专利名称：蛋白因子Dmrt1在调控细胞凋亡中的用途的制作方法Dmrt是最近发现的一类基因，它们因为都具有和果蝇的dsx和线虫的mab-3类似的DM结构域而得名。目前在人类和小鼠，最少发现了 Dmrt家族的8个成员，这其中，Dmrtl 得到了最广泛的研究。值得关注的是，Dmrtl是目前发现的唯一一个在不同门的动物中都具有保守性的性别发育基因。在人类中，包含有Dmrtl基因的9号染色体短臂的缺失导致了男性完全或部分的性反转。缺失Dmrtl基因的雄性小鼠的睾丸结构也出现了明显的异常， 纯合子缺失导致精子缺失，完全不育(Raymond et al.，2000)。Dmrtl，Dsx和Mab-3基因，在功能和结构上的相似，表明这些基因可能起源于共同的祖先。这进一步证明了性别决定与分化发育过程在具有多样性的同时，在某些方面具有着共同的进化起源，也说明性别决定和分化的调控机制在不同物种中存在着保守性。事实上，在缺乏性别决定主基因SRY的几个物种，例如鸟类中的鸡和硬骨鱼青鏘，以及两栖类的爪蟾中，Dmrtl可能对性别决定起着决定性的作用。生殖细胞肿瘤是一类常见的肿瘤，它的产生，严重威胁着人类男性的精子发生，从而导致生殖障碍。睾丸生殖细胞肿瘤(TGCTS)是中青年男性最为常见的肿瘤之一。根据肿瘤发生的时间，组织学特征和假定的细胞类型来源，生殖细胞肿瘤可以分为三类一型多见于新生儿，来源于幼儿早期的生殖细胞。二型具有和一型同样的细胞来源，但常发病于青年时期。三型睾丸生殖细胞肿瘤多见于50岁以上的男性，有着不同的发病机制，但一般认为来源于精原细胞和精母细胞的发育异常(Krentz et al.，2009)。精原细胞瘤起源于睾丸原始生殖细胞，为睾丸最常见的肿瘤，占睾丸生殖细胞肿瘤的60% 80%，多发生于中年以后，常为单侧性，右侧略多于左侧。该瘤为低度恶性。肉眼观，睾丸肿大，有时可达正常体积的10倍，少数病例睾丸大小正常。肿瘤体积大小不一， 小者仅数毫米，大者可达十余厘米，通常直径为3 5cm。精原细胞瘤可分为生殖细胞瘤与非生殖细胞瘤两类。前者发生于曲细精管的生殖上皮，约占95%;后者发自间质细胞，约占5%。多见于25-44岁，具有地区说种族差异。精原细胞瘤病因尚不清楚，可能和种族、遗传、隐睾、化学致癌物质、损伤、内分泌等有关。精原细胞瘤分3个亚型①典型精原细胞瘤，约占80%，生长较慢，预后好；②未分化精原细胞瘤，约占10%，恶生程度较高，预后比典型精原细胞瘤差；③精母细胞精原细胞瘤，约占10%，多见于40岁以上患者。典型的精原细胞瘤有瘤细胞形态结构单一和间质内有淋巴细胞浸润两个特征。瘤细胞弥漫分布或呈索状结构，细胞的形态一致，与正常精小管内精原细胞相似，瘤细胞大， 圆形或多角形、境界清楚、胞浆透明，核大、位于中央，核膜及染色质较粗，有1 2个嗜酸性核仁，核分裂像不多见。最近的研究发现，近交系S129小鼠中，Dmrtl基因的纯合子突变导致高比例的精原细胞瘤的产生，值得注意的是，在另一个近交品系，C57BL/6中，Dmrtl突变并不能产生类似的癌症表型(Krentz et al.，2009)。另一组研究人员通过对精原细胞瘤病人的基因组序列进行高通量分析后发现，Dmrtl基因的突变和人类的精原细胞瘤之间存在着关联，Dmrtl 可能是一个潜在的精原细胞瘤的致病基因(Turnbull et al.，2010)。然而，直到目前为止， Dmrtl是否通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生成及其具体的调控机制仍然未知。从70年代开始，p53作为抑制癌症的基因这一问题已经被得到了十分广泛的研究，设计的重要论文可以用数以万计来形容，在癌症和肿瘤研究领域，P53这一重要功能更是所有研究人员的共识。
