专利名称：一种获得胚性愈伤组织诱导率高的高羊茅种子的方法建立高效简便的再生体系对通过基因工程的方法获得具有实际应用价值的草坪草至关重要。从上个世纪70年代至今经过几十年的研究，大多数重要草坪草都建立了再生体系，并且也已经建立了遗传转化体系，目前已经朝着改良草坪草抗逆性、抗病虫害等具有实际应用价值的方向发展(Creemer MT, Loeffe JPM, Zaal MACM (1998). Isolation culture and regeneration of Lolium perenne and Lolium multif lorum protoplasts. Curr Plant Sci Biotech Agric，7 (I):53 54 ;Dalton SJ (1988). Plant regeneration from cell suspension protoplasts of Festuca arundinacea Schreb.， Lolium perenne L. and L. multiflorum. Plant Cell Tiss Orgj 12:137 140; Spangenberg G，Wang Z-Yj Nagel J et al (1994). Protoplast culture and generation of transgenic plants in red fescue (Festuca rubra L.). Plant Sci.，97:83 94 ; Takamizo T， Suginobu KIj Ohsugi R (1990). Plant regeneration from suspension culture-derived protoplasts of tall fescue (Festuca arundinacen Schreb.) of a single genotype [J]. Plant Scij 72(I):125 131 ;Wang Z-Yj Nagel J，Potrykus I (1993). Fertile plant regeneration from protoplasts of meadow fescue (Festuca pratensis Huds.). Plant Cell Reports, I(12) :95 100 ;Asano Y and Sugiura K (1990). Plant regeneration from suspension culture-derived protoplasts of Agrostis alba L. (redtop). Plant Scij 72(I):267 273 ;Terakawa T，SatoTj Koike M (1992). Plant regeneration from proto-plasts isolated from embryogenic suspension cultures of creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds.). Plant Cell Reports, 11(I):457 461 ;Zhong H，Srinivasan C，Sticklen M B (1991). Plant regeneration via somatic embryogenesis in creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds·)· Plant Cell Reports, 10(1): 453 456 ;)。目前在草坪草上获得成功的再生体系主要有愈伤组织再生系统，悬浮细胞再生系统，原生质体再生系统、直接分化再生系统等。虽然如高羊茅，黑麦草等几大类草坪草都建立了比较有效的再生体系，但是也存在着诸多的问题。在草坪草的转基因研究中，愈伤组织和胚性悬浮细胞是最常用的转化受体。由于高羊茅等草坪草种子的高度异质性，愈伤组织再生系统面临的一个巨大问题就是胚性愈伤组织诱导率低，出现具有强烈分化能力的愈伤组织块极少，这给遗传操作带来了不可避免的重复工作和劳动量。胚性细胞悬浮再生系统虽然在一定的时间内能够大量获得胚性愈伤组织，但是其实际操作繁琐，并且前期需要极高的对胚性愈伤组织的鉴别力，同时胚性培养物随着继代次数的增多胚性迅速丧失，出现白化苗的概率增加。原生质体是通过分离胚性细胞悬浮系而得到的，实际操作更加烦琐，转基因筛选困难，更不易获得转基因再生苗。
