二多肽。本发明的另一方面提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂、含有皂树皂苷的一个或多个纯化成分的佐剂，和至少一个多肽，其具有SEQ ID NOS :2、3、4和5中的任意一个或其免疫原性片段，并且可选地进一步包括SEQ ID NO :1或其免疫原性片段。进一步地，本发明的一方面提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和由 SEQ ID NO :2或其免疫原性片段组成的多肽。SEQ ID NO :2中的残基可以被截短。多肽可以是糖基化的，或者可以是未糖基化的。再进一步地，本发明的一方面提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和包括SEQ ID NO :5的多肽，其中所述多肽缺失了跨越341-363位氨基酸残基的跨膜结构域中的全部或至少8个氨基酸残基。由此本发明的一个方面提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和包括SEQ ID NO :4的多肽。该多肽可以是糖基化的，或者可以是未糖基化的。本发明的另一方面提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和包括SEQ ID NO 5的多肽。该多肽可以是糖基化的，或者可以是未糖基化的。本发明的另一方面提供了一种疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和包括SEQ ID NO 3的多肽。该多肽可以是糖基化的，或者可以是未糖基化的。在一些实施方式中，疫苗制剂中的多肽可以缀合在免疫原性载剂上，例如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)。在其他实施方式中，疫苗制剂进一步包含佐剂。佐剂可以是皂树皂苷的一个或多个纯化成分。本发明提供了通过给药有效量的本发明所述的疫苗制剂，来治疗患有HSV-2感染或者HSV-2易感对象的方法。在一些实施方式中，所述方法抑制HSV-2的症状，例如减少疱疹性病变的数量、减少对象经受疱疹性病变的天数、抑制HSV-2感染未感染对象、增加针对一个或多个HSV-2抗原的IgG滴度和/或T细胞应答，和/或减少在HSV-2感染初期时的疱疹性病变数目。在另一方面，本申请描述了高通量系统的结果，其用于体外筛选效应T细胞库，从而从HSV-2的完整蛋白质组中鉴定出T细胞特异性的靶抗原。该技术允许鉴定出可作为预防性或治疗性组分的单个抗原，其有望在体内发挥效果。一方面，本发明提供了若干关键的保护性T细胞抗原，可将其加入到诱导免疫应答的基于蛋白的组分中。本发明的一个方面提供了药物组合物，其包括两种或更多分离的多肽，所述分离的多肽选自具有SEQ ID NOS :1-38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。另一方面，本发明提供了疫苗制剂，包括药学上可接受的载剂和具有SEQ ID NOS 1-38中至少一个的多肽或其免疫原性片段。在某些实施方式中，所述多肽由SEQ ID NOS 1-38中的至少一个组成。本发明的另一方面提供了在对象中诱导免疫应答的方法，包括向所述对象给药有效量的疫苗制剂或药物组合物，其包含有效量的两种或更多分离的多肽，所述分离的多肽选自具有SEQ ID NOS :1-38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。本发明的另一方面还提供了在对象中减少HSV-2感染的一种或更多症状的方法， 包括向所述对象给药有效量的疫苗制剂或药物组合物，其包含有效量的两种或更多分离的多肽，所述分离的多肽选自具有SEQ ID NOS :1-38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。在一些实施方式中，HSV-2感染的症状包括一个或多个病变形成、疼痛、刺激、瘙痒、发热、不适、头痛、病毒释放和前驱症状。进一步地，本发明的一方面提供了抑制HSV-2感染的初始阶段的方法，包括给药有效量的疫苗制剂或药物组合物，其包含有效量的两种或更多分离的HSV多肽，所述分离的多肽选自具有SEQ ID NOS :1-38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。申请人:在此还披露了本发明的另一个方面，提供了在暴露于HSV-2的对象中抑制潜伏HSV-2感染发展的方法，包括给药有效量的疫苗制剂或药物组合物，其包含有效量的两种或更多分离的HSV-2多肽，所述分离的HSV-2多肽选自具有SEQ ID NOS :1_38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。在一个相关的方面，本发明提供了在HSV-2感染的对象中减少病毒释放的方法， 包括给药有效量的疫苗制剂或药物组合物，其包含有效量的两种或更多分离的HSV-2多肽，所述分离的HSV-2多肽选自具有SEQ ID NOS :1_38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。进一步地，本发明一方面提供了在HSV-2感染的对象中减少反复发作的方法，包括给药有效量的疫苗制剂或药物组合物，其包含有效量的两种或更多分离的HSV-2多肽， 所述分离的HSV-2多肽选自具有SEQ ID NOS :1_38中至少一个氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段。