本发明的目的在于提供一种治疗p53基因诱导疾病的新药物。为了实现上述目的，本发明主要包括以下内容出人意料的，发明人发现一个睾丸中凋亡诱导蛋白Dmrtl的调控新途径。该蛋白受到生长因子调控，并能够通过结合原癌蛋白Mdm2激活p53，诱导细胞凋亡。a)发现了该基因的蛋白受到胰岛素类生长因子的正向调控，胰岛素(insulin)，胰岛素生长因子(igf-1) 等生长因子通过激活MEK/ERK信号通路抑制Dmrtl蛋白的泛素化，从而稳定蛋白，上调 Dmrtl蛋白水平。b)Dmrtl能够通过和原癌蛋白Mdm2相互作用抑制Mdm2对其靶蛋白p53 的降解，上调的P53蛋白诱导细胞凋亡，抑制癌细胞生长。C)Dmrtl-Mdm2-p53三个蛋白的调控关系，除了参与上述诱导细胞凋亡的作用，可能还在生殖干细胞的分化上发挥功能。其特征是=Dmrtl蛋白水平受胰岛素类生长因子正调控，Dmrtl通过和Mdm2，p53结合诱导细胞凋亡，抑制癌细胞生长。本发明一方面涉及蛋白Dmrtl的调控因子在制备治疗和/或诊断与p53基因相关疾病药物中的用途。在本发明的一个实施方式中，所述的调控因子是正向调控因子。在本发明的一个实施方式中，所述的与p53基因相关疾病是指睾丸中的疾病。在本发明的一个实施方式中，所述疾病是睾丸肿瘤。在本发明的一个实施方式中，于所述的调控因子是胰岛素或胰岛素类生长因子。 图IInsulin类生长因子抑制Dmrtl泛素化稳定Dmrtl蛋白图1A. Insulin对 Dmrtl转录没有影响。但是提高了 Dmrtl蛋白水平。用新鲜分离的小鼠原代Sertoli细胞，在经过18小时以上的血清饥饿处理后，用insulin刺激细胞，运用RT-PCR的方法，我们检测了受到刺激后，Dmrtl基因的mRNA的水平，我们发现，胰岛素刺激并不能明显的提高 Dmrtl基因的mRNA水平。接着，我们检测了 Dmrtl的蛋白水平，令人吃惊的是，胰岛素的刺激明显提高了 Dmrtl的蛋白水平。这个结果把胰岛素类生长因子和Dmrtl蛋白联系在了一起，这提示我们，它们很有可能在参与性腺发育的过程中存在相关性。图IB. Insulin和 Igf-I可以通过激活细胞膜表面受体。当用Insulin或者Igf-I刺激细胞后，我们发现了这两种配体对应的受体的酪氨酸磷酸化程度都发生了明显的升高，这说明了，首先，小鼠睾丸中的Sertoli细胞(支持细胞)的细胞膜表面有Insulin Receptor(IR)和igf-lR。其次，Insulin和Igf-I能够通过是细胞膜表面的受体发生酪氨酸磷酸化而激活下游的信号通路。图1C. Insulin刺激降低了 Dmrtl蛋白的泛素化水平。原代Sertoli细胞中，转染 Flag-Dmrtl表达质粒，血清饥饿后，用IOOnm胰岛素处理细胞，未用胰岛素处理的细胞作为对照，Ih后，收集细胞总蛋白，用抗Flag抗体收集Flag-Dmrtl蛋白，然后分别用Dmrtl和 Ub抗体进行检测，结果显示，Insulin刺激迅速降低了 Dmrtl的多聚泛素化水平。图 2 =Insulin通过激活MEK/ERK途径调控Dmrtl蛋白的泛素化和蛋白水平使用新鲜分离的小鼠原代Sertoli细胞，我们首先研究了在不同信号通路抑制剂处理条件下， 细胞内源性Dmrtl蛋白的蛋白水平并同时利用信号通路的Marker蛋白检测了信号通路抑制剂的有效性。我们发现，PD98059, ffortmannin, Rapamycin都能够对相应通路的Marker 蛋白产生效应。说明三个抑制剂都是有效的。更重要的是，我们发现了 PD98059能够有效的降低Dmrtl的蛋白水平。另一方面，我们象小鼠原代Sertoli细胞中转染了 Flag-Dmrtl 蛋白的表达质粒，我们同样发现了 PD98059的抑制作用，同时确实检测到了外源转染进入细胞的Dmrtl蛋白的泛素化水平也确实受到了 PD98059的影响。