专利名称:氯喹和阿霉素共载脂质体及其制备方法近50年来,癌症的防治已经有重大的进展,但是由于癌症早期诊断困难,以及缺 少治疗癌症转移的有效技术方案,治愈癌症仍然是一个难题,因此,寻找癌症治疗的新方法 显得非常重要和迫切。阿霉素是癌症化疗常用的药物(Multidrug resistance in cancer :role of ATP-dependent transporter),上世纪60年代初由米兰Faroitalia研究实验室首次从一 种链霉菌中分离而得,是继柔红霉素后被发现的第二个蒽环霉素类抗生素。阿霉素和柔红 霉素的结构基本相同,差异只在一个羟基上,但柔红霉素只对急性白血病有效,而阿霉素具 有广谱抗恶性肿瘤的治疗效果。自1974年阿霉素在美国获准临床使用以来,在过去的30 年中己报道2000种以上的阿霉素类似物经历抗肿瘤作用的试验性筛选。但是,阿霉素等药 物的大量使用容易使细胞产生耐药性,这是当下临床上成功地治疗癌症的一大障碍,为解 决这些问题,目前主要尝试采用以下方法来逆转多药耐药性(MDR) :1)MDR逆转剂;2)化疗 药物的化学修饰;幻联用化疗敏感药物;4)运用纳米粒载体及后两者相结合。一直以来氯喹(CQ)是作为一种安全、有效且价廉的预防和治疗疟原虫感染的药 物使用,也常常用于基因转染实验中,以提高转染效率。已有国外文献报道,CQ可作为多 药耐药蛋白I(MRPl)的抑制剂,与阿霉素联用,可降低细胞的多药耐药性,从而达到较好的 抑癌效果(Reversal of MRP-Mediated Doxorubicin Resistance with Quinoline-Based Drugs)。多药耐药蛋白I(MRPl)属于ATP结合盒(ABC)的转运家庭,它能够广泛性 地将胞内的抗癌药物泵出细胞外,从而大大削弱药物的抗癌作用,使细胞产生耐药 (Pharmacogenomics of ABC transporters and its role in cancer chemotherapy)0 但 早期研究已表明注射使用氯喹溶液毒性很大,甚至危及生命,还有阿霉素也具有较大的心 脏毒性及对正常细胞的毒性作用,降低剂量又很难达到预期效果,氯喹与阿霉素联用也存 在上述问题,迫切需要解决。在过去的20年里,控制药物释放和肿瘤靶向的药物运载系统作为一种有吸引力 的治疗细胞毒素的治疗窗口出现了。在运用的载体中,有纳米粒、白蛋白微球以及脂质体。 脂质体作为一种化疗药物载体最近在牛身上被重新探讨,以此开始了脂质体在控制药物分 散方面的使用,用来改进抗癌效率和减少对正常细胞的毒性。药物用脂质体包裹后,能靶向 作用于病变部位,从而提高药物的治疗指数,同时还可以减少药物的治疗剂量,降低全身不 良反应,提高用药安全性。目前,已批准临床使用或正在进行临床评价的阿霉素制剂主要是 脂质体制剂,如用于再发性乳腺癌的联合治疗的产品名为Mycet的阿霉素脂质体,虽然一 定程度上降低了阿霉素对心脏毒性及对正常细胞的毒性,但是仍存在着容易使细胞产生耐 药性以致抗癌效果不佳的问题。
本发明提供了一种载体选择面广、药物包封率高的氯喹和阿霉素共载脂质体,利 用氯喹和阿霉素的协同作用,克服了由MRPl介导的多药耐药性并降低了阿霉素和氯喹以 游离形式使用时不可忽视的毒性。本发明还提供了一种氯喹和阿霉素共载脂质体的制备方法,采用pH梯度法将氯 喹和阿霉素两者同时装载入脂质体制得氯喹和阿霉素共载脂质体,制备工艺简单,控制的 参数较少,反应条件较低,有利于降低生产成本,易于工业化生产。一种氯喹和阿霉素共载脂质体,由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和 PH值调节剂制成;其中,药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1 2 100 1 35;所述的药物为氯喹类药物和阿霉素类药物。