专利名称：一种低通读率慢病毒载体及方法一种低通读率慢病毒载体及方法技术领域本发明属于生物技术领域，特别涉及一种低通读率慢病毒载体及降低慢病毒载体通读率的方法。近年来，慢病毒载体作为一种有效的生物研究工具及潜在的基因治疗载体，正愈来愈受到科研人员的重视。慢病毒载体有着传统的基因治疗载体所不能比拟的优点，它既能感染分裂细胞，又能有效地感染静息细胞，而且能够稳定地整合和表达外源基因。虽然，慢病毒载体有诸多优点，但是慢病毒载体的具有通读率过高的特点。也就是说，慢病毒载体整合到宿主体内，在产生的RNA的过程中，有一定比例的RNA不终止，继续转录下游宿主的基因序列，从而增加了转录和激活下游原癌基因等的可能性，造成安全隐患。 因此有必要改造慢病毒载体，使其通读率降低，这样的慢病毒载体才更加符合基因治疗载体的要求。发明内容因此，本发明要解决的技术问题就是针对慢病毒载体存在通读率较高的缺陷，提供一种低通读率慢病毒载体及降低慢病毒载体通读率的方法，以及提供一种用于试验慢病毒3’ LTR元件通读率的载体。慢病毒载体具有RNA转录断裂作用的是其3’ LTR元件，本发明人发现3’ LTR 结构的不足是导致较高通读率的原因。3’ LTR元件依次包括U3，R，U5，本发明人通过将 cHS4 (Hypersensitives site 4 of the chicken-globin locus，)( 自4)白勺 400bp 核心序列，和 SV40 (Simian virus 40，猴空泡病毒 40)的 2XUSE (Upstream sequence elements，转录终止上游序列元件)，两种元件中的任何一种或两种插入至慢病毒载体 3 ’ LTR的U3区，大大降低了其通读率，从而完成了本发明。本发明一方面提供一种低通读率慢病毒载体，其为在慢病毒载体的3’LTR的U3区插入了 cHS4的400bp核心序列和SV40的2 X USE两种元件中的任何一种或两种。本发明中，所述的cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 X USE在U3区的插入位置可以是任何位置，较佳的是U3区的两个EcoRV酶切位点之间。本发明中，插入的片段优选反向接入的cHS4元件和/或正向接入的2XUSE元件。 所述的插入的片段更优选反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件叠加。所述的插入的片段最优选5’方向至3’方向依次是反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件。
本发明中cHS4反向和2 X USE正向相连接入到3，LTR的U3区两个EcoRV位点之间，通读率降低效果最为明显。
本发明中，所述的CHS4的400bp核心序列较佳的是序列表中SEQ IDNO 1所示的序列。
本发明中，所述的SV40的2XUSE是指2个串联的USE元件，较佳的是序列表中CN 102533863 ASEQ ID NO 2所示的序列。
本发明中，所述的慢病毒载体可以是现有的任何慢病毒载体，较佳的是慢病毒载体FUGW。本发明的方法对所有3’ LTR有作用，对FUGW的3’ LTR效果最佳，其序列见序列表中SEQ ID NO 3的第5359位(KpnI)至第5931位(ApaI)之间的序列。其U3区位于 5359-5746 ；R区位于5747-5842 ；U5区位于5843-5931。两个EcoR V酶切位点之间是SEQ IDNO 3的第5460位和5539位。
本发明第二方面提供一种降低慢病毒载体通读率的方法，包括在慢病毒载体的 3，LTR的U3区插入cHS4的400bp核心序列和SV40的2 X USE两种元件中的任何一种或两种。
本发明第三方面提供一种用于试验慢病毒3’ LTR元件通读率的载体，其在 EGFP-Nl质粒的CMV启动子和GFP之间插入了 3’ LTR元件，并且在3’ LTR元件的U3区含有cHS4和2 XUSE两种元件中的一种或两种。其中，所述的cHS4的400bp核心序列和/或 SV40的2XUSE在U3区的插入位置较佳的是U3区的两个EcoR V酶切位点之间。该载体中的GFP表达绿色荧光蛋白，检测绿色荧光蛋白的表达情况，就可以判断3’ LTR的通读率。 将这些载体分别转染细胞，通过荧光显微镜镜检和FACS (流式细胞仪)来检测绿色荧光蛋白，可以从蛋白水平来验证通读率改善的情况。
本发明第四方面提供一种RNA水平检测通读率的方法，包括采用RT-PCR定量通读 mRNA和总mRNA拷贝数，将通读mRNA拷贝数除以总mRNA拷贝数即得通读率。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明人发现cHS4元件和SV40的 2XUSE元件能够有效降低慢病毒载体3’LTR的通读率，从而将cHS4和/或2XUSE元件插入到慢病毒载体的3’LTR的U3区，得到了 3’LTR通读率明显降低的慢病毒载体，其中cHS4 反向和2XUSE正向相连接入到3’ LTR的U3区两个EcoRV位点之间，降低效果最为明显。 在采用本发明的慢病毒载体进行转基因时转录和激活下游原癌基因等的可能性大大下降， 安全性增强，本发明的慢病毒载体更加符合基因治疗载体的要求。