这说明Insulin是通过 MEK/ERK这条信号通路降低Dmrtl蛋白的多聚泛素化水平从而稳定Dmrtl蛋白的。图3 =Dmrtl通过S_rich region和Mdm2相互作用图3A. Dmrtl和Mdm2存在相互作用。在HEK293T细胞中，我们分别转染表达Myc-Mdm2和Flag-Dmrtl蛋白的质粒，分别用抗Myc和Mdm2的抗体进行免疫共沉淀收集能够和Mdm2发生相互作用的蛋白，两种方式都检测到了 Flag-Dmrtl的存在。另一组实验中，我们在HEK293T细胞中同时转染Myc_Mdm2 和Dmrtl-GFP的表达质粒。接着用抗GFP和Dmrtl的抗体分别进行免疫共沉淀，通过这种方法，也检测到了 Myc-Mdm2蛋白的存在。图3B，3C. Dmrtl通过C端的保守区域和Mdm2结合。构建Dmrtl基因4个差异剪接转录本和GFP的融合蛋白表达质粒，分别和Myc-Mdm2质粒共转染进入HEK293T细胞中，用抗GFP抗体进行IP，IP产物用抗Myc抗体进行检测，如图，Dmrtla和d可以和Mdm2相互作用，而Dmrtlb和c不能和Mdm2发生相互作用，说明黄色区域代表的保守部分负责识别并结合Mdm2蛋白.图4 =Dmrtl抑制Mdm2对p53的泛素化降解图4A. Dmrtl和Mdm2的相互作用稳定了 p53。在HEK293T细胞中同时转染p53，Myc_Mdm2和Dmrtl_gal4表达质粒，固定前两个质粒的转染量，Dmrtl-gal4质粒的转染量逐渐增加，通过WB，可以观察到随着Dmrtl-gal4蛋白水平的上升，Mdm2和p53的蛋白相应增加，这个说明了 Dmrtl的表达使得Myc-Mdm2，p53 蛋白都得到了一定程度的稳定。图B. Dmrtl表达上调内源性的Mdm2和p53蛋白，在Sertoli 细胞的细胞系TM4中，过量表达Dmrtl，导致了蛋白的上调，GFP杂交信号显示，EGFP-Nl空载体转染后不能产生上述情况，说明了 Mdm2和p53的上调是由于Dmrtl的表达导致的。 C. Dmrtl降低了 p53的多聚泛素化水平，在Hela细胞中按照图中的方式转染Dmrtl-gal4， Myc-Mdm2,p53和HA-Ub质粒，用p53抗体进行免疫沉淀，用HA抗体检测p53的泛素化水平， 可以观察到，当共转染Dmrtl-gal4质粒时，p53的多聚泛素化水平出现了明显的降低，p53 蛋白降解受到抑制。当没有Mdm2和Dmrtl表达时，p53显示出了较低的多聚泛素化水平。 当有Mdm2表达时，p53的泛素化水平，明显上升，说明了，Mdm2通过泛素化途径降解p53。图5 :TM4细胞中，外源Dmrtl的表达通过上调p53诱导细胞凋亡。图5A.在TM4 细胞中，分别转染 Flag 空载体(10 μ g)，Flag-Dmrtl (10 μ g)或Flag-Dmrtl (30 μ g)，同时用Etoposide激活p53。我们发现，随着Dmrtl转染水平的上升，细胞凋亡的比例明显增加。图 5B.用G418(lmg/ml)筛选稳定表达Dmrtl-GFP的细胞后，我们发现了，TM4细胞由于Dmrtl 的持续表达，细胞大量凋亡，2周后基本不能得到可见的细胞克隆。但是，当细胞内源p53突变后(H1299)，Dmrtl不能诱导细胞凋亡，这说明Dmrtl依赖激活p53诱导细胞凋亡。细胞克隆用结晶紫染色。生物学实验一.主要试验材料1.