专利名称：多靶位干扰rna分子及其应用的制作方法RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-strand RNA, dsRNA) 引发其同源信使RNA (messenger RNA，mRNA)酶解的一种转录后基因沉默形式(Nature. 1998，391: 806-811)。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20 25bp (base pair，碱基对)，且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)。siRNA的一条链掺入到RNA-诱导的沉默复合物中(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补RNA的序列配对。RISC首先介导siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。 现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，目前国际上已有十余种siRNA药物进入临床阶段。其中有应用siRNA治疗老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、呼吸道合胞病毒病、实体肿瘤、肝癌、以及急性肾损伤等疾病。RNAi效应的dsRNA可设计成能被Dicer剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是不需Dicer剪切可直接作为RISC底物的短siRNA形式。在哺乳动物细胞中，由于长 dsRNA容易引发非特异性的干扰素效应。因此，普遍认为应用于哺乳动物时，干扰RNA双链必须短于30 bp。但是，设计长双链干扰RNA用于RNAi仍有实用价值，长干扰RNA双链可带有多个治疗靶标，靶向多个不同靶基因的mRNA或同一靶基因的mRNA的不同位点，增加基因沉默效果，扩大应用范围。疾病的发生、发展往往是多种基因共同参与的复杂生物学过程， 受到多种因素的影响，在疾病的治疗中，单一基因的抑制不可能完全抑制或逆转疾病的发生和发展，单靶标治疗有其局限性。那么，研发多靶标、无干扰素反应的长干扰核酸双链，同时抑制多个疾病基因的表达，多层次、多途径治疗疾病，能有效提高治疗效果，可以作为治疗疾病的新途径。
本发明的目的在于提供一种干扰RNA分子及其应用，尤其是多靶位干扰RNA分子及其应用。该干扰RNA分子的反义链靶向不同靶基因的RNA或同一个靶基因RNA的不同位点，该RNA可以是mRNA、微小RNA (microRNA, miRNA)或是mRNA或miRNA的子序列，并且该干扰RNA分子不引起体内的干扰素反应。为了达到上述目的，本发明公开了一种多靶位干扰RNA分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成双链，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA的不同位点，所述的双链中存在至少一个不互补的环状核苷酸结构，该RNA分子进入细胞后不会引起干扰素效应。优选地，所述的不互补的环状核苷酸结构至少包含3个核苷酸。优选地，所述的双链中含有至少一个糖环修饰或骨架修饰的核糖核苷酸。通常，干扰RNA分子由一条反义链和一条正义链组成，分子的总长度至少为30个核苷酸，且该RNA分子的双链上存在至少一个不互补的环状核苷酸结构，应用这种具有二级结构的、由正义链和反义链构成的长干扰RNA没有激发哺乳动物细胞的干扰素反应。本发明还公开了上述多靶位干扰RNA分子在制备调节细胞中至少一种基因功能的药物中的应用，所述的基因是一种疾病相关基因，包括病原体相关基因如病毒基因，以及非传染性疾病相关基因如肿瘤相关基因等。所述的肿瘤为肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤、鼻咽癌和口腔癌中的至少一种。本发明有望在抑制、缓解或减轻病情或防止某些疾病症状的复发方面取得更显著的效果。本发明与现有技术相比，该RNA分子能够同时抑制多个靶基因的表达，或者靶向一个靶基因的多个位点。此外，并未引起干扰素效应，可应用于哺乳动物细胞。本发明公开的RNA分子是一种新的siRNA的应用形式，在对疾病的基因治疗方面有广泛的应用前景。图1是RNA分子Mid-Cir结构示意图。该分子正义链的5’端和3’端分别与反义链的3’端和5’端互补，在双链中存在一个不互补的环状核苷酸结构。图中，1为正义链，2 为反义链，3为不互补的环状核苷酸结构。图2是SMMC-7721肝癌细胞中Survivin基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中， 纵坐标表示Survivin基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。图3是SMMC-7721肝癌细胞中Bcl_2基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示Bcl-2基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。图4是SMMC-7721肝癌细胞中干扰素相关基因OASl基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示OASl基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。图5是SMMC-7721肝癌细胞的生长曲线图。图中，纵坐标表示紫外吸光值(0D值)， 横坐标表示不同RNA分子作用细胞的不同时间。图6是不同RNA分子对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制率柱形图。图中，纵坐标表示细胞生长抑制率，横坐标表示不同实验组。图7是!fepG2肝癌细胞的生长曲线图。图中，纵坐标表示紫外吸光值(0D值)，横坐标表示不同RNA分子作用细胞的不同时间。图8是不同RNA分子对肝癌细胞H印G2的生长抑制率柱形图。图中，纵坐标表示细胞生长抑制率，横坐标表示不同实验组。设计靶向Survivin和Bcl_2基因的干扰RNA分子Mid-Cir