以下结合

本发明的特征和有益效果。
图1是在载体中插入单个以正反两个方向接入的元件cHS4和2XUSE构建 EGFP-N1-LTR-X系列中间载体的构建图。
图2是将效果最好的CHS4元件反向接入不同位点构建EGFP-N1-LTR-X系列中间载体的构建图。
图3是将元件CHS4和2 XUSE各向叠加构建EGFP_N1_LTR_X系列中间载体的构建图。
图4将元件CHS4和2 XUSE各向叠加后接入慢病毒载体的构建图。
图5是慢病毒通读示意图。

本发明人以慢病毒载体FUGW为例，发现FUGW的3，LTR有80 %的通读率。将cHS4的400bp核心序列，和/或SV40的2 X USE这两种元件插入至慢病毒载体FUGW的3，LTR的 U3区，发现有效降低了其通读率。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“常温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
实施例1载体构建
本发明首先构建EGFP-Nl-LTR-X系列载体，作为中间载体。因为在慢病毒载体FUGW中有三个EcoRV位点(4617，5460，5539)，若直接接入，会切碎载体。同时，利用 EGFP-N1-LTR-X系列载体这几个中间载体，可以通过检测GFP的荧光强度来推断通读的改善效果，做一个蛋白水平的验证。因为慢病毒载体FUGW中GFP位于3’ LTR之前，GFP表达不受3’LTR影响。因此，不在FUGW里做GFP蛋白表达的检测。为了一步步证明元件的有效性我们将EGFP-N1-LTR-X系列载体构建分为三个阶段。第一阶段，插入单个元件，但尝试不同方向性，分别将cHS4和2XUSE以正反两个方向接入载体中测其通读改善情况，找出有效的元件。第二阶段，取效果最好的单个元件接入不同位点，以找出有效位点。第三阶段，尝试有效元件的不同叠加方式，找出最佳组合。最后将第三阶段构建的含有不同叠加元件的 LTR接回到慢病毒载体FUGW，通过定量PCR确定其改善通读率的效果，来获得通读率低的慢病毒载体。
1、元件的获得
(1)扩增 cHS4 元件
用上游引物(cHS4-F) 5，-GCTA |GATATC| TCGACTCTAGAGGGACAG-3，(包含 EcoRV位点)，下游弓丨物(CHS4-R) 5，-GCT IAGTACTI TCCCTGCAGGCATTCAAG-3，(包含 kal 位点)， 以PBCl质粒(Invitrogen)为模板，进行PCR扩增。反应体系为IOx PCRbuffer2.5 μ dNTP(2.5mM)2 pLcHS4-F (IOpmol^L)IpLcHS4-R (IOpmol^L)1 μιPBCl 质粒(约 50ng/pL)1 μLPyrobest Taq E (5U/pL)0.2 pLH2O_17.3 μLYa_25 叫
反应条件为94 °C 5min ； (94 V 45sec，60 V 45sec, 72 V 45sec) X 32 个循环； 72°C IOmin0扩出约400bp的cHS4片段，将其送至上海博尚生物技术公司进行测序。然后将测序所得序列与PBCl序列进行比对，发现完全一致。
利用EcoRV酶切由PCR扩增得到的DNA片段cHS4。酶切体系如下


本发明公开了一种低通读率慢病毒载体及降低慢病毒载体通读率的方法。该低通读率慢病毒载体是在慢病毒载体的3’LTR的U3区插入了cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE两种元件中的任何一种或两种所得的。插入的片段最佳的是5’方向至3’方向依次为反向接入的cHS4元件和正向接入的2×USE元件。采用本发明的慢病毒载体，慢病毒载体3’LTR通读率明显降低，转基因时转录和激活下游原癌基因等的可能性大大下降，安全性增强，更加符合基因治疗载体的要求。一种RNA水平检测通读率的方法，包括采用RT-PCR定量通读mRNA和总mRNA拷贝数，将通读mRNA拷贝数除以总mRNA拷贝数即得通读率。