抗体(1) 一抗人Dmrtl全长蛋白的兔多克隆抗体，抗小鼠Dmrtl兔多克隆抗体，抗Ubiquitin， Monoclone anti- β -actin, anti-Insulin Receptor-β MSfPanti-Igfl Receptor-β 亚基多克隆抗体，Monoclone anti-p53 (D0-1)购自Santacruz公司(美国)，抗酪氨酸磷酸化抗体(P-Tyr-101 和 P-Tyr-102)购自 CellSignaling technology 公司(美国)，抗 Flag， GFP单克隆抗体来自Sigma公司(美国)，抗Myc标签和HA标签兔多抗购自ABZoom(日本)， Phospho-PKB/AKT (Ser-473)抗体，PKB/AKT 抗体，Phospho-ERKl/2 (Thr-202/Tyr_204)抗体和ERK1/2抗体购自CellSignaling Technology公司(美国)抗Mdm2和p53兔多克隆抗体购自康为生物公司(北京)monoclone anti_Mdm2购自MBL公司(日本)，抗GATA-4多克隆抗体购自Bioworld Technology公司(美国)(2) 二抗碱性磷酸酶AP标记羊抗兔，羊抗小鼠二抗，辣根过氧化物酶HRP标记羊抗兔，羊抗小鼠二抗，cy3，cy5标记羊抗兔荧光二抗购自购自Pierce公司(美国)2.分子生物学主要试剂和来源M-MLV逆转录酶为Promega公司产品。Taq DNA聚合酶为Takara (日本)产品。质粒提取试剂盒为Omega公司、U-gene公司或博大泰克公司产品。总RNA提取试剂盒、mRNA提取试剂盒为Promega公司产品。微量总RNA提取试剂盒为Invitrogen公司产品dNTP,RNAse Inhibitor,Random Primers 为 Genscript 产品(美国)，用于反转录 RNA 成为 cDNA。5 X TBE 0. 45M Tris-硼酸，0. OlM EDTA50 X TAE :2M Tris-硼酸，0· 05M EDTA3.其他生化试剂和材料胰岛素(insulin)和胰岛素类生长因子_1 (IGF-1)购自Invitrogen公司(美国)蛋白酶体抑制剂MG132购自Calbiochem公司(美国)哺乳动物蛋白酶抑制剂(cocktail)购自申能 博采公司(上海)哺乳动物蛋白裂解液Lysis Buffer (50mM Tris-HCL, Ph7. 8/150mMNaCl/l % Triton X-100/0· 1 % SDS/0. 5 % sodium deoxycholate/10 % glycerol/5mM NaF/ImM Sodium orthovanadate and protease inhibitor)蛋白质免疫共沉淀用裂解液NP40Buffer(10mM sodium phosphate, PH7. 2/150mMNaCl/1% NP-40/5mM NaF/ImM Sodium orthovanadate andprotease inhibitor)信号通路抑制剂Wortmannin，PD98059, Rapamycin购自康成生物(上海)ECL蛋白质杂交荧光显色底物购自Pierce公司(美国)X光片，暗盒购自日本Fu j i 公司。碱性磷酸酶显色底物NBT/BCIP购自凌飞公司。4.引物DmrtlS tggcagatgaagacctcagagagDmrtlAS :cgagaacacactggctttggc用于在组织和细胞中检测Dmrtl的mRNA水平的RT-PCR引物二.主要试验步骤1.细胞的RNA提取，逆转录及RT-PCR(1)提取细胞RNA(以12孔板中培养的细胞为例)a.细胞培养至70-80%中，吸取所有的细胞培养液。12孔细胞培养皿每孔加入 500 μ 1的Trizol。室温下裂解10分钟以上。b.每2孔细胞裂解液合并加入1. 5mlEP管中，加入200 μ 1的氯仿，小心颠倒混勻 3-5次，然后振荡10秒种，在冰上放置15分钟。c. 4°C下12000rpm离心10分钟。小心吸取上清，移入另一个新的1. 5EP管中，力口入500 μ 1的异丙醇于-20°c沉淀1小时。12000rpm离心lOmin。d.去掉上清，加入Iml的冰预冷的75%的酒精洗涤一次，4°C下IOOOOrpm离心10分钟，倒去上清，真空抽干。