优选的,所述的药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1 10 40 2. 5 10 ;进一步优选为1 25 5。所述的氯喹类药物和阿霉素类药物为主要的药效成分,氯喹类药物和阿霉素类药 物的比例可以根据实际需要任意调整,氯喹类药物和阿霉素类药物的质量比可以是1 100 1 100,优选为1 2 1 5。所述的氯喹类药物包括氯喹、氯喹与酸所成的盐中一种或多种;所述的氯喹与酸 所成的盐可选用磷酸氯喹、盐酸氯喹、硫酸氯喹中一种或多种。所述的阿霉素类药物包括阿霉素、阿霉素与酸所成的盐中一种或多种;所述的阿 霉素与酸所成的盐可选用盐酸阿霉素。所述的磷脂可选用天然磷脂、合成磷脂中的一种或两种;所述的天然磷脂为大豆 磷脂、卵磷脂中的一种或两种;所述的合成磷脂为中性磷脂、负电性磷脂或聚乙二醇修饰 磷脂中的至少一种,合成磷脂具体为二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、 磷脂酰丝氨酸(PS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)中的至少一种。所述的胆固醇类化合物为普通胆固醇、聚乙二醇(PEG)修饰胆固醇中的一种或者 两种,所述的聚乙二醇(PEG)修饰胆固醇如聚乙二醇单甲醚胆固醇琥珀酸酯(CHS-PEG)。所述的内部缓冲系统可选用柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统或碳酸盐缓冲系 统;所述的柠檬酸盐缓冲系统优选为0. 05mol/L 0. 5mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。 所述的内部缓冲系统主要是用于乳化磷脂和胆固醇得到脂质体,其用量并没有严格的限 制,一般每1重量份的药物中添加5mL 15mL。所述的pH值调节剂为碱液,可选用氢氧化钠水溶液、磷酸氢二钠水溶液、碳酸钠 水溶液、碳酸氢钠水溶液等中的一种或多种,碱液的浓度一般为0. 05mol/L 0. 5mol/L,以 方便调节PH值。所述的pH值调节剂用于调节氯喹和阿霉素共载脂质体的pH值在5. 5 8. 0,pH值太小则磷脂双份子层内外形成不了浓度差,药物进不了脂质体内部,pH过大则会 产生脂质体破裂等问题,优选调节PH值为7。所述的氯喹和阿霉素共载脂质体的制备方法,包括以下步骤1)将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中,再加入内部缓冲系统,混合均勻,除 去有机溶剂,得到空白脂质体悬液;或者,将磷脂和胆固醇类化合物溶于有机溶剂中,混合均勻,除去有机溶剂,再加 入内部缓冲系统混合均勻,得到空白脂质体悬液;2)将氯喹和阿霉素溶解在步骤1)制备的空白脂质体悬液中,用PH值调节剂调节 pH至5. 5 8. 0,在30°C 50°C水浴孵育IOmin 60min,分离出游离药物,得到氯喹和阿 霉素共载脂质体。步骤1)中,所述的有机溶剂选用乙醚或者氯仿(三氯甲烷)。步骤1)中,除去有机溶剂后或者除去有机溶剂再加入内部缓冲系统后,可通过高 压勻乳、超声或微射流进行粉碎,得到粒径低于200nm的空白脂质体悬液。步骤2~)中,分离出游离药物的方法可采用kphadex G_50凝胶柱层析法或透析法。所述的氯喹和阿霉素共载脂质体可作为抗癌药物治疗癌症等疾病,对肿瘤细胞具 有较高的杀伤力。本发明采用动态光散射粒径仪(Malvern Zetasizer NanO-S90,英国)检测粒径。