本发明的目的在于提出一种获得胚性愈伤组织诱导率高的高羊茅种子的方法。本发明提出的获得胚性愈伤组织诱导率高的高羊茅种子的方法，是通过在改良的愈伤组织诱导培养基上筛选具强烈分化能力的胚性愈伤组织，并通过大田繁殖和自然授粉获得这些胚性愈伤组织再生苗杂交的后代种子。分析发现，这些种子能够被诱导出具强烈分化能力的胚性愈伤组织块是未经筛选高羊茅种子的5倍之多。表明通过筛选组培响应性强的成熟胚有助于提高遗传上异质的高羊茅再生体系的效率。本方法对大多数高羊茅品种具有普遍的适应性，并借此可建立高羊茅高效的再生体系，适宜于高羊茅的遗传改良。本发明提出的获得胚性愈伤组织诱导率高的高羊茅种子的方法，具体步骤如下 以高羊茅成熟胚为外植体，在愈伤组织诱导培养基上首先进行胚性愈伤组织的诱导；挑选致密淡黄的具强烈分化能力的胚性愈伤组织在分化培养基上进行分化；然后将再生苗移栽至1/2 MS培养基上进行生根；然后将完整再生苗移栽至带有土壤介质的花盆生长；最后将适应土壤生长的再生苗转移至大田生长，间隔种植，自然授粉获得种子。本发明中，所述高羊茅愈伤组织的诱导培养基，包括MS盐+MS维生素，O. 5g/L水解酪蛋白，O. 15g/L L-谷氨酰胺，30g/L鹿糖，3g/L Gelrite,9. 5mg/L 2，4_D,O. 3mg/L 激动素，PH 值 5. 8-6. O0本发明中，所述高羊茅愈伤组织的分化培养基，包括MS盐+MS维生素，30g/L蔗糖，3g/L Gelrite, O. 3mg/L 激动素，PH 值 5. 8-6. O。本发明中，诱导形成愈伤组织过程中所用改良的诱导培养基中添加了 2，4-D和细胞分裂素，所述2，4-D为9. 5mg/L ;所述细胞分裂素为O. 3mg/L激动素。本发明中，挑选的愈伤组织为淡黄致密的具强烈分化能力的胚性愈伤组织。本发明中，所述胚性愈伤组织的分化在含O. 3mg/L激动素的所述改良分化培养基上进行。上述培养基组分中，MS为MS培养基成分(Murashige & Skoog medium, 1962, Physiol. Plant 15:473-497 )，2，4-D 为 2，4-二氯苯氧乙酸。本发明提出的通过具强烈分化能力胚性愈伤组织再生苗杂交所获得的种子提高遗传上异质的高羊茅再生体系的效率还未见有报道。由于冷季型草坪草遗传上的高度异质性，基因型差异一直是限制人们建立草坪草高效再生体系的重要因子，也是人们在基本解决草坪草愈伤组织诱导的外部条件之后一直没有被有效解决的问题。研究表明，以高羊茅优良基因型的种子成熟胚作为外植体能够建立起高效的高羊茅愈伤组织再生系统，并且成熟胚相比于其他外植体取材更方便，因此不需要进行相应的继代培养扩繁胚性愈伤组织， 所获得的胚性愈伤组织块可以直接用于后续的遗传转化，相对来说更简单和方便。图I高羊茅无再生能力的愈伤组织(A)及具强烈分化能力的淡黄致密的胚性愈伤组织(B)。图2用于大田繁殖及自然授粉的胚性愈伤组织再生苗。图3高羊茅胚性愈伤组织再生苗所结种子。图4未筛选高羊茅种子(Barlexas)和筛选后高羊茅种子(R-Barlexas)种子发芽势比较。其中，A,黑暗催芽5天后的Barlexas和R-Barlexas种子；B, A中所示Barlexas 和R-Barlexas种子发芽率；C，A中所示苗高在2. 5cm左右的种子占发芽种子数的比例图5典型的高羊茅胚性愈伤组织再生苗所结种子成熟胚与普通高羊茅种子成熟胚诱导的愈伤组织比较(白色箭头为胚性愈伤组织)。图6高羊茅胚性愈伤组织再生苗所结种子成熟胚与普通高羊茅种子成熟胚愈伤组织诱导情况比较。图7未筛选高羊茅种子(Barlexas)和筛选后高羊茅种子(R-Barlexas)的胚性愈伤组织诱导率比较。其中，A，高羊茅典型的具高分化能力的胚性愈伤组织；B，A中胚性愈伤组织在分化培养基上的强烈分化；C，未筛选高羊茅种子和筛选后高羊茅种子如A中所示的胚性愈伤组织的诱导率。

高羊茅干种子用无菌蒸馏水搅拌清洗30-45min，去除瘪粒；75 %乙醇表面灭菌2min，
O.l%HgC12表面灭菌15min ;无菌水冲洗5-6次，以彻底去除HgC12，置于4°C吸胀72 h待用。I. 3胚性愈伤组织的诱导，再生，幼苗移栽