细胞凋亡抑制基因Survivin和Bcl_2，在恶性肿瘤细胞中广泛高表达。研究发现，通过抑制肿瘤细胞中过表达的Survivin或Bcl-2基因，可以抑制肿瘤细胞的生长。用靶向性的siRNA抑制Survivin或Bcl-2基因的表达可以用来治疗肿瘤。 设计干扰RNA分子Mid-Cir，其包含一条正义链和一条反义链，反义链的3’端部分靶向到Survivin基因的mRNA，5’端部分靶向到Bcl_2基因的mRNA，结构如图1所示。序列SEQ ID NO: 1是干扰RNA分子Mid-Cir的正义链序列。正义链5，-GACUUGGCCCAGUGUUUCUUCAGGAUGACUGAGUACCUGAA-3， (SEQ ID NO: 1)
序列SEQ ID NO: 2是与SEQ ID NO: 1互补且存在不互补环状核苷酸结构的RNA分子 Mid-Cir的反义链序列。反义链5，-UUCAGGUACUCA⑶CAUCCGAGAGAAACACUGGGCCAA⑶C-3， (SEQ ID N0: 2)
用于对比实验的siRNA :l)Sur-2是靶向Survivin基因的siRNA，其正义链序列是序列 (SEQ ID NO: 1)中5，端开始的1 19个核苷酸，反义链是序列(SEQ ID N0: 2)中3，端开始的1 19个核苷酸。2)Bcl-l是靶向Bcl-2基因的siRNA，其正义链序列是序列(SEQ ID NO: 1)中3，端开始的1 19个核苷酸，反义链是序列(SEQ ID NO: 2)中5，端开始的 1 19个核苷酸。实施例2
实时定量PCR检测干扰RNA分子Mid-Cir对Survivin靶基因的沉默效果细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IXlO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。实时定量PCR检测Survivin基因mRNA表达用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA Kit (QIAGEN公司)提取纯化细胞mRNA，操作按试剂盒说明书进行，用 80 μ L无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。检测Survivin基因的实时定量PCR引物
5，正向引物ACCGCATCTCTACATTCAAG (SEQ ID NO: 3) 3，反向引物CAAGTCTGGCTCGTTCTC(SEQ ID NO: 4)
用上述Survivin基因特异性引物检测样本中Survivin基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下反应体系4 μ L模板RNA， 12. 5 μ L 2XSensiMix One-St 印(Quantance 公司)，1 yL 5，正向引物(10 μΜ)，1 μ L 3，反向引物(10 μΜ),0. 5 yL 50XSYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ L。反应条件42°C反转录 30 min，95°C预变性 7 min，95°C变性 20 sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸30 sec，循环45次。用2_δ Δα分析法分析实验结果，并作柱状图，如图2所示，干扰RNA分子Mid-Cir 显示对肝癌细胞中Survivin基因较好的沉默效果，与相应的Sur_2实验组和共转染实验组 Sur-2+Bcl-l相比，其抑制效率无明显差异。实施例3
实时定量PCR检测干扰RNA分子Mid-Cir对Bcl_2靶基因的沉默效果细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。实时定量PCR检测Bcl-2基因mRNA表达用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA Kit (QIAGEN公司)提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μ L无RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。检测Bcl-2基因的实时定量PCR引物
5’ 正向引物GGCTGGGATGCCTTTGTG(SEQ ID NO: 5)
3，反向引物GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG (SEQ ID NO: 6)