e.加入20 μ 1的无RNA酶的去离子水彻底溶解沉淀，取1 μ 1在1 %的琼脂糖胶上电泳检测，剩余的加入0. 5 μ lRnasin，保存于_70°C的冰箱中备用 (2)利用M-MLV逆转录酶进行逆转录a. DNase 消化在RNA中加入1 μ 1无RNA酶的DNase和适量的DNase反应缓冲液，总反应体系为10 μ 1，将其在37°C温育30min，加入等体积的酸性酚/氯仿，充分震荡，12000rpm,离心 lOmin，收集上清，加入等体积异丙醇，-20°C沉淀1小时。12000rpm离心lOmin。道掉上清， 用75%乙醇洗一次，带沉淀略干后，用10μ1水溶解。b.反转录在一个无Rnase污染的0. 5ml离心管中，取5/μ 1 RNA，加入1 μ 1 (0. 5 μ g/μ 1) 随机引物OligodT，混勻后，70°C处理5min，打开RNA模板结构中的二级结构，将其迅速放入冰中防止二级结构再次形成。加入以下各成分，M-MLV反转录酶5X反应缓冲液5μ1， IOmMdNTPly l，RNasin核糖核酸酶抑制剂25U(0. 5μ 1)，M-MLV反转录酶1μ 1，最后用无RNA 酶的去离子水补足体积至25 μ 1，轻弹管壁使各成分混勻。37°C水浴1小时。反应结束后， 将离心管置冰上备用。2. PCR 扩增使用上面所示的引物，扩增条件为按以下条件扩增94°C，5分钟，然后进行 (94 0C，20秒一60 0C，20秒一72 °C，20秒)共28个循环，最后72 °C延伸5分钟。扩增结束后，取5μ 1的PCR产物于的琼脂糖凝胶上电泳检测。复性温度和延伸时间视情况而定。
3.细胞培养和转染(1)细胞培养和传代
细胞培养按照常规方法进行。以下所有操作，除非特别说明，细胞皆培养在IOOmm 直径细胞培养皿中.a.细胞生长至汇合后，吸出旧培养基，丢弃。b.用2ml 0.25%胰蛋白酶小心冲洗细胞，将剩余在培养皿内的少量培养基洗干净，防止残留的血清类物质影响消化.加入胰酶溶液是，应小心从侧壁缓慢加入，防止将细胞冲下.稍微润洗细胞后，将胰酶溶液吸出.c.加入2ml 0. 25%胰酶，将培养皿内所有细胞充分浸润.室温或培养箱内消化 3-5min.期间可观察细胞形态有否变圆或者脱落.待细胞附着松动，用手轻拍细胞培养瓶使得瓶内的少量液体能够带下已经要脱壁的细胞，直接向培养瓶中加入2ml细胞培养液以终止反应。d.用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁完全脱离形成细胞悬液。并尽量将细胞团块打散成单细胞.按1 2或者1 3的比例接种培养细胞至新的培养瓶。每个IOOmm细胞培养皿加新鲜的DMEM培养液直至终体积约为10ml。(2)脂质体转染(以24孔细胞培养皿为例)a.转染的前一天，重新传代细胞。37°C，5% C02培养过夜。b.转染前，吸走培养基，用PBS洗2遍，吸去PBS，再用不含血清，双抗的培养液洗一次，最后每孔细胞更换为Iml的不含双抗及FBS的DMEM培养液。C.对于转染用的每孔细胞，取1 μ g的质粒DNA加入到50 μ 1无胎牛血清的DMEM 培养基中，振荡混合均勻。d.取2 μ 1的脂质体LF2000TM加入到50 μ 1无FBS的DMEM培养基，振荡混合均勻，室温孵育5分钟。e.将稀释后的DNA (步骤4)和稀释后的LF2000TM (步骤5)混合，室温孵育20分钟以形成DNA-LF2000复合物。f.取DNA/LF2000复合物(约100 μ 1)直接加入到单孔细胞悬液中，轻轻前后晃动以混合液体。g. 4-6小时后，更换为新的含20% FBS的细胞培养液。h. 37°C,5% C02细胞培养箱培养约36小时。待外源质粒在细胞内充分表达，可以进行下步实验。