胚性愈伤组织诱导培养基(I) MS + 9. 5mg. I/1 2, 4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid) + 0. 3mg. L-1 KT +0. 15g. L-1 L-谷氨酰胺 +0. 5g. L-1 水解酪蛋白 + 3g. L-1 Gelrite + 30g. Γ1 蔗糖，pH 5. 8。分化培养基(R) : MS + 0. 3mg. Γ1 KT+ 3g. Γ1 Gelrite + 30g. Γ1 蔗糖，pH 5. 8。生根培养基(Rt) : 1/2MS + 3g. L^1Gelrite + 30g. Γ1 蔗糖，pH 5. 8。无菌条件下用解剖刀取出高羊茅种子的成熟胚(解剖镜下操作)，接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，25°C黑暗培养8周。挑选淡黄，致密，生长状态良好的胚性愈伤组织， 接种于分化培养基上，25°C光照(光照强度UOMffloPnr2·^)培养4周。当再生绿苗长到 2-6cm左右时，挑取具有强烈再生能力的愈伤组织再生苗，将其转移到1/2MS生根培养基上，25°C，光照强度光照条件下(16h光照/8h黑暗)进行生根培养。这些再生苗统一命名为R-Barlexas(Regenerative Barlexas)。待幼苗根长约3 cm时,将苗从 1/2MS生根培养基上移出并洗去附着于根部的培养基，栽于装有黑土 蛭石珍珠岩=I 1
O.2的培养钵中(开始3-5天注意保湿)，移至25±2°C的培养室(16h光照/8h黑暗)生长。1.4再生苗种群的建立及后代的获得
待再生幼苗长到30个分蘖左右时，将苗以5个分蘖为一组，无性繁殖一次；当苗再次长到30个分蘖左右时，将苗移至大田生长，不同愈伤组织来源的再生苗间隔种植，以达到最佳授粉效果，来年秋初收取种子。实施例2、胚性愈伤组织再生苗后代种子及普通高羊茅种子愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率的比较。2.1种子活力的比较。取表面灭菌后的高羊茅种子，无菌条件下接种于铺有3层无菌纱布的Ilcm培养皿内，每皿100粒，重复2次。加入10 ml无菌水充分湿润，置于25°C生化培养箱内，黑暗湿润发芽，以第5天的成苗率作为种子活力的检测标准。种子发芽试验是检测种子活力最有效的方法之一。通过比较Barlexas和R-Barlexas种子5 d时的发芽率发现,Barlexas和 R-Barlexas发芽率无明显差异，发芽率高，均在90%以上。但R-Barlexas发芽均一度明显高于Barlexas。5 d时,R-Barlexas苗高在2. 5cm左右的种子占发芽种子比例高达94%,而 Barlexas仅为22. 6%，苗高参差不齐。2.2愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率的比较。种子灭菌方法按本章I. 2部分进行，成熟胚诱导愈伤组织方法参照本章I. 3部分进行；每个培养皿各接16个成熟胚，总共各十个皿，25°C暗培养8周后，统计愈伤组织诱导率和胚性愈伤诱导率。该实验在不同时间完全独立重复一次。结果表明，R-Barlexas诱导出具强烈再生能力胚性愈伤组织的比率是Barlexas的5倍多，明显高于Barlexas,如图2 所示。R-Barlexas的愈伤组织诱导率也明显高于Barlexas,而种子发芽率基本一致,表明胚性愈伤组织诱导率和愈伤组织诱导率的差距并不是由于种子活力间的差距而引起的。在整个愈伤组织诱导过程中R-Barlexas的愈伤组织生长相对缓慢，出现致密，颜色偏淡黄色的胚性愈伤组织的频率明显高于Barlexas。


本发明属于生物技术领域，具体为一种获得胚性愈伤组织诱导率高的高羊茅种子的方法。该方法包括采用高羊茅的成熟胚为外植体，在改良的愈伤组织诱导培养基上形成愈伤组织，随后挑选淡黄致密的具强烈分化能力的胚性愈伤组织，并将其接种到改良的分化培养基上进行分化，待分化形成完整幼苗之后再将其转移到1/2MS生根培养基上，等再生苗生出健壮根系之后将其转移到带有土壤介质的花盆生长。然后将这些组培苗转移到大田生长，并间隔种植，自然授粉，获得其种子。结果表明，这些具强烈分化能力的胚性愈伤组织再生苗杂交所获得的后代种子被诱导出淡黄致密胚性愈伤组织的频率是未经筛选高羊茅种子的5倍之多。