本发明的另一个方面提供了生产任一上述药物组合物的方法，包括表达所述两种或更多的多肽，并且分离所述两种或更多的多肽。申请人:进一步披露了本发明的一个方面，提供了在HSV-2的感染对象中诊断症状的严重程度的方法，包括(i)检测对自体抗原提呈细胞(APC)应答产生的T细胞激活，所述抗原提呈细胞由一种或更多分离的HSV-2多肽致敏，所述HSV-2多肽选自SEQ ID NOS 1-38 的多肽或其免疫原性片段，以及(ii)将检测到的水平与从经受频繁发作的被感染对象中获得的参照水平相比较；与参照水平相比，所述应答显著增强则表示所述对象具有较轻的症状(例如，对象无症状)。应答显著的增强可以是，例如包括1.5倍或更高、2倍或更高、3 倍或更好、5倍或更高、10倍或更高或者甚至20倍或更高的增强。本发明的另一方面提供了在HSV-2的感染对象中诊断症状的严重程度的方法，包括(i)检测来自天然感染对象或暴露于病毒的对象的T细胞对APC应答产生的激活，所述 APC提呈一种或更多分离的HSV-2多肽，所述HSV-2多肽选自SEQ ID NOS 1_38的多肽或其免疫原性片段，以及(ii)将检测到的水平与从经受频繁发作的被感染对象中获得的参照水平相比较；与参照水平相比，所述激活显著减弱则表示所述对象具有较重的症状(例如， 频繁发作)。本发明的另一个方面提供了包含抗体的药物组合物，所述抗体结合一种或更多分离的HSV多肽或其免疫原性片段，所述HSV多肽选自由SEQ ID NOS :1_38组成的列表。此外，本发明一个不同的方面提供了 HSV-2的免疫原性组合物的鉴定方法，通过检测两种或更多多肽促进哺乳动物T细胞生成细胞因子的能力，所述多肽选自具有SEQ ID N0S1-38任一氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段，其中免疫原性组合物能提高细胞因子水平，使其显著高于阴性哺乳动物T细胞生成的细胞因子水平。通常，显著提高的细胞因子水平是阴性细胞生成的水平的至少1. 5倍、2倍、3倍、5倍、10倍或者甚至20倍。本发明的另一个方面提供了在来源于对象的样本中检测HSV-2的方法，所述方法包括(i)将所述样本与一种或更多抗体接触，所述抗体针对一种或更多具有SEQ ID NOS 1-38中某一氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段，并且(ii)检测所述一种或更多抗体与所述样本中的一种或更多HSV-2多肽的结合。最后，本发明的一个方面提供了药物组合物，包括两种或更多分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自核酸序列SEQ ID NOS :1-38或其片段，所述片段编码免疫原性多肽。III.图IA和B是附图，分别显示了用gD2全长蛋白、gD2 Δ TMR或截短至跨膜结构域上游的gD2蛋白(以306t表示)免疫后，⑶4+和⑶8+T细胞的免疫应答。图2A和B是附图，分别显示了用混合、重叠的多肽免疫后的⑶4+和⑶8+T细胞的免疫应答，所述多肽跨越了由RS. 1. 1、RSl. 3. 1和RSl. 3. 2编码的gL2、ICP4. 1或IPC4片段。图3A和B是附图，分别显示了用gD2 Δ TMR或gD2 Δ TMR和ICP4. 2免疫后的CD4+和⑶8+T细胞的免疫应答。IV.发明详述本申请描述了针对HSV-2的疫苗和免疫原性组合物。疫苗制剂可以包括一种多肽，所述多肽具有表1中的序列或其免疫原性片段，或者包括至少两个多肽的组合，所述至少两个多肽具有表1中的序列或其免疫原性片段。在某些实施方式中，疫苗中的多肽具有 SEQ ID NOS 中至少一个的完整序列，或者由SEQ ID NOS 中任意一个的完整序列组成。免疫原性组合物可以包括一种多肽，所述多肽具有表1或表2中的序列或其免疫原性片段，或者包括至少两种多肽的组合，所述至少两种多肽具有表1或表2中的序列或其免疫原性片段。在某些实施方式中，免疫原性组合物中的多肽具有SEQ ID NOS :1-38中任意一个的完整序列，或者由SEQ ID NOS 1-38的完整序列组成。表1或表2中的多肽可以是由SEQ ID NOS :39-46和117_1；34所示的序列编码，和/或可由在网址http //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez可公开获得的cDNA序列编码。cDNA和蛋白序列还可以由任何已知的HSV-2病毒株中获得，包括恥52、333和Mrain G。相应地，可以从NC_001798. 1的基因组序列中以基因或蛋白名称登录获取cDNA序列，并且可以与NC_001798. 1披露的序列有大约97%的保守度。在本申请的描述中，这些多肽可以由蛋白名称、SEQ ID NO和/或编码该蛋白的基因名称来指代。可以在多种表达系统中制备这些多肽。适宜的表达系统包括基于大肠杆菌和基于杆状病毒的表达系统(例如在昆虫细胞中)。采用大肠杆菌制备的多肽通常是全长和未糖基化的多肽，但也能够制备截短的变体。在某些实施方式中，这些截短的变体保留全部或部分信号结构域。采用杆状病毒表达系统制备的多肽通常缺少N-端信号序列，但是被全部或部分糖基化。表1.疫苗或免疫原性组合物的HSV-2抗原


II型单纯性疱疹病毒(HSV-2)感染是广受关注的健康问题。本发明提供了针对HSV-2的高效疫苗和免疫原性组合物。可以治疗性或预防性地使用抗原。