(3)小鼠原代Sertoli细胞培养和转染a.小鼠原代Sertoli细胞培养将出生4-6d小鼠处死，在75%酒精中浸泡2 3分钟充分消毒，在超净工作台中， 取出小鼠的睾丸，剥去附睾和白膜，置于盛有PBS的培养皿中；用大体积的PBS充分洗涤组织3-4次。将组织倒出，在一干净培养皿将所有睾丸组织剪碎成Imm的小块。加1 2ml 0. 25%的胰酶，并将剪碎的组织块吸入8ml EP管中，再加入0. 2%胶原酶I 2ml，37°C振摇消化15 20min ；加入1 4ml DMEM+20% FBS培养液终止消化并反复吹打，直至仅见少量组织块；细胞悬液经200目滤网过滤至另一个8ml EP管中；ISOOrpm离心10分钟，弃上清； 加4ml PBS或培养基重悬细胞；1800rpm离心10分钟，弃上清；加4ml DMDM+20% FBS+双抗培养基重悬细胞；将上述分离的Sertoli细胞取1 2ml移入培养瓶中，并将培养基补至 5ml,37°C,5% C02 培养。b.原代Sertoli细胞的电转染用脂质体对原代Sertoli细胞进行转染的效率极低，一般不会高于10%，对原代细胞，一般采用电转染方式转染外源质粒进入原代Sertoli细胞。步骤如下在电转前36-40小时，传代primary Sertoli细胞，电转前3小时细胞换液。

0. 25%胰酶消化细胞，离心收集细胞，去掉上清。用10ml Hypoosmolar buffer重悬细胞，离心，去上清。再次用IOml Hypoosmolar buffer重悬细胞，细胞计数，定细胞密度为1 X 107/ml。在380 μ 1细胞悬液中加入20 μ g质粒(质粒溶解在水中或者issoosmolarbuffer 中)。将上述400 μ 1混合物加入电转杯中，再次混勻，应该小心注意电转杯中混合溶液不含有气泡。用下述条件电击电压 400ν电击时间40 μ s电击数 1电击后，细胞在室温下放置5分钟，小心的将细胞转移至12孔板中。36-48小时候，可进行下步工作。4.蛋白质提取(1)细胞蛋白质的提取细胞的蛋白质的提取可以分2种办法，一种是用胰酶消化细胞后.离心收集细胞， 用裂解液裂解细胞团，裂解后制样.第二种方法是用吸取细胞的培养液后，在细胞培养皿内直接用裂解液裂解细胞，收集裂解液，沉淀蛋白，重新用Pbs溶解，制样.本文主要使用第二种方法，以12孔板细胞为例，步骤如下a.吸去所有的蛋白质裂解液.b.在冰上，12孔细胞培养皿每孔加入200 μ 1裂解液，同时加入哺乳动物蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，4°C裂解30min以上.中间可以偶尔晃动细胞培养皿，让细胞充分被裂解.c.将细胞蛋白裂解液转移入一个1. 5EP管中，以蛋白裂解液.甲醇.氯仿三者为 4:4: 1的比例加入甲醇和氯仿，可见出现白色的蛋白沉淀.d.室温沉淀 20min 以上，12000rpm，离心 IOmin.e.小心去掉上清，加入Iml甲醇，12000rpm.离心IOmin.f.倒掉上清，略微晾干沉淀，此时可见EP管底部大量的白色蛋白质沉淀.g.力口入 80 μ IPBS 或者 TBS 禾口 20 μ 15 X SDS Loading Buffer,稍微混勻，用 parafilm封口，100°C煮沸蛋白样品IOmin.h.样品放冰上冷却，12000rpm，离心Imin.此时，可进行下步工作。(2)小鼠睾丸组织蛋白质提取a.处死小鼠，去处组织.称重.
b.将组织放入勻浆器中，加入Iml蛋白裂解液，同时加入哺乳动物蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂.在冰上充分勻浆20min以上.小心防止有泡沫产生.c.将蛋白裂解液转移到离心管中，在4°C下15，OOOrpm离心20min.