本发明具有如下优点(1)磷脂选择面广,可使用天然卵磷脂或大豆磷脂,也可使用合成的中性磷脂或负 电性磷脂;(2)通过本发明方法制得的氯喹和阿霉素共载脂质体药物包封率可达到90%以 上,粒径可低于200nm,具有包封率高、稳定性好、成本低等优点;(3)本发明方法制得的氯 喹和阿霉素共载脂质体,能够有效抑制由MRPl介导的多药耐药性,对因MRPl高表达而产生 耐药性的细胞具有耐药逆转作用,逆转倍数达10倍左右,是阿霉素脂质体的3倍左右;(4) 在氯喹的毒性范围内(<20 μ g/ml),氯喹和阿霉素共载脂质体随着氯喹的量的增多,IC5tl 降低;( 氯喹和阿霉素共载脂质体使氯喹和阿霉素协同作用,从而提高了对肿瘤细胞的 杀伤力,并且氯喹和阿霉素的协同作用相对可以减少药物的使用量,减小了毒副作用;(6) 利用阿霉素和氯喹的PKa值相近,都在4. 0左右,采用独特的两步pH梯度法将两者同时装 载入脂质体,制备氯喹和阿霉素共载脂质体,制备方法操作简便,可控性和重现性好。将作为对照组1的游离盐酸阿霉素水溶液(FDOX)和作为对照组2游离磷酸氯喹 水溶液(FCQ)、对比例制备的脂质体、实施例制备的各种氯喹和阿霉素不同比例的脂质体分 别用于细胞实验,采用MTT(噻唑蓝)比色法进行实验,步骤如下对数生长期的的癌细胞用胰蛋白酶消化、PBS缓冲液(即含0. 05%吐温-20的 PH7.4的磷酸盐缓冲液)洗涤、离心后将其制备成浓度为lX105/ml的细胞悬液,将该悬 液按100 μ 1/孔均勻加入96孔细胞培养板中,每孔细胞数为5000 10000个。将细胞板 置于37°C孵箱中,孵育Mh,显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将载药胶束及阿 霉素溶于生理盐水中,所有溶液以其中阿霉素的含量为基准,稀释成不同浓度,折算成阿霉 素浓度分别为 0. 5 μ g/ml,1 μ g/ml,2 μ g/ml,5 μ g/ml,10 μ g/ml,100 μ g/ml,500 μ g/ml。 向上述96孔细胞培养板中加入不同浓度的聚合物溶液25 μ 1/孔,培养24h后,每孔加入 31. 5 μ 1浓度为5mg/ml噻唑蓝(MTT)溶液,继续培养4h,吸出上清液,加入200 μ 1 二甲基 亚砜(DMSO),然后放置于(X)2培养箱15分钟。用酶标仪检测各孔570nm处的OD值,记录结 果。上述实验,每组重复3次,每个浓度设4个复孔。IC50即50%抑制浓度,是抑制半数癌细胞生长时的药物浓度,IC5tl值越低,说明细 胞毒性作用越大。试验中IC5tl值由IC5tl. exe软件计算得到。并且实验结果显示,同一氯喹 和阿霉素比例,不同种类的磷脂对于IC5tl几乎没有影响。对照组1、对照组2,对比例1、对比例2及实施例8、9、10、11和13制备的脂质体对 药物敏感细胞株MCF-7 (人乳腺癌细胞)和耐药细胞株MCF-7/ADR的IC5tl ( μ g/ml)值,如表 1所示;对照组1、对照组2,对比例1、对比例2及实施例8、9、10、11和13制备的脂质体对 药物敏感细胞株HL60 (急性白血病细胞)和耐药细胞株HL60/ADR IC50 (μ g/ml)值,如表2 所示。表 本发明公开了一种氯喹和阿霉素共载脂质体,由药物、磷脂、胆固醇类化合物、内部缓冲系统和pH值调节剂制成;其中,药物、磷脂和胆固醇类化合物的重量比为1∶2~100∶1~35;所述的药物为氯喹类药物和阿霉素类药物。利用氯喹和阿霉素的协同作用,使氯喹和阿霉素共载脂质体具有抑制多药耐药性和降低用药毒性的特点。本发明还公开了一种氯喹和阿霉素共载脂质体的制备方法,制备工艺简单,控制的参数较少,反应条件较低,有利于降低生产成本,易于工业化生产。
氯喹和阿霉素共载脂质体及其制备方法
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