用上述Bcl-2基因特异性引物检测样本中Bcl-2基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系4 μ L模板 RNA, 12. 5 μ L 2X SensiMix One-Step, 1 μ L 5，正向引物(10 μΜ)，1 μ L 3，反向引物 (10 μΜ),0. 5 μ L 50 X SYBR Green I，用无 RNase 水补足体系至 25 μ L。反应条件42°C 反转录 30 min，95°C预变性 7 min，95°C变性 20 sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 30 sec，循环45次。
用2_δ 分析法分析实验结果，并作柱状图，如图3所示，干扰RNA分子Mid-Cir 显示对肝癌细胞中Bcl-2基因较好的沉默效果，与相应的Bcl-I实验组和共转染实验组 Sur-2+Bcl-l相比，其抑制效率无明显差异。实施例4 检测干扰素反应
细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IXlO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。实时定量PCR检测干扰素相关基因OASl的mRNA表达用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA Kit (QIAGEN公司)提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用 80 μ L无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。检测干扰素相关基因OASl的实时定量PCR引物
5，正向引物GTGAGCTCCTGGATTCTGCT(SEQ ID NO: 7)
3，反向引物TGTTCCAATGTAACCATATTTCTGA (SEQ ID NO: 8) 用上述OASl基因特异性引物检测样本中OASl基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系4 μ L模板RNA， 12. 5 μ L 2 X SensiMix One-Step, 1 μ L 5，正向引物(10 μΜ)，1 μ L 3，反向引物(10 μΜ),0. 5 μ L 50 X SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ L0反应条件42°C反转录 30 min，95°C预变性 7 min，95°C变性 20 sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 30 sec，循环 45次。用2_ΔΔ"分析法分析实验结果，并作柱状图，如图4所示。实验中，用上述转染方法按5 ng/孔同时转染Poly (I:C)作为阳性对照。聚肌胞(Poly (I:C))是一种类似于感染性病毒的核糖核酸的合成化学物质，可以刺激细胞的免疫系统产生干扰素。与正常组相比，阳性对照组OASl基因的mRNA有明显的升高，其它不同RNA分子转染实验组OASl基因没有高表达，该结果表明干扰RNA分子Mid-Cir未引起干扰素反应。实施例5
CCK-8法检测干扰RNA分子Mid-Cir对肝癌细胞SMMC-7721的抑制率细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。CCK-8测定每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液(同仁化学)。在细胞培养箱内继续孵育0.5 4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。根据所测得的~5(|值(( 值)，作生长曲线图，如图5所示。根据公式细胞增殖抑制率=(1 一实验组平均A45tl值/对照组平均A45tl值)父100%，计算细胞生长抑制率，并作柱状图，如图6所示。结果表明干扰RNA分子Mid-Cir在作用肝癌细胞48 h、72 h、96 h后有
8显著的抑制效果，与其它实验组相比无明显差异。实施例6
CCK-8法检测干扰RNA分子Mid-Cir对肝癌细胞!fepG2的抑制率细胞培养肝癌细胞H印G2在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IXlO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。CCK-8测定每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液(同仁化学)。在细胞培养箱内继续孵育0.5 4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。根据所测得的~5(|值(( 值)，作生长曲线图，如图7所示。根据公式细胞增殖抑制率=(1 一实验组平均A45tl值/对照组平均A45tl值)X 100%,计算细胞生长抑制率，并作柱状图，如图8所示。结果表明干扰RNA分子Mid-Cir在作用肝癌细胞48 h、72 h、96 h后有显著的抑制效果，与其它实验组相比无明显差异。


本发明涉及一种RNA分子及其应用，尤其是指一种多靶位干扰RNA分子及其应用。所述的多靶位干扰RNA分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成双链，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA的不同位点，该RNA分子进入细胞后不会引起干扰素效应。该RNA分子能干扰转录后翻译过程，从而抑制或阻断基因的表达，且该干扰RNA分子不会引发体内的干扰素反应。所述的RNA分子是制备调节细胞中一种或多种基因功能的药物中的活性成份。