d.弃去沉淀，将上清移入一个新的离心管中，此时可加入5XSDSLoading Buffer 后煮沸制样。5. Western 杂交(1)从新鲜组织或细胞中提取蛋白，与适当体积的5XSDS LoadingBuffer，混合， 煮沸lOmin，离心取上清获得样品。(2)使用浓度为12%的SDS-PAGE分离蛋白.每块胶，层积胶电泳电流为10mA，进入分离胶后，电流为15mA.(3)裁剪比胶略小的PVDF膜和8张滤纸。(4)预先用甲醇浸泡PVDF 5min。将膜充分活化. (5)将PVDF膜和滤纸在1 X transfer buffer中充分浸透2 5min.每1升 IXTransfer Buffer 的配方如下Tris base, 48mM(5. 81g) ；Glycine, 39mM(2. 93g) ；SDS, 0. 0375% (w/v) (0. 375g) ；Methanol, 20% (w/v) (200ml) ；Tris base，48mM(5. 81g).(6)制备蛋白质转移三明治.4张滤纸+PVDF膜+胶+4张滤纸。(7)使用膜大小乘0. 8大小的电流进行转膜，转膜时间如下> SOkD, 1. 5-2. Oh ； 25 80kD,1. 5h ;15 40kD，45min.(8)转膜结束后，把PVDF膜在TBST中稍微漂一下.在封闭液(5%脱脂奶粉溶于 TBST,20mM Tris-HCL ρΗ7· 5，150mM NaCl，0· 1% Tween 20 中)中室温下封闭 1 小时.(9)膜与含合适浓度一抗的封闭液共同孵育，37°C，1 2h或4°C过夜。(10) TBST 洗涤三次，每次 5min。(11)膜与含合适浓度AP标记或HRP标记的二抗的封闭液共同孵育，37°C，lh。(12) TBST 洗涤三次，每次 5min。(13)用NBT/BCIP系统显色观察或用ECL显色系统压X光片观察.(14)显色结束后，膜或光片用扫描仪扫描，得到结果。6.蛋白质的免疫共沉淀(1)蛋白样品的准备，采用蛋白质IP裂解液(上海申能博彩公司)提取蛋白；(2)30ul (lug)的Protein G/Agarose加入到IOOOul的蛋白样品中，冰上缓慢摇动 3h，12，OOOrpm离心，取上清·(3)加5ul相应一抗到SOOul蛋白样品中，冰浴过夜；(4)加入 30ul (Iug)Protein G/Agarose，冰浴 3h，3000rpm 离心 5min，取沉淀；(5)按上述离心速度和时间用PBS清洗3 5次，取沉淀；(6)最后一次离心后，用80ul重悬沉淀.加入5XSDS Loading Buffer.用沸水煮沸5 lOmin，离心取上清，SDS-PAGE检测或_20°C保存备用；(7) Western杂交检测方法步骤同5。三.实验结果分析一 . Insulin通过激活MEK/ERK途径调控Dmrtl蛋白的泛素化和蛋白水平。胰岛素类生长因子insulin，igf-1能够激活细胞膜上相对应的受体，使受体发生磷酸化而激活下游的信号通路。磷酸化后的IR，IGF-IR通过MEK/ERK途径抑制了 Dmrtl的泛素化，从而稳定了 Dmrtl蛋白。胰岛素稳定Dmrtl蛋白这一过程可能参与了生长因子对雄性性别决定和分化的调控过程，这可能用来解释胰岛素受体基因家族IR，IGF-1R，IRR全部缺失的小鼠睾丸发生性别反转的现象(Nef et al.，2003)。对这些现象产生机制的研究就不可避免的要考虑到 Dmrtl基因是如何在雄性性腺发育中发挥作用的。尽管其他研究人员已经利用基因缺失的小鼠模型证实了，在Dmrtl基因完全缺失的雄性小鼠睾丸中，精原细胞不能进行正确的减数分裂和支持细胞的过渡增殖最终导致了精子缺失和小鼠的不育(Raymond etal. ,2000), 但是，Dmrtl基因在复杂的基因调控网络中是如何协同其他性腺发育相关基因调控性腺细胞的行为，并最终指导细胞进行正确的形态发生和组织形成的具体机制仍然未知。显然，对 Dmrtl调控机制的研究对于更深入的的理解基因功能并进一步解释生长因子对雄性性腺发育机制的具体调控过程显然是必须的。二 . Dmrtl参与Mdm2_p53自反馈环路调控我们发现，Dmrtl蛋白的C端部分可以和Mdm2发生相互作用，在小鼠原代Sertoli 细胞和睾丸切片中，我们观测到上述两个蛋白在相同的细胞类型中表达，在不表达Dmrtl 的长时间培养的Sertoli细胞Dmrtl的重新表达能够将Mdm2重新招募入核。形成的蛋白复合体使两个蛋白都得到了稳定，但是，一方面，降低了 Dmrtl的转录活性，另一方面，抑制了 Mdm2对其泛素化底物p53的降解，稳定了 p53，最终导致了细胞凋亡。三.Dmrtl通过和Mdm2的相互作用抑制了 p53的降解，稳定了 p53蛋白。诱导细胞凋亡作为一个重要的原癌蛋白，Mdm2最重要的作用就是降解p53.在小鼠模型中，Mdm2 的缺失通常导致小鼠在胚胎阶段死亡，而如果同时突变P53，则能够修复Mdm2突变导致的致死表型,这说明了 p53是Mdm2主要的调控底物(Freedman and Levine, 1998 ；Haupt et al. , 1997 ；Kubbutat et al. ,1998 ；Kubbutat et al. ,1999)。p53通过E3泛素连接酶Mdm2发生泛素化，进而通过26S蛋白酶体途径降解，为了证实Dmrtl是否通过抑制p53的降解，稳定从而上调p53，我们检测了当Dmrtl存在时，p53 的泛素化水平是否发生了改变，我们发现，Dmrtl蛋白确实抑制了 p53的多聚泛素化，稳定 T P53蛋白。在支持细胞细胞系TM4中，我们发现，外源瞬时表达的Dmrtl蛋白导致了内源性 P53水平上调，并最终导致了 TM4细胞凋亡。同时，利用G418筛选得到的稳定表达Dmrtl细胞系出现了显著的凋亡，当细胞内源缺乏P53时，Dmrtl不能诱导细胞凋亡。Dmrtl导致细胞凋亡的事实说明了组织特异性表达的Dmrtl基因可能是一个新的抑癌基因。本发明发现了一个在雄性生殖器官_睾丸中特异表达，并能够抑制生殖细胞肿瘤的蛋白，Dmrtl的调控新机制。本发明详细的解释了 Dmrtl作为凋亡诱导蛋白的分子机制， 该发明可以应用于人类睾丸肿瘤的诊断，也能够作为治疗生殖细胞肿瘤的新的靶点。为进一步理解人类男性生殖，治疗男性生殖疾病等疾病的基础。参考文献Freedman, D. A. , and Levine, A. J. (1998). Nuclear export is required for degradation of endogenous p53 byMDM2and human papillomavirus E6. Mol Cell Biol18,7288-7293.Haupt, Y.，Maya, R.，Kazaz, Α.，and Oren, Μ. (1997). Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 387，296-299.Krentz, A. D. ，Murphy, M. W. ，Kim, S. ，Cook, M. S. ，Capel, B. ，Zhu, R. ，Matin, Α.， SarveriA. L. ,ParkeriK. L.，Griswold，M. D.，et al. (2009). The DM domain protein DMRTl is a dose-sensitive regulator of fetal germ cellproIiferat ion and pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A 106，22323-22328.Kubbutat，M. H.，Ludwig，R丄，Ashcroft，Μ.，and Vousden，K. H. (1998). Regulation of Mdm2_directeddegradation by the C terminus of p53. Mol Cell Biol 18,5690-5698.Kubbutat, M. H. ,LudwigjR. L. , Levine, A. J.，and Vousden, K. H. (1999). Analysis of the degradation function ofMdm2. Cell Growth Differ 10,87-92.
Lu，H.，Huang，X.，Zhang，L.，Guo, Y.，Cheng，H.，and Zhou，R. (2007). Multiple alternative splicing of mouseDmrtl during gonadal differentiation.Biochem Biophys Res Commun 352，630-634.Nef, S.，Verma-Kurvari, S.，Merenmies，J.，Vassalli，J. D.，Efstratiadis，A.， Accili，D.，and Parada,L. F. (2003).Testis determination requires insulin receptor family function in mice. Nature 426，291—295.Raymond, C. S.，Murph y, Μ. W. , 0 ! Sullivan, M. G.，Bardwel 1, V. J.，and Zarkower, D. (2000). Dmrtl, a generelated to worm and fly sexual regulators，is required for mammalian testis differentiation. Genes Dev 14，2587—2595.Turnbul 1, C.，Rap ley, E. A.，Seal，S.，Pernet，D.，Renwick，A.，Hughes，D.， Ricketts，M.，Linger，R.，Nsengimana，J.，Deloukas，P.，et al. (2010). Variants near DMRTIjTERT and ATF7IP are associated with testicular germ cellcancer. Nat Genet 42,604-607.


本发明公开了一种治疗与p53基因相关疾病的方法，在人及小鼠睾丸中凋亡诱导蛋白Dmrt1的调控途径，该蛋白受到胰岛素类生长因子的正调控，并能够通过结合原癌蛋白Mdm2激活p53，诱导细胞凋亡。